Measurement of biologically available naphthalene in gas and aqueous phases by use of a Pseudomonas putida biosensor.

Genetically constructed microbial biosensors for measuring organic pollutants are mostly applied in aqueous samples. Unfortunately, the detection limit of most biosensors is insufficient to detect pollutants at low but environmentally relevant concentrations. However, organic pollutants with low levels of water solubility often have significant gas-water partitioning coefficients, which in principle makes it possible to measure such compounds in the gas rather than the aqueous phase. Here we describe the first use of a microbial biosensor for measuring organic pollutants directly in the gas phase. For this purpose, we reconstructed a bioluminescent Pseudomonas putida naphthalene biosensor strain to carry the NAH7 plasmid and a chromosomally inserted gene fusion between the sal promoter and the luxAB genes. Specific calibration studies were performed with suspended and filter-immobilized biosensor cells, in aqueous solution and in the gas phase. Gas phase measurements with filter-immobilized biosensor cells in closed flasks, with a naphthalene-contaminated aqueous phase, showed that the biosensor cells can measure naphthalene effectively. The biosensor cells on the filter responded with increasing light output proportional to the naphthalene concentration added to the water phase, even though only a small proportion of the naphthalene was present in the gas phase. In fact, the biosensor cells could concentrate a larger proportion of naphthalene through the gas phase than in the aqueous suspension, probably due to faster transport of naphthalene to the cells in the gas phase. This led to a 10-fold lower detectable aqueous naphthalene concentration (50 nM instead of 0.5 micro M). Thus, the use of bacterial biosensors for measuring organic pollutants in the gas phase is a valid method for increasing the sensitivity of these valuable biological devices.

Hierarchical management of carbon sources is regulated similarly by the CbrA/B systems in Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida.

The CbrA/B system in pseudomonads is involved in the utilization of carbon sources and carbon catabolite repression (CCR) through the activation of the small RNAs crcZ in Pseudomonas aeruginosa, and crcZ and crcY in Pseudomonas putida. Interestingly, previous works reported that the CbrA/B system activity in P. aeruginosa PAO1 and P. putida KT2442 responded differently to the presence of different carbon sources, thus raising the question of the exact nature of the signal(s) detected by CbrA. Here, we demonstrated that the CbrA/B/CrcZ(Y) signal transduction pathway is similarly activated in the two Pseudomonas species. We show that the CbrA sensor kinase is fully interchangeable between the two species and, moreover, responds similarly to the presence of different carbon sources. In addition, a metabolomics analysis supported the hypothesis that CCR responds to the internal energy status of the cell, as the internal carbon/nitrogen ratio seems to determine CCR and non-CCR conditions. The strong difference found in the 2-oxoglutarate/glutamine ratio between CCR and non-CCR conditions points to the close relationship between carbon and nitrogen availability, or the relationship between the CbrA/B and NtrB/C systems, suggesting that both regulatory systems sense the same sort or interrelated signal.

Association of hemolytic activity of Pseudomonas entomophila, a versatile soil bacterium, with cyclic lipopeptide production.

Pseudomonas entomophila is an entomopathogenic bacterium that is able to infect and kill Drosophila melanogaster upon ingestion. Its genome sequence suggests that it is a versatile soil bacterium closely related to Pseudomonas putida. The GacS/GacA two-component system plays a key role in P. entomophila pathogenicity, controlling many putative virulence factors and AprA, a secreted protease important to escape the fly immune response. P. entomophila secretes a strong diffusible hemolytic activity. Here, we showed that this activity is linked to the production of a new cyclic lipopeptide containing 14 amino acids and a 3-C(10)OH fatty acid that we called entolysin. Three nonribosomal peptide synthetases (EtlA, EtlB, EtlC) were identified as responsible for entolysin biosynthesis. Two additional components (EtlR, MacAB) are necessary for its production and secretion. The P. entomophila GacS/GacA two-component system regulates entolysin production, and we demonstrated that its functioning requires two small RNAs and two RsmA-like proteins. Finally, entolysin is required for swarming motility, as described for other lipopeptides, but it does not participate in the virulence of P. entomophila for Drosophila. While investigating the physiological role of entolysin, we also uncovered new phenotypes associated with P. entomophila, including strong biocontrol abilities.

