The role of the hypothalamic kisspeptin/GPR54 system in the control of GnRH neurons

Summary : The hypothalamus represents less than 1 % of the total volume of the brain tissue, yet it plays a crucial role in endocrine regulations. Puberty is defined as a process leading to physical, sexual and psychosocial maturation. The hypothalamus is central to this process, via the activation of GnRH neurons. Pulsatile GnRH secretion, minimal during childhood, increases with the onset of puberty. The primary function of GnRH is to regulate the growth, development and function of testes in boys and ovaries in girls, by stimulating the pituitary gland secretion of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). Several factors contribute to the timing of puberty, including sex and ethnicity, genetics, dietary intake and energy expenditure. Kisspeptins constitute a family of small peptides arising from the proteolytic cleavage of metastin, a peptide with 54 amino acids initially purified from human placenta. These kisspeptins were the subject of much attention following their discovery because of their antimetastatic properties, but it was more recently that their determining role in the reproductive function was demonstrated. It was shown that kisspeptins are ligands of a receptor, GPR54, whose natural inactivating mutation in humans, or knockout in the mouse, lead to infertility. GnRH neurons play a pivotal role in the central regulation of fertility. Kisspeptin greatly increases GnRH release and GnRH neuron firing activity, but the neurobiological mechanisms for these actions are unknown. Gprotein-coupled receptor 54, the receptor for kisspeptin, is expressed by GnRH neurons as well as other hypothalamic neurons, suggesting that both direct and indirect effects are possible. In the first part of my thesis, we investigated a possible connection between the acceleration of sexual development induced by leptin and hypothalamic metastin neurons. However, the data generated by our preliminary experiments confirmed that the commercially available antibodies are non-specific. This finding constituted a major drawback for our studies, which relied heavily upon the neuroanatomical study of the hypothalamic metastinergic pathways to elucidate their sensitivity to exogenous leptin. Therefore, we decided to postpone any further in vivo experiment until a better antibody becomes available, and focused on in vitro studies to better understand the mechanisms of action of kisspeptins in the modulation of the activity of GnRH neurons. We used two GnRH-expressing neuronal cell lines to investigate the cellular and molecular mechanisms of action of metastin in GnRH neurons. We demonstrated that kisspeptin induces an early activation of the MAP kinase intracellular signaling pathway in both cell lines, whereas the SAP/JNK or the Akt pathways were unaffected. Moreover, we found an increase in GnRH mRNA levels after 6h of metastin stimulation. Thus, we can conclude that kisspeptin regulates GnRH neurons both at the secretion and the gene expression levels. The MAPK pathway is the major pathway activated by metastin in GnRH expressing neurons. Taken together, these data provide the first mechanism of action of kisspeptin on GnRH neurons. Résumé : L'hypothalamus est une zone située au centre du cerveau, dont il représente moins de 1 du volume total. La puberté est la période de transition entre l'enfance et l'age adulte, qui s'accompagne de transformations somatiques, psychologiques, métaboliques et hormonales conduisant à la possibilité de procréer. La fonction principale de la GnRH est la régulation de la croissance, du développement et de la fonction des testicules chez les hommes, et des ovaires chez les femmes en stimulant la sécrétion de l'hormone lutéinisante (LH) et de l'hormone folliculostimulante (FSH) par la glande hypophysaire. Plusieurs facteurs contribuent au déclanchement de la puberté, y compris le sexe et l'appartenance ethnique, la génétique, l'apport alimentaire et la dépense énergétique. Les Kisspeptines constituent une famille de peptides résultant de la dissociation proteolytique de la métastine, un peptide de 54 acides aminés initialement purifié à partir de placenta humain. Ces kisspeptines ont fait l'objet de beaucoup d'attention à la suite de leur découverte en raison de leurs propriétés anti-metastatiques, et c'est plus récemment que leur rôle déterminant dans la fonction reproductive a été démontré. Les kisspeptines sont des ligands du récepteur GPR54, dont la mutation inactivatrice chez l'homme, ou le knockout chez la souris, conduisent à l'infertilité par hypogonadisme hypogonadotrope. Les neurones à GnRH jouent un rôle central dans le règlement des fonctions reproductrices et la kisspeptine stimule l'activité des neurones à GnRH et la libération de GnRH par ces neurones. Toutefois, les mécanismes neurobiologiques de ces actions ne sont pas connus. Dans la première partie de ma thèse, nous avons étudié le lien potentiel entre l'accélération du développement sexuel induite par la leptine et les neurones hypothalamiques à metastine. Les données générées dans cette première série d'expériences ont malheureusement confirmé que les anticorps anti-metastine disponibles dans le commerce sont aspécifiques. Ceci a constitué un inconvénient majeur pour nos études, qui devaient fortement s'appuyer sur l' étude neuroanatomique des neurones hypothalamiques à metastine pour évaluer leur sensibilité à la leptine exogène. Nous avons donc décidé de focaliser nos travaux sur une étude in vitro des mécanismes d'action de la kisspeptine pour moduler l'activité des neurones à GnRH. Nous avons utilisé deux lignées de cellules neuronales exprimant la GnRH pour étudier les mécanismes d'action cellulaires et moléculaires de la metastine dans des neurones. Nous avons ainsi pu démontrer que la kisspeptine induit une activation précoce de la voie f de signalisation de la MAP kinase dans les deux lignées cellulaires, alors que nous n'avons observé aucune activation de la voie de signalisation de la P13 Kinase et de la SAP/JNK. Nous avons en outre démontré une augmentation de l'expression de la GnRH par la stimulation avec la Kisspeptine. L'ensemble de ces données contribue à élucider le mécanisme d'action avec lequel la kisspeptine agit dans les neurones à GnRH, en démontrant un effet sur l'expression génique de la GnRH. Nous pouvons également conclure que la voie de la MAPK est la voie principale activée par la metastine dans les neurones exprimant la GnRH.

