The Influence of Diet and Microbes on Colonic Immune Regulation and their Implications on Type 1 Diabetes

Dietary and microbial factors are thought to contribute to the rapidly increasing prevalence of T1D in many countries worldwide. The impact of these factors on immune regulation and diabetes development in non-obese diabetic (NOD) mice are investigated in this thesis. Diabetes can be prevented in NOD mice through dietary manipulation. Diet affects the composition of intestinal microbiota, which may subsequently influence intestinal immune homeostasis. However, the specific effects of anti-diabetogenic diets on gut immunity and the explicit associations between intestinal immune disruption and type 1 diabetes onset remain unclear. The research presented herein demonstrates that newly weaned NOD mice suffer from a mild level of colitis, which shifts the colonic immune cell balance towards a proinflammatory status. Several aberrations can also be observed in the peritoneal B cells of NOD mice; an increase in activation marker expression, increased trafficking to the pancreatic lymph nodes and significantly higher antigen presenting cell (APC) efficiency towards insulin-specific T cells. A shift towards inflammation is likewise observed in the colon of germ-free NOD mice, but signs of peritoneal B cell activation are lacking in these mice. Remarkably, most of the abnormalities in the colon, peritoneal macrophages and the peritoneal B cell APC activity of NOD mice are abrogated when NOD mice are maintained on a diabetes-preventive, soy-based diet (ProSobee) from the time of weaning. Dietary and microbial factors hence have a significant impact on colonic immune regulation and peritoneal B cell activation and it is suggested that these factors influence diabetes development in NOD mice.

Application of RNAi to silence tartrate-resistant acid phosphatase: unexpected effects on the monocyte-macrophage lineage

Tartraatti-resistentin happaman fosfataasin hiljentäminen RNAi menetelmällä: odottamaton vaikutus monosyytti-makrofagi linjan soluissa RNA interferenssi (RNAi) eli RNA:n hiljentyminen löydettiin ensimmäisenä kasveissa, ja 2000-luvulla RNAi menetelmä on otettu käyttöön myös nisäkässoluissa. RNAi on mekanismi, jossa lyhyet kaksi juosteiset RNA molekyylit eli siRNA:t sitoutuvat proteiinikompleksiin ja sitoutuvat komplementaarisesti proteiinia koodaavaan lähetti RNA:han katalysoiden lähetti RNA:n hajoamisen. Tällöin RNA:n koodaamaa proteiinia ei solussa tuoteta. Tässä työssä on RNA interferenssi menetelmän avuksi kehitetty uusi siRNA molekyylien suunnittelualgoritmi siRNA_profile, joka etsii lähetti RNA:sta geenin hiljentämiseen sopivia kohdealueita. Optimaalisesti suunnitellulla siRNA molekyylillä voi olla mahdollista saavuttaa pitkäaikainen geenin hiljeneminen ja spesifinen kohdeproteiinin määrän aleneminen solussa. Erilaiset kemialliset modifikaatiot, mm. 2´-Fluoro-modifikaatio, siRNA molekyylin riboosirenkaassa lisäsivät siRNA molekyylin stabiilisuutta veren plasmassa sekä siRNA molekyylin tehokkuutta. Nämä ovat tärkeitä siRNA molekyylien ominaisuuksia kun RNAi menetelmää sovelletaan lääketieteellisiin tarkoituksiin. Tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRACP) on entsyymi, joka esiintyy luunsyöjäsoluissa eli osteoklasteissa, antigeenejä esittelevissä dendiriittisissä soluissa sekä eri kudosten makrofageissa, jotka ovat syöjäsoluja. TRACP entsyymin biologista tehtävää ei ole saatu selville, mutta oletetaan että TRACP entsyymin kyvyllä tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja on tehtävä sekä luuta hajoittavissa osteoklasteissa sekä antigeenia esittelevissä dendriittisissä soluissa. Makrofageilla, jotka yliekpressoivat TRACP entsyymiä, on myös solunsisäinen reaktiivisten happiradikaalien tuotanto sekä bakteerin tappokyky lisääntynyt. TRACP-geenin hiljentämiseen tarkoitetut spesifiset DNA ja siRNA molekyylit aiheuttivat monosyytti-makrofagilinjan soluviljelymallissa TRACP entsyymin tuoton lisääntymistä odotusten vastaisesti. DNA ja RNA molekyylien vaikutusta TRACP entsyymin tuoton lisääntymiseen tutkittiin myös Tolllike reseptori 9 (TLR9) poistogeenisestä hiirestä eristetyissä monosyyttimakrofaagisoluissa. TRACP entsyymin tuoton lisääntyminen todettiin sekvenssistä ja TLR9:stä riippumattomaksi vasteeksi solun ulkopuolisia DNA ja RNA molekyylejä vastaan. Havainto TRACP entsyymin tuoton lisääntymisestä viittaa siihen, että TRACP entsyymillä on tehtävä solun immuunipuolustusjärjestelmässä.

The Roots of Neurofibromas in Neurofibromatosis 1 — A Question of Multipotency, Differentiation and Hiding

Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant cancer predisposition syndrome that affects about 1 in 3500 individuals worldwide. NF1 is caused by mutations in the NF1 gene that encodes the tumor suppressor protein neurofibromin, an inactivator of the Ras oncogene. The hallmarks of NF1 include pigmentary lesions of the skin, Lisch nodules of the iris and cutaneous neurofibromas. Cutaneous neurofibromas are benign tumors composed of all the cell types of normal peripheral nerve. The traditional view of neurofibroma development has been that cutaneous neurofibromas arise from the disruption of the small nerve tributaries of the skin and subsequent proliferation of the resident cells. The second hit mutation in the NF1 gene has been considered as a prerequisite for neurofibroma development. The second hit is detectable in a subpopulation of primary Schwann cells cultured from neurofibromas. This thesis challenges the traditional concept of neurofibroma development. The results show that cutaneous neurofibromas are intimately associated with hair follicular structures and contain multipotent precursor cells (NFPs), suggesting that neurofibromas may arise from the multipotent cells which reside in hair follicles. Furthermore, this study presents that neurofibroma-derived Schwann cells that harbor bi-allelic inactivation in the NF1 gene express HLA class II genes and may act as nonprofessional antigen presenting cells. The CD4- and FoxP3-positive cells detected in cutaneous neurofibromas suggest that these cells may represent regulatory T cells (Tregs) which interact with HLA II –positive cells and aid the tumor cells in hiding from the immune system and are thus mediators of immune tolerance. This thesis also investigated neurofibroma development in the oral cavity and the use of different biomarkers to characterize cellular differentiation in neurofibromas. The results revealed that oral neurofibromas are not rare, but they usually appear as solitary lesions contrary to multiple cutaneous neurofibromas and present high heterogeneity within and between tumors. The use of class III beta-tubulin as a marker for neuronal differentiation led to an unexpected finding showing that multiple cell types express class III beta-tubulin during mitosis. The increased understanding of the multipotency of tumor cells, cellular differentiation and ability to hide from immune system will aid in the development of future treatments. Specifically, targeting Tregs in NF1 patients could provide a novel therapeutic approach to interfere with the development of neurofibromas.