Mitotic regulation by Polo-like kinase 1 and the Chromosomal Passenger Complex

During mitosis, the duplicated genome must be accurately divided between two daughter cells. Polo-like kinase 1 (Plk1) and Aurora B kinase, together with its binding partners Incenp, Survivin and Borealin (chromosomal passenger complex, CPC), have key roles in coordinating mitotic events. The accuracy of cell division is safeguarded by a signaling cascade termed the mitotic spindle checkpoint (SC), which ensures that chromosomes are not physically separated before correct bipolar attachments have been formed between kinetochores and spindle microtubules (MT). An inhibitory “wait anaphase” signal, which delays chromosome separation (anaphase onset), is created at individual kinetochores and broadcasted throughout the cell in response to lack of kinetochore-microtubule (kMT) attachment or proper interkinetochore tension. It is believed that the fast turnover of SC molecules at kinetochores contributes to the cell’s ability to produce this signal and enables rapid responses to changing cellular conditions. Kinetochores that lack MT attachment and tension express a certain phosphoepitope called the 3F3/2 phosphoepitope, which has been linked to SC signaling. In the experimental part, we investigated the regulation of the 3F3/2 phosphoepitope, analyzed whether CPC molecules turn over at centromeres, and dissected the mitotic roles of the CPC using a microinjection technique that allowed precise temporal control over its function. We found that the kinetochore 3F3/2 phosphoepitope is created by Plk1, and that CPC proteins exhibit constant exchange at centromeres. Moreover, we found that CPC function is necessary in the regulation of chromatid movements and spindle morphology in anaphase. In summary, we identified new functions of key mitotic regulators Plk1 and CPC, and provided insighs into the coordination of mitotic events.

Dynamic interplay between the intermediate filament protein nestin and Cyclin-dependent kinase 5

Cellen har ett s.k. cytoskelett som bl.a. ger stadga åt cellen och deltar i dess form- och rörelsefunktioner. Intermediärfilamenten är en viktig del av cytoskelettet och de har länge varit kända för sina väsentliga roller i att upprätthålla den cellulära organisationen och vävnadernas integritet. På senare år har man insett att intermediärfilamenten har en större funktionell mångsidighet än man tidigare tänkts sig, i och med att en rad olika studier har visat betydelsen av intermediärfilamenten vid olika signaleringprocesser. Dessa proteinnätverk samverkar nämligen med kinaser och andra viktiga signalfaktorer och deltar därmed i cellens signaleringmaskineri. Intermediärfilamentproteinet nestin används ofta som en markör för stamceller men dess fysiologiska funktioner är i stort sett okända. Interaktion mellan nestin och ett signalkomplex bestående av cyklin-beroende kinas 5 (eng. Cyclin-dependent kinase, Cdk5) och dess aktivatorprotein p35 upptäcktes i vårt laboratorium före denna avhandling påbörjades. Därför var syftet med min avhandling att undersöka den funktionella betydelsen av nestin i regleringen av Cdk5/p35 komplexet. Cdk5 är ett multifunktionellt kinas som reglerar både utvecklingen och stressreaktioner i nerver och muskler. Vi visade att nestin skyddar neuronala stamceller under oxidativ stress genom dess förmåga att hämma Cdk5s skadliga aktivitet. Genom att förankra Cdk5/p35 komplexet, reglerar nestin den subcellulära lokaliseringen av Cdk5/p35 och minskar klyvningen av p35 till den mer stabila aktivatorn p25. Vi demonstrerade också aktiveringsmekanismen för Cdk5 under differentiering av muskelceller. Proteinkinas C zeta (PKCzeta) avslöjades ha en förmåga att accelera klyvningen av p35 till p25, och därmed öka aktiviteten hos Cdk5. Nestin kunde genom sin förmåga att reglera Cdk5 signalkomplexet styra muskelcellernas differentiering. Denna doktorsavhandling har på ett avgörande vis ökat förståelsen av de reglerande mekanismer som styr Cdk5 aktivering. Avhandling presenterar nestin och PKCzeta som kritiska faktorer i denna reglering. Vidare innehåller avhandlingen ny information om de cellulära funktionerna hos nestin som vi har visat vara en viktig reglerare av cellernas överlevnad och differentiering.

