Optimisation du transfert de gènes dans la rétine par des vecteurs lentiviraux lors de maladies dégénératives de la rétine

Certaines dégénérescences rétiniennes sont engendrées par des mutations¦génétiques et conduisent à la perte des cellules photosensibles, les¦photorécepteurs (cônes et/ou bâtonnets), et donc à la cécité (Roy et al., 2010).¦La prévalence est de 1/3000 chez les Caucasiens. Les Rétinites Pigmentaires¦(RP) en composent la majorité des cas, suivent l'Amaurose congénitale de¦Leber et la maladie de Stargardt. Il n'y a pas une mutation type associés à une¦maladie mais diverses mutations peuvent aboutir à une dégénérescence de la¦rétine. Tout comme le reste du système nerveux central, la rétine lésée n'a pas¦les capacités de se régénérer. Un objectif du traitement est de ralentir la¦dégénérescence de la rétine dans le but de la stabiliser. La thérapie génique¦constitue actuellement la seule approche thérapeutique à même de traiter les¦dégénérescences rétiniennes d'origine génétique. Elle consiste à utiliser un virus¦modifié, qui n'a plus les capacités de se reproduire, appelé vecteur pour cibler¦certaines cellules afin d'ajouter un gène sain ou d'inhiber un gène malade. Les¦virus associés à l'adénovirus (AAV) et les Lentivirus (LV) sont les 2 principaux¦types de virus utilisés en thérapie génique en ophtalmologie. D'autres vecteurs¦existent, comme les adénovirus et le virus de l'anémie infectieuse équine. Des¦études de thérapie génique effectuées chez l'homme avec le vecteur AAV ont¦démontré une sensible amélioration des fonctions visuelles (acuité visuelle,¦champ visuel, pupillométrie et le déplacement dans un environnement avec une¦lumière tamisée) chez des patients atteints d'Amaurose congénitale de Leber¦(Maguire et al., Ali et al., Hauswirth et al., Bennett et al.). Le vecteur utilisé au¦cours de ce travail est un LV, qui a pour avantage de pouvoir transporter de¦grands gènes. Lorsque ce vecteur est pseudotypé avec une enveloppe VSVG, il¦transduit (transférer un gène qui sera fonctionnel dans la cellule cible) bien¦l'épithélium pigmentaire rétinien (nécessaire à la survie et à la fonction des¦photorécepteurs). Afin de changer le tropisme du vecteur, celui testé dans cette¦étude contient une enveloppe de type Mokola qui cible efficacement les cellules¦gliales du cerveau et donc probablement aussi les cellules de Müller de la rétine.¦Le but à court terme est de transformer génétiquement ces cellules pour leur¦faire sécréter des molécules favorisant la survie des photorécepteurs. Pour¦révéler la cellule ciblée par le vecteur, le gène qui sera exprimé dans les cellules¦transduites code pour la protéine fluorescente verte 2 (GFPII) et n'a pas de¦fonction thérapeutique. Après avoir produit le virus, deux types de souris ont été¦injectées : des souris dépourvues du gène de la rhodopsine appelées Rho -/- et¦des souris sauvages appelées C57BL6. Les souris Rho -/- ont été choisies en¦tant que modèle de dégénérescence rétinienne et les souris C57BL6 en tant que¦comparatif. Les souris Rho -/- et C57BL56 ont été injectées entre le 2ème et le¦3ème mois de vie et sacrifiées 7 jours après. Des coupes histologiques de la rétine¦ont permis de mesurer et comparer pour chaque oeil, les distances de¦transduction du RPE et de la neurorétine (= toute la rétine sauf le RPE). La¦distance sur laquelle le RPE est transduit détermine la taille de la bulle¦d'injection alors que la distance sur laquelle la neurorétine est transduite¦détermine la capacité du vecteur à diffuser dans la rétine. Les résultats montrent¦une expression plus importante de la GFPII dans le RPE que dans la neurorétine¦chez les souris Rho -/- et C57BL6. Les principales cellules transduites au¦niveau de la neurorétine sont, comme attendu, les cellules de Müller. Lorsque¦l'on compare les proportions de neurorétine et de RPE transduites, on constate¦qu'il y a globalement eu une meilleure transduction chez les souris Rho -/-¦que chez les souris C57BL6. Cela signifie que le vecteur est plus efficace pour¦transduire une rétine dégénérée qu'une rétine saine. Pour déterminer quels types¦de cellules exprimaient la GFPII, des anticorps spécifiques de certains types de¦cellules ont été utilisés. Ces résultats sont similaires à ceux d'autres études¦effectuées précédemment, dont celle de Calame et al. en 2011, et tendent à¦prouver que le vecteur lentiviral avec l'enveloppe Mokola et le promoteur EFs¦est idéal pour transduire avec un gène thérapeutique des cellules de Müller dans¦des rétines en dégénérescence.