On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Intracellular excision and reintegration dynamics of the ICEclc genomic island of Pseudomonas knackmussii sp. strain B13.

Genomic islands are DNA elements acquired by horizontal gene transfer that are common to a large number of bacterial genomes, which can contribute specific adaptive functions, e.g. virulence, metabolic capacities or antibiotic resistances. Some genomic islands are still self-transferable and display an intricate life-style, reminiscent of both bacteriophages and conjugative plasmids. Here we studied the dynamical process of genomic island excision and intracellular reintegration using the integrative and conjugative element ICEclc from Pseudomonas knackmussii B13 as model. By using self-transfer of ICEclc from strain B13 to Pseudomonas putida and Cupriavidus necator as recipients, we show that ICEclc can target a number of different tRNA(Gly) genes in a bacterial genome, but only those which carry the GCC anticodon. Two conditional traps were designed for ICEclc based on the attR sequence, and we could show that ICEclc will insert with different frequencies in such traps producing brightly fluorescent cells. Starting from clonal primary transconjugants we demonstrate that ICEclc is excising and reintegrating at detectable frequencies, even in the absence of recipient. Recombination site analysis provided evidence to explain the characteristics of a larger number of genomic island insertions observed in a variety of strains, including Bordetella petri, Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia.

CHARACTERIZATION OF NrsZ, A NOVEL SMALL REGULATORY NON-CODING RNA INVOLVED IN THE ADAPTATION OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA PAO1