Etude des propriétés dynamiques de la sécrétion régulée des vésicules glutamatergiques des astrocytes

RESUME GRAND PUBLICLe cerveau est composé de différents types cellulaires, dont les neurones et les astrocytes. Faute de moyens pour les observer, les astrocytes sont très longtemps restés dans l'ombre alors que les neurones, bénéficiant des outils ad hoc pour être stimulés et étudiés, ont fait l'objet de toutes les attentions. Le développement de l'imagerie cellulaire et des outils fluorescents ont permis d'observer ces cellules non électriquement excitables et d'obtenir des informations qui laissent penser que ces cellules sont loin d'être passives et participent activement au fonctionnement cérébral. Cette participation au fonctionnement cérébral se fait en partie par le biais de la libération de substances neuro-actives (appellées gliotransmetteurs) que les astrocytes libèrent à proximité des synapses permettant ainsi de moduler le fonctionnement neuronal. Cette libération de gliotransmetteurs est principalement causée par l'activité neuronale que les astrocytes sont capables de sentir. Néanmoins, nous savons encore peu de chose sur les propriétés précises de la libération des gliotransmetteurs. Comprendre les propriétés spatio-temporelles de cette libération est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. En utilisant des outils fluorescents récemment développés et en combinant différentes techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu obtenir des informations très précises sur la libération de ces gliotransmetteurs par les astrocytes. Nous avons ainsi confirmé que cette libération était un processus très rapide et qu'elle était contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit une organisation complexe de la machinerie supportant la libération des gliotransmetteurs. Cette organisation complexe semble être à la base de la libération extrêmement rapide des gliotransmetteurs. Cette rapidité de libération et cette complexité structurelle semblent indiquer que les astrocytes sont des cellules particulièrement adaptées à une communication rapide et qu'elles peuvent, au même titre que les neurones dont elles seraient les partenaires légitimes, participer à la transmission et à l'intégration de l'information cérébrale.RESUMEDe petites vésicules, les « SLMVs » ou « Synaptic Like MicroVesicles », exprimant des transporteurs vésiculaires du glutamate (VGluTs) et libérant du glutamate par exocytose régulée, ont récemment été décrites dans les astrocytes en culture et in situ. Néanmoins, nous savons peu de chose sur les propriétés précises de la sécrétion de ces SLMVs. Contrairement aux neurones, le couplage stimulussécrétion des astrocytes n'est pas basé sur l'ouverture des canaux calciques membranaires mais nécessite l'intervention de seconds messagers et la libération du calcium par le reticulum endoplasmique (RE). Comprendre les propriétés spatio-temporelles de la sécrétion astrocytaire est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. Nous avons utilisé des outils fluorescents récemment développés pour étudier le recyclage des vésicules synaptiques glutamatergiques comme les colorants styryles et la pHluorin afin de pouvoir suivre la sécrétion des SLMVs à l'échelle de la cellule mais également à l'échelle des évènements. L'utilisation combinée de l'épifluorescence et de la fluorescence à onde évanescente nous a permis d'obtenir une résolution temporelle et spatiale sans précédent. Ainsi avons-nous confirmé que la sécrétion régulée des astrocytes était un processus très rapide (de l'ordre de quelques centaines de millisecondes). Nous avons découvert que cette sécrétion est contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit des compartiments cytosoliques délimités par le RE à proximité de la membrane plasmique et contenant les SLMVs. Cette organisation semble être à la base du couplage rapide entre l'activation des GPCRs et la sécrétion. L'existence de compartiments subcellulaires indépendants permettant de contenir les messagers intracellulaires et de limiter leur diffusion semble compenser de manière efficace la nonexcitabilité électrique des astrocytes. Par ailleurs, l'existence des différents pools de vésicules recrutés séquentiellement et fusionnant selon des modalités distinctes ainsi que l'existence de mécanismes permettant le renouvellement de ces pools lors de la stimulation suggèrent que les astrocytes peuvent faire face à une stimulation soutenue de leur sécrétion. Ces données suggèrent que la libération de gliotransmetteurs par exocytose régulée n'est pas seulement une propriété des astrocytes en culture mais bien le résultat d'une forte spécialisation de ces cellules pour la sécrétion. La rapidité de cette sécrétion donne aux astrocytes toutes les compétences pour pouvoir intervenir de manière active dans la transmission et l'intégration de l'information.ABSTRACTRecently, astrocytic synaptic like microvesicles (SLMVs), that express vesicular glutamate transporters (VGluTs) and are able to release glutamate by Ca2+-dependent regulated exocytosis, have been described both in tissue and in cultured astrocytes. Nevertheless, little is known about the specific properties of regulated secretion in astrocytes. Important differences may exist between astrocytic and neuronal exocytosis, starting from the fact that stimulus-secretion coupling in astrocytes is voltage independent, mediated by G-protein-coupled receptors and the release of Ca2+ from internal stores. Elucidating the spatiotemporal properties of astrocytic exo-endocytosis is, therefore, of primary importance for understanding the mode of communication of these cells and their role in brain signaling. We took advantage of fluorescent tools recently developed for studying recycling of glutamatergic vesicles at synapses like styryl dyes and pHluorin in order to follow exocytosis and endocytosis of SLMVs at the level of the entire cell or at the level of single event. We combined epifluorescence and total internal reflection fluorescence imaging to investigate, with unprecedented temporal and spatial resolution, the events underlying the stimulus-secretion in astrocytes. We confirmed that exo-endocytosis process in astrocytes proceeds with a time course on the millisecond time scale. We discovered that SLMVs exocytosis is controlled by local and fast Ca2+ elevations; indeed submicrometer cytosolic compartments delimited by endoplasmic reticulum (ER) tubuli reaching beneath the plasma membrane and containing SLMVs. Such complex organization seems to support the fast stimulus-secretion coupling reported here. Independent subcellular compartments formed by ER, SLMVs and plasma membrane containing intracellular messengers and limiting their diffusion seem to compensate efficiently the non-electrical excitability of astrocytes. Moreover, the existence of two pools of SLMVs which are sequentially recruited suggests a compensatory mechanisms allowing the refill of SLMVs and supporting exocytosis process over a wide range of multiple stimuli. These data suggest that regulated secretion is not only a feature of cultured astrocytes but results from a strong specialization of these cells. The rapidity of secretion demonstrates that astrocytes are able to actively participate in brain information transmission and processing.