Optimisation of antiretroviral therapy : pharmacokinetic and pharmacogenetic approaches

Les progrès de la thérapie antirétrovirale ont transformé l'infection par le VIH d'une condition inévitablement fatale à une maladie chronique. En dépit de ce succès, l'échec thérapeutique et la toxicité médicamenteuse restent fréquents. Une réponse inadéquate au traitement est clairement multifactorielle et une individualisation de la posologie des médicaments qui se baserait sur les facteurs démographiques et génétiques des patients et sur les taux sanguins totaux, libres et/ou cellulaires des médicaments pourrait améliorer à la fois l'efficacité et la tolérance de la thérapie, cette dernière étant certainement un enjeu majeur pour un traitement qui se prend à vie.L'objectif global de cette thèse était de mieux comprendre les facteurs pharmacocinétiques (PK) et pharmacogénétiques (PG) influençant l'exposition aux médicaments antirétroviraux (ARVs) nous offrant ainsi une base rationnelle pour l'optimisation du traitement antiviral et pour l'ajustement posologique des médicaments chez les patients VIH-positifs. Une thérapie antirétrovirale adaptée au patient est susceptible d'augmenter la probabilité d'efficacité et de tolérance à ce traitement, permettant ainsi une meilleure compliance à long terme, et réduisant le risque d'émergence de résistance et d'échec thérapeutique.A cet effet, des méthodes de quantification des concentrations plasmatiques totales, libres et cellulaires des ARVs ainsi que de certains de leurs métabolites ont été développées et validées en utilisant la chromatographie liquide coupée à la spectrométrie de masse en tandem. Ces méthodes ont été appliquées pour la surveillance des taux d'ARVs dans diverses populations de patients HIV-positifs. Une étude clinique a été initiée dans le cadre de l'étude VIH Suisse de cohorte mère-enfant afin de déterminer si la grossesse influence la cinétique des ARVs. Les concentrations totales et libres du lopînavir, de l'atazanavir et de la névirapine ont été déterminées chez les femmes enceintes suivies pendant leur grossesse, et celles-ci ont été trouvées non influencées de manière cliniquement significative par la grossesse. Un ajustement posologique de ces ARVs n'est donc pas nécessaire chez les femmes enceintes. Lors d'une petite étude chez des patients HIV- positifs expérimentés, la corrélation entre l'exposition cellulaire et plasmatique des nouveaux ARVs, notamment le raltégravir, a été déterminée. Une bonne corrélation a été obtenue entre taux plasmatiques et cellulaires de raltégravir, suggérant que la surveillance des taux totaux est un substitut satisfaisant. Cependant, une importante variabilité inter¬patient a été observée dans les ratios d'accumulation cellulaire du raltégravir, ce qui devrait encourager des investigations supplémentaires chez les patients en échec sous ce traitement. L'efficacité du suivi thérapeutique des médicaments (TDM) pour l'adaptation des taux d'efavirenz chez des patients avec des concentrations au-dessus de la cible thérapeutique recommandée a été évaluée lors d'une étude prospective. L'adaptation des doses d'efavirenz basée sur le TDM s'est montrée efficace et sûre, soutenant l'utilisation du TDM chez les patients avec concentrations hors cible thérapeutique. L'impact des polymorphismes génétiques des cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 et 3A4/5 sur la pharmacocinétique de l'efavirenz et de ces métabolites a été étudié : un modèle de PK de population intégrant les covariats génétiques et démographiques a été construit. Les variations génétiques fonctionnelles dans les voies de métabolisation principales (CYP2B6) et accessoires {CYP2A6et 3A4/S) de l'efavirenz ont un impact sur sa disposition, et peuvent mener à des expositions extrêmes au médicament. Un? ajustement des doses guidé par le TDM est donc recommandé chez ces patients, en accord avec les polymorphismes génétiques.Ainsi, nous avons démonté qu'en