The opportunistic ubiquitous pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PAOl is a versatile Gram-negative bacterium that has the extraordinary capacity to colonize a wide diversity of ecological niches and to cause severe and persistent infections in humans. To ensure an optimal coordination of the genes involved in nutrient utilization, this bacterium uses the NtrB/C and/or the CbrA/B two-component systems, to sense nutrients availability and to regulate in consequence the expression of genes involved in their uptake and catabolism. NtrB/C is specialized in nitrogen utilization, while the CbrA/B system is involved in both carbon and nitrogen utilization and both systems activate their target genes expression in concert with the alternative sigma factor RpoN. Moreover, the NtrB/C and CbrA/B two- component systems regulate the secondary metabolism of the bacterium, such as the production of virulence factors. In addition to the fine-tuning transcriptional regulation, P. aeruginosa can rapidly modulate its metabolism using small non-coding regulatory RNAs (sRNAs), which regulate gene expression at the post-transcriptional level by diverse and sophisticated mechanisms and contribute to the fast physiological adaptability of this bacterium. In our search for novel RpoN-dependent sRNAs modulating the nutritional adaptation of P. aeruginosa PAOl, we discovered NrsZ (Nitrogen regulated sRNA), a novel RpoN-dependent sRNA that is induced under nitrogen starvation by the NtrB/C two-component system. NrsZ has a unique architecture, formed of three similar stem-loop structures (SL I, II and II) separated by variant spacer sequences. Moreover, this sRNA is processed in short individual stem-loop molecules, by internal cleavage involving the endoribonuclease RNAse E. Concerning NrsZ functions in P. aeruginosa PAOl, this sRNA was shown to trigger the swarming motility and the rhamnolipid biosurfactants production. This regulation is due to the NrsZ-mediated activation of rhlA expression, a gene encoding for an enzyme essential for swarming motility and rhamnolipids production. Interestingly, the SL I structure of NrsZ ensures its regulatory function on rhlA expression, suggesting that the similar SLs are the functional units of this modular sRNA. However, the regulatory mechanism of action of NrsZ on rhlA expression activation remains unclear and is currently being investigated. Additionally, the NrsZ regulatory network was investigated by a transcriptome analysis, suggesting that numerous genes involved in both primary and secondary metabolism are regulated by this sRNA. To emphasize the importance of NrsZ, we investigated its conservation in other Pseudomonas species and demonstrated that NrsZ is conserved and expressed under nitrogen limitation in Pseudomonas protegens Pf-5, Pseudomonas putida KT2442, Pseudomonas entomophila L48 and Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, strains having different ecological features, suggesting an important role of NrsZ in the adaptation of Pseudomonads to nitrogen starvation. Interestingly the architecture of the different NrsZ homologs is similarly composed by SL structures and variant spacer sequences. However, the number of SL repetitions is not identical, and one to six SLs were predicted on the different NrsZ homologs. Moreover, NrsZ is processed in short molecules in all the strains, similarly to what was previously observed in P. aeruginosa PAOl, and the heterologous expression of the NrsZ homologs restored rhlA expression, swarming motility and rhamnolipids production in the P. aeruginosa NrsZ mutant. In many aspects, NrsZ is an atypical sRNA in the bacterial panorama. To our knowledge, NrsZ is the first described sRNA induced by the NtrB/C. Moreover, its unique modular architecture and its processing in similar short SL molecules suggest that NrsZ belongs to a novel family of bacterial sRNAs. -- L'agent pathogène opportuniste et ubiquitaire Pseudomonas aeruginosa souche PAOl est une bactérie Gram négative versatile ayant l'extraordinaire capacité de coloniser différentes niches écologiques et de causer des infections sévères et persistantes chez l'être humain. Afin d'assurer