Optimisation du transfert de gènes dans la rétine par des vecteurs lentiviraux lors de maladies dégénératives de la rétine

Certaines dégénérescences rétiniennes sont engendrées par des mutations¦génétiques et conduisent à la perte des cellules photosensibles, les¦photorécepteurs (cônes et/ou bâtonnets), et donc à la cécité (Roy et al., 2010).¦La prévalence est de 1/3000 chez les Caucasiens. Les Rétinites Pigmentaires¦(RP) en composent la majorité des cas, suivent l'Amaurose congénitale de¦Leber et la maladie de Stargardt. Il n'y a pas une mutation type associés à une¦maladie mais diverses mutations peuvent aboutir à une dégénérescence de la¦rétine. Tout comme le reste du système nerveux central, la rétine lésée n'a pas¦les capacités de se régénérer. Un objectif du traitement est de ralentir la¦dégénérescence de la rétine dans le but de la stabiliser. La thérapie génique¦constitue actuellement la seule approche thérapeutique à même de traiter les¦dégénérescences rétiniennes d'origine génétique. Elle consiste à utiliser un virus¦modifié, qui n'a plus les capacités de se reproduire, appelé vecteur pour cibler¦certaines cellules afin d'ajouter un gène sain ou d'inhiber un gène malade. Les¦virus associés à l'adénovirus (AAV) et les Lentivirus (LV) sont les 2 principaux¦types de virus utilisés en thérapie génique en ophtalmologie. D'autres vecteurs¦existent, comme les adénovirus et le virus de l'anémie infectieuse équine. Des¦études de thérapie génique effectuées chez l'homme avec le vecteur AAV ont¦démontré une sensible amélioration des fonctions visuelles (acuité visuelle,¦champ visuel, pupillométrie et le déplacement dans un environnement avec une¦lumière tamisée) chez des patients atteints d'Amaurose congénitale de Leber¦(Maguire et al., Ali et al., Hauswirth et al., Bennett et al.). Le vecteur utilisé au¦cours de ce travail est un LV, qui a pour avantage de pouvoir transporter de¦grands gènes. Lorsque ce vecteur est pseudotypé avec une enveloppe VSVG, il¦transduit (transférer un gène qui sera fonctionnel dans la cellule cible) bien¦l'épithélium pigmentaire rétinien (nécessaire à la survie et à la fonction des¦photorécepteurs). Afin de changer le tropisme du vecteur, celui testé dans cette¦étude contient une enveloppe de type Mokola qui cible efficacement les cellules¦gliales du cerveau et donc probablement aussi les cellules de Müller de la rétine.¦Le but à court terme est de transformer génétiquement ces cellules pour leur¦faire sécréter des molécules favorisant la survie des photorécepteurs. Pour¦révéler la cellule ciblée par le vecteur, le gène qui sera exprimé dans les cellules¦transduites code pour la protéine fluorescente verte 2 (GFPII) et n'a pas de¦fonction thérapeutique. Après avoir produit le virus, deux types de souris ont été¦injectées : des souris dépourvues du gène de la rhodopsine appelées Rho -/- et¦des souris sauvages appelées C57BL6. Les souris Rho -/- ont été choisies en¦tant que modèle de dégénérescence rétinienne et les souris C57BL6 en tant que¦comparatif. Les souris Rho -/- et C57BL56 ont été injectées entre le 2ème et le¦3ème mois de vie et sacrifiées 7 jours après. Des coupes histologiques de la rétine¦ont permis de mesurer et comparer pour chaque oeil, les distances de¦transduction du RPE et de la neurorétine (= toute la rétine sauf le RPE). La¦distance sur laquelle le RPE est transduit détermine la taille de la bulle¦d'injection alors que la distance sur laquelle la neurorétine est transduite¦détermine la capacité du vecteur à diffuser dans la rétine. Les résultats montrent¦une expression plus importante de la GFPII dans le RPE que dans la neurorétine¦chez les souris Rho -/- et C57BL6. Les principales cellules transduites au¦niveau de la neurorétine sont, comme attendu, les cellules de Müller. Lorsque¦l'on compare les proportions de neurorétine et de RPE transduites, on constate¦qu'il y a globalement eu une meilleure transduction chez les souris Rho -/-¦que chez les souris C57BL6. Cela signifie que le vecteur est plus efficace pour¦transduire une rétine dégénérée qu'une rétine saine. Pour déterminer quels types¦de cellules exprimaient la GFPII, des anticorps spécifiques de certains types de¦cellules ont été utilisés. Ces résultats sont similaires à ceux d'autres études¦effectuées précédemment, dont celle de Calame et al. en 2011, et tendent à¦prouver que le vecteur lentiviral avec l'enveloppe Mokola et le promoteur EFs¦est idéal pour transduire avec un gène thérapeutique des cellules de Müller dans¦des rétines en dégénérescence.