utilisant une approche globale tenant compte à la fois des facteurs PK et PG influençant l'exposition aux ARVs chez les patients infectés, il est possible, si nécessaire, d'individualiser la thérapie antirétrovirale dans des situations diverses. L'optimisation du traitement antirétroviral contribue vraisemblablement à une meilleure efficacité thérapeutique à iong terme tout en réduisant la survenue d'effets indésirables.Résumé grand publicOptimisation de la thérapie antirétrovirale: approches pharmacocinétiques et pharmacogénétiquesLes progrès effectués dans le traitement de l'infection par le virus de llmmunodéficienoe humaine acquise (VIH) ont permis de transformer une affection mortelle en une maladie chronique traitable avec des médicaments de plus en plus efficaces. Malgré ce succès, un certain nombre de patients ne répondent pas de façon optimale à leur traitement etyou souffrent d'effets indésirables médicamenteux entraînant de fréquentes modifications dans leur thérapie. Il a été possible de mettre en évidence que l'efficacité d'un traitement antirétroviral est dans la plupart des cas corrélée aux concentrations de médicaments mesurées dans le sang des patients. Cependant, le virus se réplique dans la cellule, et seule la fraction des médicaments non liée aux protéines du plasma sanguin peut entrer dans la cellule et exercer l'activité antirétrovirale au niveau cellulaire. Il existe par ailleurs une importante variabilité des concentrations sanguines de médicament chez des patients prenant pourtant la même dose de médicament. Cette variabilité peut être due à des facteurs démographiques et/ou génétiques susceptibles d'influencer la réponse au traitement antirétroviral.Cette thèse a eu pour objectif de mieux comprendre les facteurs pharmacologiques et génétiques influençant l'efficacité et ta toxicité des médicaments antirétroviraux, dans le but d'individualiser la thérapie antivirale et d'améliorer le suivi des patients HIV-positifs.A cet effet, des méthodes de dosage très sensibles ont été développées pour permettre la quantification des médicaments antirétroviraux dans le sang et les cellules. Ces méthodes analytiques ont été appliquées dans le cadre de diverses études cliniques réalisées avec des patients. Une des études cliniques a recherché s'il y avait un impact des changements physiologiques liés à la grossesse sur les concentrations des médicaments antirétroviraux. Nous avons ainsi pu démontrer que la grossesse n'influençait pas de façon cliniquement significative le devenir des médicaments antirétroviraux chez les femmes enceintes HIV- positives. La posologie de médicaments ne devrait donc pas être modifiée dans cette population de patientes. Par ailleurs, d'autres études ont portés sur les variations génétiques des patients influençant l'activité enzymatique des protéines impliquées dans le métabolisme des médicaments antirétroviraux. Nous avons également étudié l'utilité d'une surveillance des concentrations de médicament (suivi thérapeutique) dans le sang des patients pour l'individualisation des traitements antiviraux. Il a été possible de mettre en évidence des relations significatives entre l'exposition aux médicaments antirétroviraux et l'existence chez les patients de certaines variations génétiques. Nos analyses ont également permis d'étudier les relations entre les concentrations dans le sang des patients et les taux mesurés dans les cellules où le virus HIV se réplique. De plus, la mesure des taux sanguins de médicaments antirétroviraux et leur interprétation a permis d'ajuster la posologie de médicaments chez les patients de façon efficace et sûre.Ainsi, la complémentarité des connaissances pharmacologiques, génétiques et virales s'inscrit dans l'optique d'une stratégie globale de prise en charge du patient et vise à l'individualisation de la thérapie antirétrovirale en fonction des caractéristiques propres de chaque individu. Cette approche contribue ainsi à l'optimisation du traitement