Effects of the naturally occurring food mycotoxin ochratoxin A on brain cells in culture.

The potential of ochratoxin A (OTA) to damage brain cells was studied by using a three-dimensional cell culture system as model for the developing brain. Aggregating cell cultures of foetal rat telencephalon were tested either during an early developmental period, or during a phase of advanced maturation, over a wide range of OTA concentrations (0.4 nM to 50 microM). By monitoring changes in activities of cell type-specific enzymes (ChAt and GAD, for cholinergic and GABAergic neurones, respectively, GS for astrocytes and CNP for oligodendrocytes), the concentration-dependent toxicity and neurodevelopmental effects of OTA were determined. OTA proved to be highly toxic, since a 10-day treatment at 50 nM caused a general cytotoxicity in both mature and immature cultures. At 10 nM of OTA, cell type-specific effects were observed: in immature cultures, a loss in neuronal and oligodendroglial enzyme activities, and an increase in the activity of the astroglial marker glutamine synthetase were found, Furthermore, at 2 and 10 nM of OTA, a clustering of microglial cells was observed. In mature cultures, OTA was somewhat less potent, but caused a similar pattern of toxic effects. A 24 h-treatment with OTA resulted in a concentration-dependent decrease in protein synthesis, with IC50 values of 25 nM and 33 nM for immature and mature cultures respectively. Acute (24 h) treatment at high OTA concentrations (10 to 50 microM) caused a significant increase in reactive oxygen species formation, as measured by the intracellular oxidation of 2',7'-dichlorofluorescin. These results suggest that OTA has the potential to be a potent toxicant to brain cells, and that its effects at nanomolar concentrations are primarily due to the inhibition of protein synthesis, whereas ROS seem not to be involved in the toxicity mediated by a chronic exposure to OTA at such low concentrations.

Gene expression mapping in neuropathic pain : molecular plasticity in nociceptors and superficial dorsal horn