une coordination optimale des gènes impliqués dans l'utilisation de différents nutriments, cette bactérie se sert de systèmes à deux composants tel que NtrB/C et CbrA/B afin de détecter la disponibilité des ressources nutritives, puis de réguler en conséquence l'expression des gènes impliqués dans leur importation et leur catabolisme. Le système NtrB/C régule l'utilisation des sources d'azote alors que le système CbrA/B est impliqué à la fois dans l'utilisation des sources de carbone et d'azote. Ces deux systèmes activent l'expression de leurs gènes-cibles de concert avec le facteur sigma alternatif RpoN. En outre, NtrB/C et CbrA/B régulent aussi le métabolisme secondaire, contrôlant notamment la production d'importants facteurs de virulence. En plus de toutes ces régulations génétiques fines ayant lieu au niveau transcriptionnel, P. aeruginosa est aussi capable de moduler son métabolisme en se servant de petits ARNs régulateurs non-codants (ARNncs), qui régulent l'expression génétique à un niveau post- transcriptionnel par divers mécanismes sophistiqués et contribuent à rendre particulièrement rapide l'adaptation physiologique de cette bactérie. Au cours de nos recherches sur de nouveaux ARNncs dépendant du facteur sigma RpoN et impliqués dans l'adaptation nutritionnelle de P. aeruginosa PAOl, nous avons découvert NrsZ (Nitrogen regulated sRNA), un ARNnc induit par la cascade NtrB/C-RpoN en condition de carence en azote. NrsZ a une architecture unique, composée de trois structures en tige- boucle (TB I, II et III) hautement similaires et séparées par des « espaceurs » ayant des séquences variables. De plus, cet ARNnc est clivé en petits fragments correspondant au trois molécules en tige-boucle, par un processus de clivage interne impliquant l'endoribonucléase RNase E. Concernant les fonctions de NrsZ chez P. aeruginosa PAOl, cet ARNnc est capable d'induire la motilité de type « swarming » et la production de biosurfactants, nommés rhamnolipides. Cette régulation est due à l'activation par NrsZ de l'expression de rhlA, un gène essentiel pour la motilité de type swarming et pour la production de rhamnolipides. Étonnamment, la structure TB I est capable d'assurer à elle seule la fonction régulatrice de NrsZ sur l'expression de rhlA, suggérant que ces molécules TBs sont les unités fonctionnelles de cet ARNnc modulaire. Cependant, le mécanisme moléculaire par lequel NrsZ active l'expression de rhlA demeure à ce jour incertain et est actuellement à l'étude. En plus, le réseau de régulations médiées par NrsZ a été étudié par une analyse de transcriptome qui a indiqué que de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme primaire ou secondaire seraient régulés par NrsZ. Pour accentuer l'importance de NrsZ, nous avons étudié sa conservation dans d'autres espèces de Pseudomonas. Ainsi, nous avons démontré que NrsZ est conservé et exprimé en situation de carence d'azote par les souches Pseudomonas protegens Pf-5, Pseudomonas putida KT2442, Pseudomonas entomophila L48, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, quatre espèces ayant des caractéristiques écologiques très différentes, suggérant que NrsZ joue un rôle important dans l'adaptation du genre Pseudomonas envers la carence en azote. Chez toutes les souches étudiées, les différents homologues de NrsZ présentent une architecture similaire faite de TBs conservées et d'espaceurs. Cependant, le nombre de TBs n'est pas identique et peut varier de une à six copies selon la souche. Les différentes versions de NrsZ sont clivées en petites molécules dans ces quatre souches, comme il a été observé chez P. aeruginosa PAOl. De plus, l'expression hétérologue des différentes variantes de NrsZ est capable de restaurer l'expression de rhlA, la motilité swarming et la production de rhamnolipides dans une souche de P. aeruginosa dont nrsZ a été inactivé. Par bien des aspects, NrsZ est un ARNnc atypique dans le monde bactérien. À notre connaissance, NrsZ est le premier ARNnc décrit comme étant régulé par le système NtrB/C. De plus, son unique architecture modulaire et son clivage en petites molécules similaires suggèrent que NrsZ appartient à une nouvelle famille d'ARNncs bactériens.