antirétroviral dans la perspective d'un succès du traitement à long terme tout en réduisant la probabilité des effets indésirables rencontrés. - The improvement in antirétroviral therapy has transformed HIV infection from an inevitably fatal condition to a chronic, manageable disease. However, treatment failure and drug toxicity are frequent. Inadequate response to treatment is clearly multifactorial and, therefore, dosage individualisation based on demographic factors, genetic markers and measurement of total, free and/or cellular drug level may increase both drug efficacy and tolerability. Drug tolerability is certainly a major issue for a treatment that must be taken indefinitely.The global objective of this thesis aimed at increasing our current understanding of pharmacokinetic (PK) and pharmacogenetic (PG) factors influencing the exposition to antirétroviral drugs (ARVs) in HIV-positive patients. In turn, this should provide us with a rational basis for antiviral treatment optimisation and drug dosage adjustment in HIV- positive patients. Patient's tailored antirétroviral regimen is likely to enhance treatment effectiveness and tolerability, enabling a better compliance over time, and hence reducing the probability of emergence of viral resistance and treatment failure.To that endeavour, analytical methods for the measurement of total plasma, free and cellular concentrations of ARVs and some of their metabolites have been developed and validated using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. These assays have been applied for the monitoring of ARVs levels in various populations of HIV- positive patients. A clinical study has been initiated within the frame of the Mother and Child Swiss HIV Cohort Study to determine whether pregnancy influences the exposition to ARVs. Free and total plasma concentrations of lopinavir, atazanavir and nevirapine have been determined in pregnant women followed during the course of pregnancy, and were found not influenced to a clinically significant extent by pregnancy. Dosage adjustment for these drugs is therefore not required in pregnant women. In a study in treatment- experienced HIV-positive patients, the correlation between cellular and total plasma exposure to new antirétroviral drugs, notably the HIV integrase inhibitor raltegravir, has been determined. A good correlation was obtained between total and cellular levels of raltegravir, suggesting that monitoring of total levels are a satisfactory. However, significant inter-patient variability was observed in raltegravir cell accumulation which should prompt further investigations in patients failing under an integrase inhibitor-based regimen. The effectiveness of therapeutic drug monitoring (TDM) to guide efavirenz dose reduction in patients having concentrations above the recommended therapeutic range was evaluated in a prospective study. TDM-guided dosage adjustment of efavirenz was found feasible and safe, supporting the use of TDM in patients with efavirenz concentrations above therapeutic target. The impact of genetic polymorphisms of cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 and 3A4/5 on the PK of efavirenz and its metabolites was studied: a population PK model was built integrating both genetic and demographic covariates. Functional genetic variations in main (CYP2B6) and accessory (2A6, 3A4/5) metabolic pathways of efavirenz have an impact on efavirenz disposition, and may lead to extreme drug exposures. Dosage adjustment guided by TDM is thus required in those patients, according to the pharmacogenetic polymorphism.Thus, we have demonstrated, using a comprehensive approach taking into account both PK and PG factors influencing ARVs exposure in HIV-infected patients, the feasibility of individualising antirétroviral therapy in various situations. Antiviral treatment optimisation is likely to increase long-term treatment success while reducing the occurrence of adverse drug reactions.