Coevolution of restriction factors and retroviruses

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l'hôte pour se répliquer. Ils doivent s'adapter pour infecter la cellule hôte de manière optimale tout en échappant à la vigilance du système de défense de l'hôte. Ainsi l'hôte et les virus se livrent à de constantes batailles évolutives. Mon travail de thèse a porté sur l'étude des signatures évolutives de facteurs de l'hôte agissant comme des 'facteurs de restriction' en bloquant la réplication rétrovirale chez les primates. Plus spécifiquement, mon travail a visé à utiliser des données évolutives pour renseigner les analyses fonctionnelles et la biologie. Nous avons étudié le facteur anti-VIH-1 nommé TRIM5a (i) chez les prosimiens pour mieux comprendre son rôle dans le contrôle d'un lentivirus endogène, (ii) dans son activité contre d'autres anciennes infections représentées par des rétrovirus endogènes humains et (iii) en tant que protéine capable de générer des mutants de la capside. Premièrement nous nous sommes intéressés à TRIM5a chez deux espèces de lémuriens dont Microcebus murinus qui porte le lentivirus endogène PSIV dans son génome depuis plusieurs millions d'années,. Nous avons observé que TRIM5a chez M. murinus a un spectre d'activité antivirale réduit à l'opposé de TRIM5a chez le Lemur catta - non porteur du PSIV endogène - qui bloque une large variété de rétrovirus dont le PSIV. De ce fait TRIM5a aurait pu contribuer à protéger certaines espèces de lémuriens vis-à-vis d'anciennes infections par le PSIV. A l'inverse du PSIV, des virus dérivés des rétrovirus endogènes humains HERV-K and HERV-H se sont révélés largement résistants à l'inhibition par TRIM5a. Ces données illustrent une absence de protection par TRIM5a face à d'autres anciennes infections rétrovirales. Puis, pour évaluer l'impact de la protéine TRIM5a humaine sur le VIH-1, nous avons testé l'effet de mutations des résidues sous sélection positive dans la capside du VIH-1 sur l'inhibition par TRIM5a. Nos résultats montrent que TRIM5a ne jouerait pas un rôle significatif dans l'évolution de la capside du VIH-1. Enfin notre travail a porté sur le facteur anti-VIH-1 SAMHD1 récemment découvert, que nous avons séquencé chez 25 espèces de primates. L'analyse évolutive des sites sous sélection positive et des expériences fonctionnelles ont permis d'identifier le domaine de SAMHD1 interagissant avec la protéine lentivirale Vpx. De même que d'autres protéines virales contrecarrent les facteurs de restriction en les menant à la dégradation, nous avons observé que Vpx induit la dégradation de SAMHD1 de manière spécifique à l'espèce. Ces découvertes contribuent à comprendre comment les facteurs de restriction et les virus co-évoluent pour se neutraliser l'un l'autre. - Viruses hijack the host cellular machinery to replicate. They adapt to infect optimally host cells while escaping host defense systems. Viruses and the host coevolve in an evolutionary struggle. My thesis work has been devoted to study the evolutionary signatures of host factors acting as restriction factors that block retroviral replication in primates. Specifically, my work aimed at using evolutionary data to inform functional analyses and biology. We studied the anti-HIV-1 factor TRIM5a (i) in prosimians to better understand its possible role in the control of an endogenous lentivirus, (ii) in its activity against other ancient infections - as represented by HERVs, and (iii) as a protein capable of generating escape mutants in the viral capsid. First, my work focused on two lemur species, one of which was the gray mouse lemur that carries the endogenous lentivirus PSIV integrated in its genome for several million years. TRIM5a from gray mouse lemur exhibited a limited antiviral spectrum as opposed to TRIM5a from ring-tailed lemur - not a host of PSIV - that is able to block diverse retroviruses notably PSIV. These results support the possible contribution of TRIM5a in protecting lemur species from ancient infection by PSIV. In contrast, chimeric viruses derived from two human endogenous retroviruses were broadly resistant to TRIM5a-mediated restriction, suggesting TRIM5a lack of activity against other types of ancient infections. To evaluate the recent impact of human TRIM5a on HIV-1 evolution, we tested whether variants at positively selected sites in the HIV-1 capsid affected the ability of human TRIM5a alleles to restrict HIV-1. Our results indicate that TRIM5a does not play a significant role in the evolution of HIV1 capsid. At last, our work concentrated on the newly discovered anti-HIV-1 restriction factor SAMHD1. We determined its coding sequence in a panel of 25 species of primates. Evolutionary analyses of positively selected sites in SAMHD1 domains and functional assays identified the domain of SAMHD1 interacting with the lentiviral protein Vpx. Similar to other viral countermeasures targeting cellular restriction factors, Vpx was responsible of the degradation of SAMHD1 orthologs in a species-specific manner. These findings contributed to understanding how restriction factors and viruses evolve to counteract each other.