RESUME : La douleur neuropathique est le résultat d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux. Les symptômes qui suivent la douleur neuropathique sont sévères et leur traitement inefficace. Une meilleure approche thérapeutique peut être proposée en se basant sur les mécanismes pathologiques de la douleur neuropathique. Lors d'une lésion périphérique une douleur neuropathique peut se développer et affecter le territoire des nerfs lésés mais aussi les territoires adjacents des nerfs non-lésés. Une hyperexcitabilité des neurones apparaît au niveau des ganglions spinaux (DRG) et de la corne dorsale (DH) de la moelle épinière. Le but de ce travail consiste à mettre en évidence les modifications moléculaires associées aux nocicepteurs lésés et non-lésés au niveau des DRG et des laminae I et II de la corne dorsale, là où l'information nociceptive est intégrée. Pour étudier les changements moléculaires liés à la douleur neuropathique nous utilisons le modèle animal d'épargne du nerf sural (spared nerve injury model, SNI) une semaine après la lésion. Pour la sélection du tissu d'intérêt nous avons employé la technique de la microdissection au laser, afin de sélectionner une sous-population spécifique de cellules (notamment les nocicepteurs lésés ou non-lésés) mais également de prélever le tissu correspondant dans les laminae superficielles. Ce travail est couplé à l'analyse à large spectre du transcriptome par puce ADN (microarray). Par ailleurs, nous avons étudié les courants électriques et les propriétés biophysiques des canaux sodiques (Na,,ls) dans les neurones lésés et non-lésés des DRG. Aussi bien dans le système nerveux périphérique, entre les neurones lésés et non-lésés, qu'au niveau central avec les aires recevant les projections des nocicepteurs lésés ou non-lésés, l'analyse du transcriptome montre des différences de profil d'expression. En effet, nous avons constaté des changements transcriptionnels importants dans les nocicepteurs lésés (1561 gènes, > 1.5x et pairwise comparaison > 77%) ainsi que dans les laminae correspondantes (618 gènes), alors que ces modifications transcriptionelles sont mineures au niveau des nocicepteurs non-lésés (60 gènes), mais important dans leurs laminae de projection (459 gènes). Au niveau des nocicepteurs, en utilisant la classification par groupes fonctionnels (Gene Ontology), nous avons observé que plusieurs processus biologiques sont modifiés. Ainsi des fonctions telles que la traduction des signaux cellulaires, l'organisation du cytosquelette ainsi que les mécanismes de réponse au stress sont affectés. Par contre dans les neurones non-lésés seuls les processus biologiques liés au métabolisme et au développement sont modifiés. Au niveau de la corne dorsale de la moelle, nous avons observé des modifications importantes des processus immuno-inflammatoires dans l'aire affectée par les nerfs lésés et des changements associés à l'organisation et la transmission synaptique au niveau de l'aire des nerfs non-lésés. L'analyse approfondie des canaux sodiques a démontré plusieurs changements d'expression, principalement dans les neurones lésés. Les analyses fonctionnelles n'indiquent aucune différence entre les densités de courant tétrodotoxine-sensible (TTX-S) dans les neurones lésés et non-lésés même si les niveaux d'expression des ARNm des sous-unités TTX-S sont modifiés dans les neurones lésés. L'inactivation basale dépendante du voltage des canaux tétrodotoxine-insensible (TTX-R) est déplacée vers des potentiels positifs dans les cellules lésées et non-lésées. En revanche la vitesse de récupération des courants TTX-S et TTX-R après inactivation est accélérée dans les neurones lésés. Ces changements pourraient être à l'origine de l'altération