A vertebrate reproductive system involving three ploidy levels : hybrid origin of triploids in a contact zone of diploid and tetraploid green toads (Bufo viridis subgroup)

The rise and consequences of polyploidy in vertebrates, whose origin was associated with genome duplications, may be best studied in natural diploid and polyploid populations. In a diploid/tetraploid (2n/4n) geographic contact zone of Palearctic green toads in northern Kyrgyzstan, we examine 4ns and triploids (3n) of unknown genetic composition and origins. Using mitochondrial and nuclear sequence, and nuclear microsatellite markers in 84 individuals, we show that 4n (Bufo pewzowi) are allopolyploids, with a geographically proximate 2n species (B. turanensis) being their maternal ancestor and their paternal ancestor as yet unidentified. Local 3n forms arise through hybridization. Adult 3n mature males (B. turanensis mtDNA) have 2n mothers and 4n fathers, but seem distinguishable by nuclear profiles from partly aneuploid 3n tadpoles (with B. pewzowi mtDNA). These observations suggest multiple pathways to the formation of triploids in the contact zone, involving both reciprocal origins. To explain the phenomena in the system, we favor a hypothesis where 3n males (with B. turanensis mtDNA) backcross with 4n and 2n females. Together with previous studies of a separately evolved, sexually reproducing 3n lineage, these observations reveal complex reproductive interactions among toads of different ploidy levels and multiple pathways to the evolution of polyploid lineages.

Study of gene flow through a hybrid zone in the common shrew (Sorex araneus) using microsatellites

The common shrew (Sorer araneus) is subdivided into several chromosomal races. As hybrid zones between them have been characterized, this organism is of particular interest in studying the role of chromosomes in speciation. Six microsatellite loci were used to evaluate the level of gene how in the S. araneus hybrid zone between the Cordon and Valais races. Most of these loci were very polymorphic, the total number of alleles detected per locus ranging from 3 to 20. Using Mantel tests, we showed that the effect of rivers as barriers to gene flow is less important at this sampling scale. The effect of the chromosomal race is of particular importantance in diminishing gene flow.

Mechanisms of reproductive isolation between an ant species of hybrid origin and one of its parents.

The establishment of new species by hybridization is difficult because it requires the development of reproductive isolation (RI) in sympatry to escape the homogenizing effects of gene flow from the parental species. Here we investigated the role of two pre- and two postzygotic mechanisms of RI in a system comprising two interdependent Pogonomyrmex harvester ant lineages (the H1 and H2 lineages) of hybrid origin and one of their parental species (P. rugosus). Similar to most other ants, P. rugosus is characterized by an environmental system of caste determination with female brood developing either into queens or workers depending on nongenetic factors. By contrast, there is a strong genetic component to caste determination in the H1 and H2 lineages because the developmental fate of female brood depends on the genetic origin of the parents, with interlineage eggs developing into workers and intralineage eggs developing into queens. The study of a mixed mating aggregation revealed strong differences in mating flight timing between P. rugosus and the two lineages as a first mechanism of RI. A second important prezygotic mechanism was assortative mating. Laboratory experiments also provided support for one of the two investigated mechanisms of postzygotic isolation. The majority of offspring produced from the few matings between P. rugosus and the lineages aborted at the egg stage. This hybrid inviability was under maternal influence, with hybrids produced by P. rugosus queens being always inviable whereas a small proportion of H2 lineage queens produced large numbers of adult hybrid offspring. Finally, we found no evidence that genetic caste determination acted as a second postzygotic mechanism reducing gene flow between P. rugosus and the H lineages. The few viable P. rugosus-H hybrids were not preferentially shunted into functionally sterile workers but developed into both workers and queens. Overall, these results reveal that the nearly complete (99.5%) RI between P. rugosus and the two hybrid lineages stems from the combination of two typical prezygotic mechanisms (mating time divergence and assortative mating) and one postzygotic mechanism (hybrid inviability).