Comparison of naphthalene bioavailability determined by whole-cell biosensing and availability determined by extraction with Tenax

A rapid biological method for the determination of the bioavailability of naphthalene was developed and its value as an alternative to extraction-based chemical approaches demonstrated. Genetically engineered whole-cell biosensors are used to determine bioavailable naphthalene and their responses compared with results from Tenax extraction and chemical analysis. Results show a 1:1 correlation between biosensor results and chemical analyses for naphthalene-contaminated model materials and sediments, but the biosensor assay is much faster. This work demonstrates that biosensor technology can perform as well as standard chemical methods, though with some advantages including the inherent biological relevance of the response, rapid response time, and potential for field deployment. A survey of results from this work and the literature shows that bioavailability under non-equilibrium conditions nonetheless correlates well with K(oc) or K(d). A rationale is provided wherein chemical resistance is speculated to be operative.

Regulation of bistable ICEclc transfer in pseudomonas knackmussii B13

L'élément génétique intégratif et conjugatif auto-transférable de 103 kb qui se trouve dans le génome de Pseudomonas knackmussii B13 (ICEc/c) confère la capacité de dégrader le 3-chlorobenzoate et le 2-aminophénol. L'élément ICE c/c peut être transféré par conjugaison de la souche B13 à diverses bêta- et gamma- protéobactéries. Seule une sous-population de 3 à 5% des cellules transfère l'élément, les cellules dites "compétentes pour le transfert". L'acquisition de la compétence pour le transfert est vraisemblablement la conséquence d'une régulation bistable, conduisant une partie des cellules au transfert de l'élément ICE c/c tandis que, dans les autres, l'élément reste quiescent et ne se transfère pas. À ce jour, les mécanismes et les acteurs moléculaires qui régulent l'activation bistable de l'élément sont restés inconnus. Mon travail de doctorat visait à identifier les éléments bistables du régulon de la compétence pour le transfert et d'analyser les fondements moléculaires de la bistabilité de l'élément ICE c/c chez P. knackmussii. Le premier chapitre introduit le thème du transfert génétique horizontal avec un accent particulier sur les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE) et ICEcIc. L'état actuel des connaissances sur l'organisation génétique, la régulation, l'intégration et le transfert de différents modèles de ICEs est exposé en détail. En outre, je m'étends sur les phénomènes d'hétérogénéité et de bistabilité phénotyplques, qu'on peut distinguer dans une population isogénique dans des conditions de culture homogènes, et qui sont susceptibles de jouer un rôle dans le transfert de l'élément ICE c/c, dans la mesure où il ne s'active et n'est transférable que dans une très petite sous-population de cellules. Dans le chapitre 2, je présente une analyse globale des régions promotrices minimales des gènes appartenant au régulon de la compétence pour le transfert de l'élément ICE c/c. Nous avons étudié les caractéristiques d'expression des promoteurs et, s'ils s'avéraient bistables, leur activation dans le temps par comparaison avec le mutant lntB13. Pour ce faire, nous avons utilisé des fusions de promoteurs avec des gènes rapporteurs et testé l'expression bistable chez P. knackmussii par microscopie à épifluorescence. Pour six promoteurs présentant une expression bistable, nous avons employé de la microscopie temporelle pour déterminer la chronologie de leur expression par rapport à Pint et PinR. Parmi eux, nous avons identifié deux gènes exprimés précocement et trois gènes exprimés tardivement dans le processus d'acquisition de la compétence de transfert. Dans le chapitre 3, j'expose une analyse d'expression génétique pour l'un des groupes de gènes dont la transcription est la plus élevée dans la région conservée de ICE c/c, les gènes orf81655-orf68241 contenus dans une région de 14 kb. Nous montrons d'abord que cet opéron fait partie du même régulon bistable que intB13 et inrR et analysons les caractéristiques génétiques qui conduisent à une transcription élevée. Nous étudions les fonctions biologiques de ce groupe de gènes par des délétlons ciblées et montrons que certaines d'entre elles empêchent le transfert de l'élément. Nous approfondissons la caractérlsatlon de I'orf8l655 en construisant une fusion transcrlptionnelle avec le gène codant pour la protéine fluorescente verte (egfp) (en utilisant le système minl-Tn5). L'expression de Vorf81655 dans des cellules individuelles est comparée au signal mesuré par hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur le ARN messager du gène. En utilisant FISH, des délétlons du promoteur et de l'analyse directe de transcription, nous avons localisé la région promotrice du groupe de gènes. En outre, nous avons utilisé des mutations dirigées pour comprendre la bistabilité de cette région promotrice, caractérisée par une transcription très élevée et une traduction lente de l'ARN messager.  