Metal-Ion-Binding Oligonucleotides: High-Affinity Probes for Nucleic Acid Sequences

Small non-coding RNAs have numerous biological functions in cell and are divided into different classes such as: microRNA, snoRNA, snRNA and siRNA. MicroRNA (miRNA) is the most studied non-coding RNA to date and is found in plants, animals and some viruses. miRNA with short sequences is involved in suppressing translation of target genes by binding to their mRNA post-transcriptionally and silencing it. Their function besides silencing of the viral gene, can be oncogenic and therefore the cause of cancer. Hence, their roles are highlighted in human diseases, which increases the interest in using them as biomarkers and drug targets. One of the major problems to overcome is recognition of miRNA. Owing to a stable hairpin structure, chain invasion by conventional Watson-Crick base-pairing is difficult. One way to enhance the hybridization is exploitation of metal-ion mediated base-pairing, i. e. oligonucleotide probes that tightly bind a metal ions and are able to form a coordinative bonds between modified and natural nucleobases. This kind of metallo basepairs containing short modified oligonucleotides can also be useful for recognition of other RNA sequences containing hairpin-like structural motives, such as the TAR sequence of HIV. In addition, metal-ion-binding oligonucleotides will undoubtedly find applications in DNA-based nanotechnology. In this study, the 3,5-dimethylpyrazol-1-yl substituted purine derivatives were successfully incorporated within oligonucleotides, into either a terminal or non-terminal position. Among all of the modified oligonucleotides studied, a 2-(3,5-dimethylpyrazol-1-yl)-6-oxopurine base containing oligonucleotide was observed to bind most efficiently to their unmodified complementary sequences in the presence of both Cu2+ or Zn2+. The oligonucleotide incorporating 2,6-bis(3,5-dimethylpyrazol-1-yl)purine base also markedly increased the stability of duplexes in the presence of Cu2+ without losing the selectivity.

Chromatoid body mediated RNA regulation in mouse male germline

Male germ cell differentiation, spermatogenesis is an exceptional developmental process that produces a massive amount of genetically unique spermatozoa. The complexity of this process along with the technical limitations in the germline research has left many aspects of spermatogenesis poorly understood. Post-meiotic haploid round spermatids possess the most complex transcriptomes of the whole body. Correspondingly, efficient and accurate control mechanisms are necessary to deal with the huge diversity of transcribed RNAs in these cells. The high transcriptional activity in round spermatids is accompanied by the presence of an uncommonly large cytoplasmic ribonucleoprotein granule, called the chromatoid body (CB) that is conjectured to participate in the RNA post-transcriptional regulation. However, very little is known about the possible mechanisms of the CB function. The development of a procedure to isolate CBs from mouse testes was this study’s objective. Anti-MVH immunoprecipitation of cross-linked CBs from a fractionated testicular cell lysate was optimized to yield considerable quantities of pure and intact CBs from mice testes. This protocol produced reliable and reproducible data from the subsequent analysis of CB’s protein and RNA components. We found that the majority of the CB’s proteome consists of RNA-binding proteins that associate functionally with different pathways. We also demonstrated notable localization patterns of one of the CB transient components, SAM68 and showed that its ablation does not change the general composition or structure of the CB. CB-associated RNA analysis revealed a strong accumulation of PIWI-interacting RNAs (piRNAs), mRNAs and long non-coding RNAs (lncRNAs) in the CB. When the CB transcriptome and proteome analysis results were combined, the most pronounced molecular functions in the CB were related to piRNA pathway, RNA post-transcriptional processing and CB structural scaffolding. In addition, we demonstrated that the CB is a target for the main RNA flux from the nucleus throughout all steps of round spermatid development. Moreover, we provided preliminary evidence that those isolated CBs slice target RNAs in vitro in an ATPdependent manner. Altogether, these results make a strong suggestion that the CB functions involve RNA-related and RNA-mediated mechanisms. All the existing data supports the hypothesis that the CB coordinates the highly complex haploid transcriptome during the preparation of the male gametes for fertilization. Thereby, this study provides a fundamental basis for the future functional analyses of ribonucleoprotein granules and offers also important insights into the mechanisms governing male fertility.