Hybrid Multiscale Finite Volume method for two-phase flow in porous media

We present a novel hybrid (or multiphysics) algorithm, which couples pore-scale and Darcy descriptions of two-phase flow in porous media. The flow at the pore-scale is described by the Navier?Stokes equations, and the Volume of Fluid (VOF) method is used to model the evolution of the fluid?fluid interface. An extension of the Multiscale Finite Volume (MsFV) method is employed to construct the Darcy-scale problem. First, a set of local interpolators for pressure and velocity is constructed by solving the Navier?Stokes equations; then, a coarse mass-conservation problem is constructed by averaging the pore-scale velocity over the cells of a coarse grid, which act as control volumes; finally, a conservative pore-scale velocity field is reconstructed and used to advect the fluid?fluid interface. The method relies on the localization assumptions used to compute the interpolators (which are quite straightforward extensions of the standard MsFV) and on the postulate that the coarse-scale fluxes are proportional to the coarse-pressure differences. By numerical simulations of two-phase problems, we demonstrate that these assumptions provide hybrid solutions that are in good agreement with reference pore-scale solutions and are able to model the transition from stable to unstable flow regimes. Our hybrid method can naturally take advantage of several adaptive strategies and allows considering pore-scale fluxes only in some regions, while Darcy fluxes are used in the rest of the domain. Moreover, since the method relies on the assumption that the relationship between coarse-scale fluxes and pressure differences is local, it can be used as a numerical tool to investigate the limits of validity of Darcy's law and to understand the link between pore-scale quantities and their corresponding Darcy-scale variables.

Optimisation de la cryo microscopie électronique pour les études des minicercles d'ADN

RESUME : Bien que les propriétés physiques de la structure de l'ADN aient été intensivement étudiées pendant plus de 50 ans il y a encore beaucoup de questions importantes qui attendent des réponses. Par exemple, qu'arrive-t-il à la structure de la double hélice d'ADN nue (sans protéines liées) lorsqu'elle est fortement courbée, de la même manière que dans les nucléosomes? Cet ADN nu est-il facilement plié (il reste dans le régime élastique) ou réduit-il la contrainte de flexion en formant des sites hyperflexibles «kinks» (il sort du régime élastique en cassant l'empilement des paires de bases à certains endroits) ? La microscopie électronique peut fournir une réponse à cette question par visualisation directe des minicercles d'ADN de la longueur d'un tour de nucléosome (environ 90 paires de bases). Pour que la réponse soit scientifiquement valide, on doit observer les molécules d'ADN lorsqu'elles sont en suspension dans la solution d'intérêt et sans que des colorations, produits chimiques ou fixatifs n'aient été ajoutés, étant donné que ceux-ci peuvent changer les propriétés de l'ADN. La technique de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) développée par le groupe de Jacques Dubochet au début des années 80, permet la visualisation directe des molécules d'ADN suspendues dans des couche minces vitrifiées de solutions aqueuses. Toutefois, le faible contraste qui caractérise la cryo-EM combinée avec la très petite taille des minicercles d'ADN rendent nécessaire l'optimisation de plusieurs étapes, aussi bien dans la préparation des échantillons que dans le processus d'acquisition d'images afin d'obtenir deux clichés stéréo qui permettent la reconstruction 3-D des minicercles d'ADN. Dans la première partie de ma thèse, je décris l'optimisation de certains paramètres pour la cryoEM et des processus d'acquisition d'image utilisant comme objets de test des plasmides et d'autres molécules d'ADN. Dans la deuxième partie, je .décris comment j'ai construit les minicercles d'ADN de 94 bp et comment j'ai introduit des modifications structurelles comme des coupures ou des lacunes. Dans la troisième partie, je décris l'analyse des reconstructions des rninicercles d'ADN. Cette analyse, appuyée par des tests biochimiques, indique fortement que des molécules d'ADN sont capables de former de petites molécules circulaires de 94 bp sans dépasser les limites d'élasticité, indiquant que les minicercles adoptent une forme circulaire régulière où la flexion est redistribuée le long la molécule. ABSTRACT : Although physical properties of DNA structure have been intensively studied for over 50 years there are still many important questions that need to be answered. For example, what happens to protein-free double-stranded DNA when it is strongly bent, as in DNA forming nucleosomes? Is such protein-free DNA smoothly bent (i.e. it remains within elastic limits of DNA rigidity) or does it release its bending stress by forming sharp kinks (i.e. it exits the elastic regime and breaks the stacking between neighbouring base-pairs in localized regions)? Electron microscopy can provide an answer to this question by directly visualizing DNA minicircles that have the size of nucleosome gyres (ca 90 bp). For the answer to be scientifically valid, one needs to observe DNA molecules while they are still suspended in the solution of interest and no staining chemicals or fixatives have been added since these can change the properties of the DNA. CryoEM techniques developed by Jacques Dubochet's group beginning in the 1980's permit direct visualization of DNA molecules suspended in cryo-vitrified layers of aqueous solutions. However, a relatively weak contrast of cryo-EM preparations combined with the very small size of the DNA minicircles made it necessary to optimize many of the steps and parameters of the cryo-EM specimen preparation and image acquisition processes in order to obtain stereo-pairs of images that permit the 3-D reconstruction of the observed DNA minicircles. In the first part of my thesis I describe the optimization of the cryo-EM preparation and the image acquisition processes using plasmid size DNA molecules as a test object. In the second part, I describe how I formed the 94 by DNA minicircles and how I introduced structural modifications like nicks or gaps. In the third part, I describe the cryo-EM analysis of the constructed DNA minicircles. That analysis, supported by biochemical tests, strongly indicates that DNA minicircles as small as 94 by remain within the elastic limits of DNA structure, i.e. the minicircles adopt a regular circular shape where bending is redistributed along the molecules.

