Receptors and endocytosis of coxsackievirus A9

Coxsackievirus A9 (CV-A9) belongs to human enteroviruses within family Picornaviridae, which are the main cause of aseptic meningitis. In addition, CV-A9 causes a wide range of other clinical manifestations of acute disease including respiratory infections, myocarditis, encephalitis and severe generalized infections in newborns. In this study, the functions of integrins αVβ6 and αVβ3 in the attachment and cellular entry of CV-A9 were analyzed. Further, virus and cell surface interactions and endocytosis of CV-A9 were studied in specific cell lines. Also, a method for production of GFP-expressing CV-A9 particles by long PCR-mediated mutagenesis and in vivo transcription was developed. The results indicated that RGD-motif (arginine-glycine-asparagine) that resides in the viral capsid is important for CV-A9 infection particularly in cell lines expressing integrin αVβ6 and that this integrin serves as a high affinity attachment receptor for the virus. CV-A9 is also capable of infecting certain cell lines independently of αV-integrins by binding to the cell surface HSPA5 protein. Regardless of the attachment stage, the internalization of the virus occurs via the same entry pathway and is dependent on β2M, dynamin, and Arf6 but independent of clathrin and caveolin-1. Furthermore, the virus internalization occurs within Arf6-containing vesicles suggesting that Arf6 is central mediator of CV-A9 endocytosis. While in this study the results of CV-A9 endocytosis were based on microscopical visualization within individual fixed cells, a rapid method for generation of a virus for real-time imaging was also described.

Pikornavirusten käyttö geenivektoreina ja syöpäterapiassa sekä Coxsackievirus A7 -isolaattien sekvenssianalyysi

Kirjallisessa osassa tarkasteltiin pikornavirusten käyttöä geenivektoreina ja syöpäterapiassa. Pikornavirukset ovat positiivissäikeisiä RNA-viruksia, ja niiden genomi koostuu rakenteellisista kuoriproteiineista VP1-VP4 sekä ei-rakenteellisista proteiineista 2A-2C ja 3A-3D. Geenivektoritutkimukset ovat keskittyneet erilaisten inserttien kloonaamiseen virusten VP1-VP4-alueelle ja genomin 5'-päähän sekä näiden muutosten vaikutusten seuraamiseen virusten elinkierrossa solu- ja hiirimalleissa. Geenivektoreina on parhaiten toimineet coxsackievirukset B3, B4 ja A9 sekä mengo- ja poliovirus. Niitä on käytetty hiirissä mm. neuronien motorisen BDNF-reseptorin ilmentämiseen sekä hiiren interleukiini-10:n tuottamiseen selkäydinkanavan vaurioiden korjaamiseksi. Syöpäterapiatutkimuksissa on saatu lupaavia tuloksia coxsackieviruksilla A21, A13, A15 ja A18 sekä echo-, Seneca Valley 001- ja EMCV-viruksilla. Viruksilla on saatu mm. rintasyövän pääkasvain ja metastasoituneet etäpesäkkeet häviämään sekä eturauhassyövän kasvaimia pienenemään. Seneca Valley 001 -virus on osoittautunut tehokkaaksi syöpiä vastaan, joilla on neuroendokriinisiä ominaisuuksia. Viruksen käyttämistä faasi 2:n kliinisiin kokeisiin ollaan parhaillaan suunnittelemassa pienisoluisen keuhkosyövän ja lasten neuroendokriinisen syövän kohdalla. Kokeellisessa osassa optimoitiin RT-PCR-menetelmä coxsackievirus A7:n (CV-A7) genomin tuottamiseksi PCR-reaktiolla (FL-PCR). FL-PCR:n optimointi tehtiin vektoreilla, joihin oli kloonattu CV-A7-USSR- (USSR-pcDNA3) ja CV-A7-Parkerisolaattien (Parker-TA) genomit. Menetelmää käytettiin myöhemmin muiden CV-A7- virusisolaattien (275/58, ET1080 ja SVK) tutkimiseen. Näistä isolaateista eristettiin virus-RNA, joka käännettiin cDNA:ksi RT-entsyymillä. PCR:ssä käytetyt, CV-A7- spesifiset koettimet oli suunniteltu aiemmin sekvensoidun CV-A7-sekvenssin (GenBank AY421765) pohjalta. Infektiivisen kloonin tuottamiseksi USSR-pcDNA3- ja Parker-TA-vektoreista tuotettiin PCR:n avulla (T7-PCR) virusgenomin sisältävä DNAjakso, jonka 5'-päähän muodostui alukkeiden avulla T7RNA-polymeraasipromoottori ja 3'-päähän polyA-häntä. Työssä myös sekvensoitiin ja analysoitiin CV-A7-virusisolaatit Parker, USSR, 275/58, ET1080 ja SVK sekä kloonattiin täyspitkiä virusgenomeja cDNA-muodossa mutaatiokokeita varten. FL-PCR:n optimointi onnistui, ja neljä viidestä CV-A7-isolaatista sekvensoitiin. Virusgenomien pituus vaihteli 7403–7405 nt:n välillä. CV-A7-ET1080, -Parker ja - USSR osoittautuivat yli 99 % ja CV-A7-275/58 82,6 % nt samankaltaisiksi koko genomin pituudelta AY421765:en suhteen. Yksittäisten geenien ja proteiinien osalta CV-A7-275/58 oli 75,8–90,4 % nt ja 93,7–98,8 % aa samankaltainen muiden suhteen. Simplot-analyysissä 3B-geenialue oli heterogeenisin. CV-A7-SVK-isolaatti osoittautui echovirus kolmeksi. Infektiivistä kloonia ei saatu tuotettua T7-PCR-tuotteista.