Dans le chapitre 4, nous nous efforçons de comprendre comment la bistabilité est générée au sein du régulon te de l'élément ICE c/c. Pour ce faire, nous avons tenté de reconstituer une expression bistable, dans un hôte qui ne présente pas de bistabilité naturellement, à partir d'éléments génétiques individuels. L'hôte choisi est Pseudomonas putida dans lequel nous avons introduit une copie unique de Pint, PinR ou PaipA fusionnés à la egfp, construits qui permettent d'observer l'apparition de bistabilité. Nous avons ensuite construit différents assemblages de composants génétiques de l'élément ICE c/c, en nous concentrant sur la région parA-inrR. En effet, nous avons pu démontrer qu'une expression bistable apparaît dans P. putida grâce à ces éléments en l'absence de l'élément ICE c/c complet. À noter que la plupart des construits génétiques activent PaipA ou P|,,R, mais qu'un seul recrée la bistabilité de Pint, ce qui suggère que la région parA-inrR permet à la fois d'engendrer la bistabilité et d'opérer la transition entre les promoteurs précoces et les promoteurs tardifs du régulon de la bistabilité. Dans le chapitre 5, nous concluons sur une discussion de la pertinence de nos résultats et sur de futures perspectives de recherche. -- The 103-kb self-transmissible integrative and conjugative element (ICE) of Pseudomonas knackmussii B13 (ICEc/c) confers the capacity to degrade 3- chlorobenzoate and 2-aminophenol. ICEc/c can be conjugated from strain B13 to a variety of Beta- and Gammaproteobacteria. Interestingly, ICE c/c transfer is observed in a subpopulatlon of cells (3-5%) only, the so-called 'transfer competent' cells. The formation of transfer competence (tc) is thought to be the consequence of a 'bistable' decision, which forces those cells to follow the developmental path which leads to ICEc/c transfer, whereas in others ICE c/c remains silent and does not transfer. So far, the mechanisms and molecular partners generating this bistable transfer activation in cells of P. knackmussii B13 remain mostly unidentified. This thesis aimed at understanding the extent of the tc bistability regulon and to dissect the molecular basis of bistabillty formation of ICEc/c in P. knackmussii. The first chapter is a general Introduction on horizontal gene transfer (HGT) with particular emphasis on ICEs and ICE c/c. The emphasis is made on the current knowledge about the HGT gene organization, regulation and specific integration and transfer aspects of the different ICEs models. Furthermore, I focus on the phenomena of phenotypic heterogeneity and bistability (the property of two distinguishable phenotypes existing within an isogenic population under homogeneous conditions), which may play a particular role in ICEc/c behaviour, since ICE activation and transfer only occurs in a very small subpopulation of cells. In Chapter Two, I focus on a global analysis of the different core promoters that might belong to the ICEc/c tc pathway regulon. We studied both expression patterns of ICEc/c promoters and, once being identified as "bistable", their temporal activation compared to that of intB13. In order to do this, we used promoter reporter fusions and tested blstability expression in P. knackmussii using epifluorescence microscopy. For the 6 promoters that showed bistable expression, we used time-lapse microscopy to study the timing of promoter expression in comparison to that of P,,,t or PlnR. We could establish two "early" and 3 "late" phase promoters in the process of transfer competence. In Chapter Three, I focused my attention on analysis of gene expression of one of the most highly transcribed gene clusters in the conserved core region of ICEc/c, a 14-kb gene cluster formed by the genes orf81655-orf68241. First we showed that this operon is part of the same bistability 'regulon' as intB13 and inrR, and analysed the genetic features that lead to high transcription. We studied the potential biological function of this cluster for ICE c/c by making specific gene deletions, showing that some interrupt ICEc/c transfer. We further analysed the orfdl655 promoter by constructing transcriptional egfp fusion reporter strains using the miniTn5 delivery system. Expression of the orf81655 promoter in single cells was compared to signals measured by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) on orfSl655 mRNA. We localized the promoter region of the gene cluster using FISH, promoter deletions, and by direct transcript analysis. We further used site-directed mutagenesis to understand the bistability character of the promoter region and the extremely high transcription but low translation from this mRNA. In Chapter Four, we set out to understand how bistability is generated in the tc pathway of ICEc/c. For this we tried rebuilding bistable expression from ICEc/c individual gene components in a host, which normally does not display bistability. As host we used P. putida without ICEc/c but with a single copy Pint-, PlnR- or PalpA- egfp fusion that enabled us to verify bistability formation. Subsequently, we built different assemblages of ICEc/c gene components, focusing on the parA-inrR region. Indeed, we found that bistable expression can be build from those components in P. putida without ICEc/c. Interestingly, most genetic constructs activated PaipA or PlnR, but only one resulted in bistable activation of PinT. This suggests that the parA-inrR region acts as a bistability "generator", but also as a bistability "relay" from early to late promoters in the tc pathway hierarchy. In the final fifth chapter, we conclude with a discussion of the relevance of the present thesis and the resulting perspectives for future studies.