de l'activité électrique des neurones sensoriels dans le contexte des douleurs neuropathiques. En résumé, ces résultats suggèrent l'existence de mécanismes différenciés affectant les neurones lésés et les neurones adjacents non-lésés lors de la mise en place la douleur neuropathique. De plus, les changements centraux au niveau de la moelle épinière qui surviennent après lésion sont probablement intégrés différemment selon la perception de signaux des neurones périphériques lésés ou non-lésés. En conclusion, ces modulations complexes et distinctes sont probablement des acteurs essentiels impliqués dans la genèse et la persistance des douleurs neuropathiques. ABSTRACT : Neuropathic pain (NP) results from damage or dysfunction of the peripheral or central nervous system. Symptoms associated with NP are severe and difficult to treat. Targeting NP mechanisms and their translation into symptoms may offer a better therapeutic approach.Hyperexcitability of the peripheral and central nervous system occurs in the dorsal root ganglia (DRG) and the dorsal horn (DH) of the spinal cord. We aimed to identify transcriptional variations in injured and in adjacent non-injured nociceptors as well as in corresponding laminae I and II of DH receiving their inputs.We investigated changes one week after the injury induced by the spared nerve injury model of NP. We employed the laser capture microdissection (LCM) for the procurement of specific cell-types (enrichment in nociceptors of injured/non-injured neurons) and laminae in combination with transcriptional analysis by microarray. In addition, we studied functionál properties and currents of sodium channels (Nav1s) in injured and neighboring non-injured DRG neurons.Microarray analysis at the periphery between injured and non-injured DRG neurons and centrally between the area of central projections from injured and non-injured neurons show significant and differential expression patterns. We reported changes in injured nociceptors (1561 genes, > 1.5 fold, >77% pairwise comparison) and in corresponding DH laminae (618 genes), while less modifications occurred in non-injured nociceptors (60 genes) and in corresponding DH laminae (459 genes). At the periphery, we observed by Gene Ontology the involvement of multiple biological processes in injured neurons such as signal transduction, cytoskeleton organization or stress responses. On contrast, functional overrepresentations in non-injured neurons were noted only in metabolic or developmentally related mechanisms. At the level of superficial laminae of the dorsal horn, we reported changes of immune and inflammatory processes in injured-related DH and changes associated with synaptic organization and transmission in DH corresponding to non-injured neurons. Further transcriptional analysis of Nav1s indicated several changes in injured neurons. Functional analyses of Nav1s have established no difference in tetrodotoxin-sensitive (TTX-S) current densities in both injured and non-injured neurons, despite changes in TTX-S Nav1s subunit mRNA levels. The tetrodotoxin-resistant (TTX-R) voltage dependence of steady state inactivation was shifted to more positive potentials in both injured and non-injured neurons, and the rate of recovery from inactivation of TTX-S and TTX-R currents was accelerated in injured neurons. These changes may lead to alterations in neuronal electrogenesis. Taken together, these findings suggest different mechanisms occurring in the injured neurons and the adjacent non-injured ones. Moreover, central changes after injury are probably driven in a different manner if they receive inputs from injured or non-injured neurons. Together, these distinct and complex modulations may contribute to NP.