Exogenous selection shapes germination behaviour and seedling traits of populations at different altitudes in a Senecio hybrid zone.

BACKGROUND AND AIMS: The Senecio hybrid zone on Mt Etna, Sicily, is characterized by steep altitudinal clines in quantitative traits and genetic variation. Such clines are thought to be maintained by a combination of 'endogenous' selection arising from genetic incompatibilities and environment-dependent 'exogenous' selection leading to local adaptation. Here, the hypothesis was tested that local adaptation to the altitudinal temperature gradient contributes to maintaining divergence between the parental species, S. chrysanthemifolius and S. aethnensis. METHODS: Intra- and inter-population crosses were performed between five populations from across the hybrid zone and the germination and early seedling growth of the progeny were assessed. KEY RESULTS: Seedlings from higher-altitude populations germinated better under low temperatures (9-13 °C) than those from lower altitude populations. Seedlings from higher-altitude populations had lower survival rates under warm conditions (25/15 °C) than those from lower altitude populations, but also attained greater biomass. There was no altitudinal variation in growth or survival under cold conditions (15/5 °C). Population-level plasticity increased with altitude. Germination, growth and survival of natural hybrids and experimentally generated F(1)s generally exceeded the worse-performing parent. CONCLUSIONS: Limited evidence was found for endogenous selection against hybrids but relatively clear evidence was found for divergence in seed and seedling traits, which is probably adaptive. The combination of low-temperature germination and faster growth in warm conditions might enable high-altitude S. aethnensis to maximize its growth during a shorter growing season, while the slower growth of S. chrysanthemifolius may be an adaptation to drought stress at low altitudes. This study indicates that temperature gradients are likely to be an important environmental factor generating and maintaining adaptive divergence across the Senecio hybrid zone on Mt Etna.

Evaluation of organ-specific peripheral doses after 2-dimensional, 3-dimensional and hybrid intensity modulated radiation therapy for breast cancer based on Monte Carlo and convolution/superposition algorithms: implications for secondary cancer risk assessment.