Fluorescence-based imaging of cellular defect in lysinuric protein intolerance (LPI)

Fluoresenssiperusteiset kuvantamismenetelmät lysinurisen proteiini-intoleranssin (LPI) soluhäiriön tutkimuksessa Lysinurinen proteiini-intoleranssi on suomalaiseen tautiperintöön kuuluva autosomaalisesti peit¬tyvästi periytyvä sairaus, jonka aiheuttaa kationisten aminohappojen kuljetushäiriö munuaisten ja ohutsuolen epiteelisolujen basolateraalikalvolla. Aminohappojen kuljetushäiriö johtaa moniin oirei¬siin, kuten kasvuhäiriöön, osteoporoosiin, immuunijärjestelmän häiriöihin, oksenteluun ja runsaspro¬teiinisen ravinnon nauttimisen jälkeiseen hyperammonemiaan. LPI-geeni SLC7A7 (solute carrier family 7 member 7) koodaa y+LAT1 proteiinia, joka on basolateraali¬nen kationisten ja neutraalien aminohappojen kuljettimen kevyt ketju, joka muodostaa heterodimee¬rin raskaan alayksikön 4F2hc:n kanssa. Tällä hetkellä SLC7A7-geenistä tunnetaan yli 50 LPI:n aiheut¬tavaa mutaatiota. Tässä tutkimuksessa erityyppisiä y+LAT1:n LPI-mutaatiota sekä yhdeksän C-terminaalista polypep¬tidiä lyhentävää deleetiota kuvannettiin nisäkässoluissa y+LAT1:n GFP (green fluorescent protein) -fuusioproteiineina. Tulokset vahvistivat muissa soluissa tehdyt havainnot siitä, että 4F2hc on edel¬lytyksenä y+LAT1:n solukalvokuljetukselle, G54V-pistemutantti sijaitsee solukalvolla samoin kuin vil¬lityyppinen proteiini, mutta lukukehystä muuttavia ja proteiinia lyhentäviä mutantteja ei kuljeteta solukalvoon. Lisäksi havaittiin, että poikkeuksena tästä säännöstä ovat y+LAT1-deleetioproteiinit, joista puuttui korkeintaan 50 C-terminaalista aminohappoa. Nämä lyhentyneet kuljettimet sijaitsevat solukalvolla kuten villityyppiset ja LPI-pistemutanttiproteiinit. Dimerisaation osuutta kuljetushäiriön synnyssä tutkittiin käyttämällä fluorescence resonance energy transfer (FRET) menetelmää. Heterodimeerin alayksiköistä kloonattiin ECFP (cyan) ja EYFP (yellow) fuusioproteiinit, joita ilmennettiin nisäkässoluissa, ja FRET mitattiin virtaussytometri-FRET -menetel¬mällä (FACS-FRET). Tutkimuksissa kaikkien mutanttien havaittiin dimerisoituvan yhtä tehokkaasti. Kul¬jetushäiriön syynä ei siten ole alayksiköiden dimerisaation estyminen mutaation seurauksena. Tutkimuksessa havaittiin, että kaikki mutantti-y+LAT1-transfektiot tuottavat vähemmän transfektoi¬tuneita soluja kuin villityyppisen y+LAT1:n transfektiot. Solupopulaatioissa, joihin oli tranfektoitu lu¬kukehystä muuttava tai stop-kodonin tuottava mutaatio havaittiin suurempi kuolleisuus kuin saman näytteen transfektoitumattomissa soluissa, kun taas villityyppistä tai G54V-pistemutanttia tuottavas¬sa solupopulaatiossa oli pienempi kuolleisuus kuin saman näytteen fuusioproteiinia ilmentämättö¬missä soluissa. Tulos osoittaa mutanttiproteiinien erilaiset vaikutukset niitä ilmentäviin soluihin, joko suoraan y+LAT1:n tai 4F2hc:n kautta aiheutuneina. LPIFin SLC7A7 lähetti-RNA:n määrä ei merkittävästi poikennut villityyppisen määrästä fibroblasteissa ja lymfoblasteissa. SLC7A7:n promoottorianalyysissä oli osoitettavissa säätelyalueita geenin 5’ ei-koo¬daavalla alueella sekä ensimmäisten kahden intronin alueella. LPI-taudin tautimekanismin kannalta keskeisin tekijä on kuitenkin aminohappokuljetuksen häiriö, jonka vaikutuksesta näistä aminohapoista riippuvaiset prosessit elimistössä eivät toimi normaalisti. Havaittu virheellinen y+LAT1/4F2hc kuljetuskompleksin sijainti edellyttää lisätutkimuksia sen mahdol¬lisen kliinisen merkityksen selvittämiseksi.