Sweet sixteen for ANLS.

Since its introduction 16 years ago, the astrocyte-neuron lactate shuttle (ANLS) model has profoundly modified our understanding of neuroenergetics by bringing a cellular and molecular resolution. Praised or disputed, the concept has never ceased to attract attention, leading to critical advances and unexpected insights. Here, we summarize recent experimental evidence further supporting the main tenets of the model. Thus, evidence for distinct metabolic phenotypes between neurons (mainly oxidative) and astrocytes (mainly glycolytic) have been provided by genomics and classical metabolic approaches. Moreover, it has become clear that astrocytes act as a syncytium to distribute energy substrates such as lactate to active neurones. Glycogen, the main energy reserve located in astrocytes, is used as a lactate source to sustain glutamatergic neurotransmission and synaptic plasticity. Lactate is also emerging as a neuroprotective agent as well as a key signal to regulate blood flow. Characterization of monocarboxylate transporter regulation indicates a possible involvement in synaptic plasticity and memory. Finally, several modeling studies captured the implications of such findings for many brain functions. The ANLS model now represents a useful, experimentally based framework to better understand the coupling between neuronal activity and energetics as it relates to neuronal plasticity, neurodegeneration, and functional brain imaging.

The monocarboxylate transporter MCT4 : mechanism of regulation in astrocytes and its putative role in cerebral ischemia

Despite its small fraction of the total body weight (2%), the brain contributes for 20% and 25% respectively of the total oxygen and glucose consumption of the whole body. Indeed, glucose has been considered the energy substrate par excellence for the brain. However, evidence accumulated over the last half century revealed an important role for the monocarboxylate lactate in fulfilling the energy needs of neurons. This is particularly true during physiological neuronal activation and in pathological conditions. Lactate transport into and out of the cell is mediated by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, only three of them have been well characterized: MCT2 is the predominant neuronal isoform, while the other non¬neuronal cell types of the brain express the ubiquitous isoform MCT1. Quite recently, the MCT4 isoform has been described in astrocytes. Due to its high transport capacity compared to the other two isoforms, MCT4 is particularly adapted for glycolytic cells. Because of its recent discovery in the brain, nothing was known about its regulation in the central nervous system. Here we show that MCT4 is regulated by oxygen levels in primary cultures of astrocytes in a time- and concentration-dependent manner via the hypoxia inducible factor-la (HIF-la). Moreover, we showed that MCT4 expression is essential for astrocyte survival under low oxygen conditions. In parallel, we investigated the possible implication of the pyruvate kinase isoform Pkm2, a strong enhancer of glycolysis, in its regulation. Then we showed that MCT4 expression, as well as the expression of the other two MCT isoforms, is altered in a murine model of stroke. Surprisingly, neurons started to express MCT4, as well as MCT1, under such conditions. Altogether, these data suggest that MCT4, due to its high transport capacity for lactate, may be the isoform that enables cells to operate a major metabolic adaptation in response to pathological situations that alter metabolic homeostasis of the brain. -- Le cerveau représente 2% du poids corporel total, mais il contribue pour 20% de la consommation totale d'oxygène et 25% de celle de glucose au repos. Le glucose est considéré comme le substrat énergétique par excellence pour le cerveau. Néanmoins, depuis un demi- siècle maintenant, de plus en plus de travaux ont démontré que le lactate joue un rôle majeur dans le métabolisme cérébral et est capable du subvenir aux besoins énergétiques des neurones. Le lactate est tout particulièrement nécessaire pendant l'activation neuronale ainsi qu'en situation pathologique. Le transport du lactate à travers la barrière hématoencéphalique ainsi qu'à travers les membranes cellulaires est assuré par la famille des transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, uniquement trois d'entre eux ont été décrits: MCT2 est considéré comme le transporteur neuronal, alors que les autres types cellulaires qui constituent le cerveau expriment l'isoforme ubiquitaire MCT1. Récemment, l'isoforme MCT4 a été rapportée sur les astrocytes. Dû à sa grande capacité de transport pour le lactate, MCT4 est tout particulièrement adapté pour soutenir le métabolisme des cellules hautement glycolytiques, comme les astrocytes. En raison de sa toute récente découverte, les aspects comprenant sa régulation et son rôle dans le cerveau sont pour l'instant méconnus. Les résultats exposés dans ce travail démontrent dans un premier temps que l'expression de MCT4 est régulée par les niveaux d'oxygène dans les cultures d'astrocytes corticaux par le biais du facteur de transcription HIF-la. De plus, nous avons démontré que l'expression de MCT4 est essentielle à la survie des astrocytes quand le niveau d'oxygénation baisse. En parallèle, des résultats préliminaires suggèrent que l'isoforme 2 de la pyruvate kinase, un puissant régulateur de la glycolyse, pourrait jouer un rôle dans la régulation de MCT4. Dans la deuxième partie du travail nous avons démontré que l'expression de MCT4, ainsi que celle de MCT1 et MCT2, est altérée dans un modèle murin d'ischémie cérébrale. De façon surprenante, les neurones expriment MCT4 dans cette condition, alors que ce n'est pas le cas en condition physiologique. En tenant compte de ces résultats, nous suggérons que MCT4, dû à sa particulièrement grande capacité de transport pour le lactate, représente le MCT qui permet aux cellules du système nerveux central, notamment les astrocytes et les neurones, de s'adapter à de très fortes perturbations de l'homéostasie métabolique du cerveau qui surviennent en condition pathologique.