Influence de deux milieux séquentiels pour la culture d'embryons sur la production d'hormone gonadotrophine chorionique et de progestérone par des cellules JEG-3 et BeWo [Effects of different embryo development media on hCG and progesterone release by JEG-3 and BeWo cells]

Current in vitro fertilisation (IVF) practice requires synchronisation between the¦environment of cultured oocytes and embryos and the surroundings to what they would have¦been exposed to in vivo. Commercial, sequential media follow this requirement but their exact¦composition is not available. We have compared two widely used IVF culture media systems using¦the two choriocarcinoma cell lines JEG-3 and BeWo. The two hormones hCG and progesterone¦were determined in the culture supernatants as endpoints. In both cell lines, but in a more¦pronounced way in JEG-3, progesterone rather than hCG production was stimulated, and a¦higher hormone release was observed in the fertilisation than in the cleavage media. Differences¦between manufacturers were small and did not favour one system over the other. We conclude¦that both sequential media systems can be equally well used in current IVF laboratory practice.¦© 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Intoxication par les champignons [Mushroom poisoning].

Mushroom poisoning is a regular complaint for consultation in emergency facilities. These situations are usually benign and symptomatic treatment is sufficient. However, severe damage can occur, potentially life-threatening. We review the various syndromes associated with the toxins involved, their management and the major signs that are suggestive of serious injury and requiring hospitalization.

Le professorat universitaire: une sélection genrée marquée par des critères d'excellence

Comme d'autres institutions académiques européennes, les universités suisses connaissent des changements importants et « l'excellence académique » est devenu un critère central lors de la sélection des dossiers pour les postes de rang professoral. Dans cet article, nous analyserons les critères d'excellence tels qu'ils apparaissent dans le programme Professeur.e.s boursiers.ières du FNS et les confronterons aux résultats d'une recherche sur les trajectoires de la relève académique que nous avons menée à l'Université de Lausanne. Nous montrerons comment la définition de l'excellence académique obéit à des logiques genrées qui rendent l'accession à un poste professoral plus difficile pour les femmes que pour les hommes. Nous verrons pourquoi les critères d'évaluation des sciences dures, qui sont peu à peu transférés vers les sciences humaines, renforcent les mécanismes d'exclusions des femmes des mondes académiques.