Cellular responses to stress and kinase signaling activation : apoptosis and differentiation

Stressignaler avkänns många gånger av membranbundna proteiner som översätter signalerna till kemisk modifiering av molekyler, ofta proteinkinaser Dessa kinaser överför de avkodade budskapen till specifika transkriptionsfaktorer genom en kaskad av sekventiella fosforyleringshändelser, transkriptionsfaktorerna aktiverar i sin tur de gener som behövs för att reagera på stressen. En av de mest kända måltavlorna för stressignaler är transkriptionsfaktor AP-1 familjemedlemen c-Jun. I denna studie har jag identifierat den nukleolära proteinet AATF som en ny regulator av c-Jun-medierad transkriptionsaktivitet. Jag visar att stresstimuli inducerar omlokalisering av AATF vilket i sin tur leder till aktivering av c-Jun. Den AATF-medierad ökningen av c-Jun-aktiviteten leder till en betydande ökning av programmerad celldöd. Parallellt har jag vidarekarakteriserat Cdk5/p35 signaleringskomplexet som tidigare har identifierats i vårt laboratorium som en viktig faktor för myoblastdifferentiering. Jag identifierade den atypiska PKCξ som en uppströms regulator av Cdk5/p35-komplexet och visar att klyvning och aktivering av Cdk5 regulatorn p35 är av fysiologisk betydelse för differentieringsprocessen och beroende av PKCξ aktivitet. Jag visar att vid induktion av differentiering fosforylerar PKCξ p35 vilket leder till calpain-medierad klyvning av p35 och därmed ökning av Cdk5-aktiviteten. Denna avhandling ökar förståelsen för de regulatoriska mekanismer som styr c-Jun-transkriptionsaktiviteten och c-Jun beroende apoptos genom att identifiera AATF som en viktig faktor. Dessutom ger detta arbete nya insikter om funktionen av Cdk5/p35-komplexet under myoblastdifferentiering och identifierar PKCξ som en uppströms regulator av Cdk5 aktivitet och myoblast differentiering.

Probing MST1 Kinase Sequence and Structure for Rational Drug Discovery (Targeting diabetes by blocking protein-protein interactions)

Apoptotic beta cell death is an underlying cause majorly for type I and to a lesser extent for type II diabetes. Recently, MST1 kinase was identified as a key apoptotic agent in diabetic condition. In this study, I have examined MST1 and closely related kinases namely, MST2, MST3 and MST4, aiming to tackle diabetes by exploring ways to selectively block MST1 kinase activity. The first investigation was directed towards evaluating possibilities of selectively blocking the ATP binding site of MST1 kinase that is essential for the activity of the enzymes. Structure and sequence analyses of this site however revealed a near absolute conservation between the MSTs and very few changes with other kinases. The observed residue variations also displayed similar physicochemical properties making it hard for selective inhibition of the enzyme. Second, possibilities for allosteric inhibition of the enzyme were evaluated. Analysis of the recognized allosteric site also posed the same problem as the MSTs shared almost all of the same residues. The third analysis was made on the SARAH domain, which is required for the dimerization and activation of MST1 and MST2 kinases. MST3 and MST4 lack this domain, hence selectivity against these two kinases can be achieved. Other proteins with SARAH domains such as the RASSF proteins were also examined. Their interaction with the MST1 SARAH domain were evaluated to mimic their binding pattern and design a peptide inhibitor that interferes with MST1 SARAH dimerization. In molecular simulations the RASSF5 SARAH domain was shown to strongly interact with the MST1 SARAH domain and possibly preventing MST1 SARAH dimerization. Based on this, the peptidic inhibitor was suggested to be based on the sequence of RASSF5 SARAH domain. Since the MST2 kinase also interacts with RASSF5 SARAH domain, absolute selectivity might not be achieved.