Non-Markovian dynamics in quantum optical dephasing channels

Quantum computation and quantum communication are two of the most promising future applications of quantum mechanics. Since the information carriers used in both of them are essentially open quantum systems it is necessary to understand both quantum information theory and the theory of open quantum systems in order to investigate realistic implementations of such quantum technologies. In this thesis we consider the theory of open quantum systems from a quantum information theory perspective. The thesis is divided into two parts: review of the literature and original research. In the review of literature we present some important definitions and known results of open quantum systems and quantum information theory. We present the definitions of trace distance, two channel capacities and superdense coding capacity and give a reasoning why they can be used to represent the transmission efficiency of a communication channel. We also show derivations of some properties useful to link completely positive and trace preserving maps to trace distance and channel capacities. With the help of these properties we construct three measures of non-Markovianity and explain why they detect non-Markovianity. In the original research part of the thesis we study the non-Markovian dynamics in an experimentally realized quantum optical set-up. For general one-qubit dephasing channels we calculate the explicit forms of the two channel capacities and the superdense coding capacity. For the general two-qubit dephasing channel with uncorrelated local noises we calculate the explicit forms of the quantum capacity and the mutual information of a four-letter encoding. By using the dynamics in the experimental implementation as a set of specific dephasing channels we also calculate and compare the measures in one- and two-qubit dephasing channels and study the options of manipulating the environment to achieve revivals and higher transmission rates in superdense coding protocol with dephasing noise. Kvanttilaskenta ja kvanttikommunikaatio ovat kaksi puhutuimmista tulevaisuuden kvanttimekaniikan käytännön sovelluksista. Koska molemmissa näistä informaatio koodataan systeemeihin, jotka ovat oleellisesti avoimia kvanttisysteemejä, sekä kvantti-informaatioteorian, että avointen kvanttisysteemien tuntemus on välttämätöntä. Tässä tutkielmassa käsittelemme avointen kvanttisysteemien teoriaa kvantti-informaatioteorian näkökulmasta. Tutkielma on jaettu kahteen osioon: kirjallisuuskatsaukseen ja omaan tutkimukseen. Kirjallisuuskatsauksessa esitämme joitakin avointen kvanttisysteemien ja kvantti-informaatioteorian tärkeitä määritelmiä ja tunnettuja tuloksia. Esitämme jälkietäisyyden, kahden kanavakapasiteetin ja superdense coding -kapasiteetin määritelmät ja esitämme perustelun sille, miksi niitä voidaan käyttää kuvaamaan kommunikointikanavan lähetystehokkuutta. Näytämme myös todistukset kahdelle ominaisuudelle, jotka liittävät täyspositiiviset ja jäljensäilyttävät kuvaukset jälkietäisyyteen ja kanavakapasiteetteihin. Näiden ominaisuuksien avulla konstruoimme kolme epä-Markovisuusmittaa ja perustelemme, miksi ne havaitsevat dynamiikan epä-Markovisuutta. Oman tutkimuksen osiossa tutkimme epä-Markovista dynamiikkaa kokeellisesti toteutetussa kvanttioptisessa mittausjärjestelyssä. Yleisen yhden qubitin dephasing-kanavan tapauksessa laskemme molempien kanavakapasiteettien ja superdense coding -kapasiteetin eksplisiittiset muodot. Yleisen kahden qubitin korreloimattomien ympäristöjen dephasing-kanavan tapauksessa laskemme yhteisen informaation lausekkeen nelikirjaimisessa koodauksessa ja kvanttikanavakapasiteetin. Käyttämällä kokeellisen mittajärjestelyn dynamiikkoja esimerkki dephasing-kanavina me myös laskemme konstruoitujen epä-Markovisuusmittojen arvot ja vertailemme niitä yksi- ja kaksi-qubitti-dephasing-kanavissa. Lisäksi käyttäen kokeellisia esimerkkikanavia tutkimme, kuinka ympäristöä manipuloimalla superdense coding –skeemassa voidaan saada yhteinen informaatio ajoittain kasvamaan tai saavuttaa kaikenkaikkiaan korkeampi lähetystehokkuus.