Prise en charge par le praticien des infections après transplantation d'organes solides [Management of infection after organ transplantation by the primary care physician]

The primary care physician is frequently consulted in first line for infectious complications in organ transplant recipients. Many infections without signs of severity can nowadays be managed on an outpatient basis. However, a number of clinical situations specific to transplant recipients may require special attention and knowledge. In particular, the general practitioner must be aware of the potential interactions between immunosuppressive and antimicrobial therapies, the risk of renal dysfunction as a consequence of diarrhea or urinary tract infection, and the diagnostic of CMV disease as a cause of fever without obvious source occurring several months after transplantation. Collaboration with the transplantation specialists is recommended in order to assure an optimal management of these patients.

Role of the c-Jun N-terminal Kinase signaling in pancreatic β-cells

L'insuline est une hormone qui diminue la concentration de sucre dans le sang et qui est produite par la cellule β du pancréas. Un défaut de production de cette hormone est une des causes principales du diabète. Cette perte de production d'insuline est la conséquence à la fois, de la réduction du nombre de cellules β et du mauvais fonctionnement des cellules β restantes. L'inflammation, en activant la voie de signalisation «c-Jun N-terminal Kinase» (JNK) contribue au déclin de ces cellules. Cette voie de signalisation est activée par des protéines telles que des kinases qui reçoivent le signal de stress. Dans ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à étudier le rôle de «Dual leucine zipper bearing kinase» (DLK) comme protéine capable de relayer le stress inflammatoire vers l'activation de la voie JNK dans les cellules β-pancréatiques. Nous montrons que DLK est présente dans les cellules β-pancréatiques et qu'elle agit effectivement comme un activateur de la voie de signalisation de JNK. En outre, DLK joue un rôle clé dans le contrôle de l'expression de l'insuline, de la sécrétion de l'insuline en réponse au glucose et au maintien de la survie des cellules β. Si l'expression de cette protéine diminue, la cellule produit moins d'insuline et sera plus sensible à la mort en réponse au stress inflammatoire. A l'inverse si l'expression de DLK est augmentée, la cellule β produit et secrète plus d'insuline. Des variations de l'expression de DLK sont par ailleurs, associées à l'état de santé de la cellule β. Chez la ratte en gestation ou la souris obèse, dans lesquelles la cellule β produit plus d'insuline, l'expression de DLK est augmentée. En revanche dans les cellules β des patients diabétiques, l'expression de DLK est diminuée par rapport aux cellules non malades. En résumé, DLK est nécessaire pour le bon fonctionnement de la cellule β-pancréatique et son expression corrèle avec le degré de santé des cellules, faisant que cette protéine pourrait être une cible thérapeutique potentiel. Les cellules β-pancréatiques ont la capacité de réguler la sécrétion d'insuline en s'adaptant précisément au stimulus et à la glycémie. La fonction de la cellule β est cruciale dans l'homéostasie du glucose puisque sa dysfonction et sa mort mènent au développement des diabètes de type 1 et 2. De nombreuses études suggèrent que l'inflammation pourrait avoir un rôle dans la dysfonction et la destruction de ces cellules dans le diabète de type 2. L'excès chronique de cytokines proinflammatoires accélère le dysfonctionnement de la cellule β pancréatique par un mécanisme qui implique la voie de signalisation «c-Jun N-terminal Kinase» (JNK). L'activation de cette voie est organisée par des protéines d'échafaudages. Elle se fait par trois étapes successives de phosphorylation impliquant une «Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase» (MAP3K), une MAP2K et JNK. Dans ce travail de thèse nous montrons l'expression abondante et spécifique de la MAP3K «Dual Leucine Zipper Bearing