To make a comprehensive evaluation of organ-specific out-of-field doses using Monte Carlo (MC) simulations for different breast cancer irradiation techniques and to compare results with a commercial treatment planning system (TPS). Three breast radiotherapy techniques using 6MV tangential photon beams were compared: (a) 2DRT (open rectangular fields), (b) 3DCRT (conformal wedged fields), and (c) hybrid IMRT (open conformal+modulated fields). Over 35 organs were contoured in a whole-body CT scan and organ-specific dose distributions were determined with MC and the TPS. Large differences in out-of-field doses were observed between MC and TPS calculations, even for organs close to the target volume such as the heart, the lungs and the contralateral breast (up to 70% difference). MC simulations showed that a large fraction of the out-of-field dose comes from the out-of-field head scatter fluence (>40%) which is not adequately modeled by the TPS. Based on MC simulations, the 3DCRT technique using external wedges yielded significantly higher doses (up to a factor 4-5 in the pelvis) than the 2DRT and the hybrid IMRT techniques which yielded similar out-of-field doses. In sharp contrast to popular belief, the IMRT technique investigated here does not increase the out-of-field dose compared to conventional techniques and may offer the most optimal plan. The 3DCRT technique with external wedges yields the largest out-of-field doses. For accurate out-of-field dose assessment, a commercial TPS should not be used, even for organs near the target volume (contralateral breast, lungs, heart).

Améliorations et optimisation globale de la méthode des analogues pour la prévision statistique des précipitations. Développement d'un outil de prévision et application opérationnelle au bassin du Rhône à l'amont du Léman.

Le bassin du Rhône à l'amont du Léman peut être sujet à de fortes précipitations en mesure de provoquer des crues significatives. L'objectif du projet MINERVE dans lequel s'inscrit le présent travail consiste à fournir des outils pour la prévision et la gestion des crues par des actions préventives sur les aménagements hydroélectriques à accumulation. Pour satisfaire ce dernier, il est nécessaire de prévoir au mieux les cumuls de précipitations pour les jours suivants. Ceci est actuellement effectué par le modèle numérique de prévision de MétéoSuisse ; mais, en raison des grandes incertitudes liées à la quantification des événements extrêmes, il a été décidé qu'une approche parallèle de nature statistique pourrait compléter l'information disponible. Ainsi, nous avons adapté la méthode des analogues, qui est une technique de prévision statistique des précipitations, au contexte alpin du bassin d'étude. Pour ce faire, plusieurs paramétrisations de la méthode ont été documentées et calibrées. Afin de prendre en main la méthode, nous avons effectué de multiples analyses paramétriques sur les variables synoptiques, mais également sur la constitution de groupements pluviométriques. Une partie conséquente de cette étude a été consacrée à la programmation d'un logiciel de prévision automatique par la méthode des analogues, ainsi qu'à un outil de visualisation des résultats sous forme de cartes et graphiques. Ce logiciel, nommé Atmoswing, permet d'implémenter un grand nombre de méthodes différentes de prévision par analogie. L'outil est opérationnel depuis mi-2011 et nous a permis de confirmer l'intérêt de la prévision par analogie. La méthode étant ici appliquée à un nouveau contexte, un grand nombre de variables synoptiques ont été évaluées. Nous avons alors confirmé l'intérêt des deux niveaux d'analogie sur la circulation atmosphérique et sur le flux d'humidité, tout en apportant des améliorations à celles-ci. Il en résulte des paramétrisations présentant des scores de performance supérieurs aux méthodes de référence considérées. Nous avons également évalué d'autres améliorations, comme l'introduction d'une fenêtre temporelle glissante afin de rechercher de meilleures analogies synoptiques à d'autres heures de la journée, ce qui s'est avéré intéressant, tout comme une prévision infrajournalière à pas de temps de 6 h. Finalement, nous avons introduit une technique d'optimisation globale, les algorithmes génétiques, capable de calibrer la méthode des analogues en considérant tous les paramètres des différents niveaux d'analogie de manière conjointe. Avec cette technique, nous pouvons nous approcher objectivement d'une paramétrisation optimale. Le choix des niveaux atmosphériques et des fenêtres temporelles et spatiales étant automatisé, cette technique peut engendrer un gain de temps, même si elle est relativement exigeante en calculs. Nous avons ainsi pu améliorer la méthode des analogues, et y ajouter de nouveaux degrés de liberté, notamment des fenêtres spatiales et des pondérations différenciées selon les niveaux atmosphériques retenus.