Creatine deficiency syndomes : a new model of partial GAMT deficiency affecting brain cell development

Les syndromes de déficiences cérébrales en créatine (CCDS) sont dus à des mutations dans les gènes GATM et G AMT (codant pour les enzymes AGAT et G AMT de la voie de synthèse de créatine) ainsi que SLC6A8 (transporteur de créatine), et génèrent une absence ou une très forte baisse de créatine (Cr) dans le cerveau, mesurée par spectroscopic de résonance magnétique. Les patients CCDS développent des handicaps neurologiques sévères. Les patients AGAT et GAMT peuvent être traités avec des doses importantes de Cr, mais gardent dans la plupart des cas des séquelles neurologiques irréversibles. Aucun traitement efficace n'existe à ce jour pour la déficience en SLC6A8. Bien que de nombreux modèles aient été développés pour comprendre la Cr cérébrale en conditions physiologiques, les pathomécanismes des CCDS ne sont pas encore compris. Des souris transgéniques pour les gènes Gatm, Gamt et Slc6a8 ont été générées, mais elles ne miment que partiellement la pathologie humaine. Parmi les CCDS, la déficience en GAMT est la plus sévère, en raison de l'accumulation cérébrale de l'intermédiaire guanidinoacétate (GAA). Alors que la toxicité cérébrale du GAA a été étudiée par exposition directe au GAA d'animaux adultes sains, les mécanismes de la toxicité du GAA en condition de déficience en GAMT dans le cerveau en développement sont encore inconnus. Le but de ce projet était donc de développer un modèle de déficience en GAMT dans des cultures 3D primaires de cellules nerveuses de rat en agrégats par knock-down du gène GAMT, en utilisant un virus adéno-associé (AAV) induisant le mécanisme d'interférence à l'ARN (RNAi). Le virus scAAV2, à la multiplicité d'infection de 1000, s'est révélé le plus efficace pour transduire tous les types de cellules nerveuses des cultures (neurones, astrocytes, oligodendrocytes), et générer un knock-down maximal de la protéine GAMT de 85% (jour in vitro 18). Cette déficience partielle en GAMT s'est révélée insuffisante pour générer une déficience en Cr, mais a causé l'accumulation attendue de GAA, à des doses comparables aux niveaux observés dans le LCR des patients GAMT. Le GAA a induit une croissance axonale anarchique accompagnée d'une baisse de l'apoptose naturelle, suivis par une induction tardive de mort cellulaire non-apoptotique. Le co-traitement par la Cr a prévenu tous les effets toxiques du GAA. Ce travail montre que l'accumulation de GAA en absence de déficience en Cr est suffisante pour affecter le développement du tissu nerveux, et suggère que des formes de déficiences en GAMT supplémentaires, ne présentant pas de déficiences en Cr, pourraient être découvertes par mesure du GAA, en particulier à travers les programmes récemment proposés de dépistage néonatal de la déficience en GAMT. -- Cerebral creatine deficiency syndromes (CCDS) are caused by mutations in the genes GATM and GAMT (respectively coding for the two enzymes of the creatine synthetic pathway, AGAT and GAMT) as well as SLC6A8 (creatine transporter), and lead to the absence or very strong decrease of creatine (Cr) in the brain when measured by magnetic resonance spectroscopy. Affected patients show severe neurological impairments. While AGAT and GAMT deficient patients can be treated with high dosages of Cr, most remain with irreversible brain sequelae. No treatment has been successful so far for SLC6A8 deficiency. While many models have helped understanding the cerebral Cr pathways in physiological conditions, the pathomechanisms underlying CCDS are yet to be elucidated. Transgenic mice carrying mutations in the Gatm, Gamt and Slc6a8 genes have been developed, but only partially mimic the human pathology. Among CCDS, GAMT deficiency is the most severe, due to the CNS accumulation of the guanidinoacetate (GAA) intermediate. While brain toxicity of GAA has been explored through direct GAA exposure of adult healthy animals, the mechanisms underlying GAA toxicity in GAMT deficiency conditions on the developing CNS are yet unknown. The aim of this project was thus to develop and characterize a GAMT deficiency model in developing brain cells by gene knockdown, by adeno-associated virus (AAV)-driven RNA interference (RNAi) in rat 3D organotypic primary brain cell cultures in aggregates. scAAV2 with a multiplicity of infection of 1000 was shown as the most efficient serotype, was able to transduce all brain cell types (neurons, astrocytes, oligodendrocytes) and to induce a maximal GAMT protein knockdown of 85% (day in vitro 18). Metabolite analysis showed that partial GAMT knockdown was insufficient to induce Cr deficiency but generated the awaited GAA accumulation at concentrations comparable to the levels observed in cerebrospinal fluid of GAMT-deficient patients. Accumulated GAA induced axonal hypersprouting paralleled with inhibition of natural apoptosis, followed by a later induction in non-apoptotic cell death. Cr supplementation led to the prevention of all GAA-induced toxic effects. This work shows that GAA accumulation without Cr deficiency is sufficient to affect CNS development, and suggests that additional partial GAMT deficiencies, which may not show the classical brain Cr deficiency, may be discovered through GAA measurement including by recently proposed neonatal screening programs for GAMT deficiency.

La concurrence : un instrument de maîtrise des coûts de la santé?

[Table des matières] 1. Les acteurs du système suisse de santé : les assureurs maladies, les fournisseurs de prestations, l'Etat, les assurés patients. 2. Quelle concurrence pour quelle organisation? : 2.1 Concurrence entre fournisseurs de prestations: Références étrangères (Grande-Bretagne, USA, Pays-Bas); Le système suisse: Financement et planification, Conventions tarifaires, Un élement indispensable à la concurrence: l'information. 2.2 Concurrence entre assureurs maladie. 3. Nouvelles formes d'organisation : 3.1 Les Health Maintenance Organizations (HMO); 3.2 Les HMO en Suisse: un moyen d'endiguer la croissance des coûts; 3.3 Les Nouvelles Orientations de Politique Sanitaire (NOPS); 3.4 La concurrence dans le cadre des réseaux intégrés.