Kinase» (DLK) dans les cellules β pancréatiques. Cela est la conséquence de l'absence du répresseur transcriptionnel «Repressor Element 1 Silencing Transcription». Nous montrons également que DLK régule l'activation de JNK et qu'il s'avère nécessaire pour la fonction et la survie de la cellule β pancréatique par un mécanisme impliquant le facteur de transcription PDX-1. L'invalidation de l'expression de DLK diminue l'expression de l'insuline et potentialise l'apoptose induite par des cytokines proinflammatoires. A l'inverse, la surexpression de DLK augmente l'expression et la sécrétion d'insuline induites par le glucose. Par conséquent des niveaux d'expression appropriés de DLK sont déterminants pour la fonction et la survie de la cellule β pancréatique. L'obésité et la grossesse sont caractérisées par une hyperinsulinémie qui résulte d'une augmentation de la production et de la sécrétion de l'insuline. L'expression de DLK est augmentée dans des îlots de rattes gestantes et des souris obèses comparés à leurs contrôles respectifs. A l'inverse, dans des sujets diabétiques, l'expression de DLK est diminuée. Ensemble ces résultats montrent l'importance de DLK dans l'adaptation des îlots par un mécanisme qui pourrait impliquer la voie de signalisation de JNK. Des défauts dans cette voie régulée par DLK pourraient contribuer au dysfonctionnement et la mort de la cellule β pancréatique et par conséquent au développement du diabète. L'étude détaillée du mécanisme par lequel DLK active la voie de signalisation JNK et régule la fonction de la cellule β pancréatique pourrait ouvrir la voie des nouvelles thérapies ciblant l'amélioration de la fonction de la cellule β dans le diabète. - Pancreatic β-cells are evidently plastic in their ability to regulate insulin secretion. The quantity of insulin released by these cells varies according to the stimulus, and the prevailing glucose concentration, β-cell function is pivotal in glucose homeostasis, as their dysfunction, and death can lead to development of type 1 and type 2 diabetes. There are numerous reports so far underlying the role of inflammation in dysfunction, and destruction of β-cells, in both type 1 and type 2 diabetes. Chronic excess of pro¬inflammatory cytokines promotes a β-cell decline, via induction of the c-Jun N-terminal Kinase (JNK) pathway. The activation of the JNK pathway is organized by a scaffold protein-mediated module in which, a three-step phosphorylation cascade occurs. The latter includes, Mitogen activated protein kinase kinase kinase (MAP3K), MAP2K and JNK. In this thesis, we unveil that the MAP3K Dual Leucine Zipper Bearing Kinase (DLK) is selectively, and highly expressed in pancreatic β-cells, as the result from the absence of the transcriptional repressor named, Repressor Element 1 Silencing Transcription (REST). We show that DLK regulates activation of JNK, and is required for β-cell function and survival by modulating the PDX-1 transcription factor. Silencing of DLK expression diminishes insulin expression, and potentiated cytokine-mediated apoptosis. Conversely, overexpression of DLK increased insulin expression, and glucose-induced insulin secretion. Therefore, an appropriate level of DLK is critical for β-cell function and survival. Obesity and pregnancy are characterized by hyperinsulinemia resulting from an increased production and secretion of insulin. In isolated islets of pregnant rats, and obese mice, the expression of DLK was elevated when compared to their respective controls. However, decreased expression of DLK was observed in islets of individuals with diabetes. Taken together, we highlight the importance of DLK in islet adaptation, and describe a mechanism that may involve the JNK signaling. Deficiency in the JNK pathway regulated by DLK may contribute to β-cell failure and death, and thereby development of diabetes. Unraveling the mechanism whereby DLK activates the JNK pathway, and β-cell function, may pave the way for the design of novel therapies, aiming to improve β-cell function and survival in diabetes in general.