A New Large-DNA-Fragment Delivery System Based on Integrase Activity from an Integrative and Conjugative Element.

During the past few decades, numerous plasmid vectors have been developed for cloning, gene expression analysis, and genetic engineering. Cloning procedures typically rely on PCR amplification, DNA fragment restriction digestion, recovery, and ligation, but increasingly, procedures are being developed to assemble large synthetic DNAs. In this study, we developed a new gene delivery system using the integrase activity of an integrative and conjugative element (ICE). The advantage of the integrase-based delivery is that it can stably introduce a large DNA fragment (at least 75 kb) into one or more specific sites (the gene for glycine-accepting tRNA) on a target chromosome. Integrase recombination activity in Escherichia coli is kept low by using a synthetic hybrid promoter, which, however, is unleashed in the final target host, forcing the integration of the construct. Upon integration, the system is again silenced. Two variants with different genetic features were produced, one in the form of a cloning vector in E. coli and the other as a mini-transposable element by which large DNA constructs assembled in E. coli can be tagged with the integrase gene. We confirmed that the system could successfully introduce cosmid and bacterial artificial chromosome (BAC) DNAs from E. coli into the chromosome of Pseudomonas putida in a site-specific manner. The integrase delivery system works in concert with existing vector systems and could thus be a powerful tool for synthetic constructions of new metabolic pathways in a variety of host bacteria.

Design of new promoters and of a dual-bioreporter based on cross-activation by the two regulatory proteins XylR and HbpR.

The HbpR protein is the sigma54-dependent transcription activator for 2-hydroxybiphenyl degradation in Pseudomonas azelaica. The ability of HbpR and XylR, which share 35% amino acid sequence identity, to cross-activate the PhbpC and Pu promoters was investigated by determining HbpR- or XylR-mediated luciferase expression and by DNA binding assays. XylR measurably activated the PhbpC promoter in the presence of the effector m-xylene, both in Escherichia coli and Pseudomonas putida. HbpR weakly stimulated the Pu promoter in E. coli but not in P. azelaica. Poor HbpR-dependent activation from Pu was caused by a weak binding to the operator region. To create promoters efficiently activated by both regulators, the HbpR binding sites on PhbpC were gradually changed into the XylR binding sites of Pu by site-directed mutagenesis. Inducible luciferase expression from mutated promoters was tested in E. coli on a two plasmid system, and from mono copy gene fusions in P. azelaica and P. putida. Some mutants were efficiently activated by both HbpR and XylR, showing that promoters can be created which are permissive for both regulators. Others achieved a higher XylR-dependent transcription than from Pu itself. Mutants were also obtained which displayed a tenfold lower uninduced expression level by HbpR than the wild-type PhbpC, while keeping the same maximal induction level. On the basis of these results, a dual-responsive bioreporter strain of P. azelaica was created, containing both XylR and HbpR, and activating luciferase expression from the same single promoter independently with m-xylene and 2-hydroxybiphenyl.

Role of bacterial biomass in the sorption of Ni by biomass-birnessite assemblages

Birnessites precipitated by bacteria are typically poorly crystalline Mn(IV) oxides enmeshed within biofilms to form complex biomass-birnessite assemblages. The strong sorption affinity of bacteriogenic birnessites for environmentally important trace metals is relatively well understood mechanistically, but the role of bacterial cells and extracellular polymeric substances appears to vary among trace metals. To assess the role of biomass definitively, comparison between metal sorption by biomass at high metal loadings in the presence and absence of birnessite is required. We investigated the biomass effect on Ni sorption through laboratory experiments utilizing the birnessite produced by the model bacterium, Pseudomonas putida. Surface excess measurements at pH 6?8 showed that birnessite significantly enhanced Ni sorption at high loadings (up to nearly 4-fold) relative to biomass alone. This apparent large difference in affinity for Ni between the organic and mineral components was confirmed by extended X-ray absorption fine structure spectroscopy, which revealed preferential Ni binding to birnessite cation vacancy sites. At pH >= 7, Ni sorption involved both adsorption and precipitation reactions. Our results thus support the view that the biofilm does not block reactive mineral surface sites; instead, the organic material contributes to metal sorption once high-affinity sites on the mineral are saturated.

Analysis of the alternative pathways for the beta-oxidation of unsaturated fatty acids using transgenic plants synthesizing polyhydroxyalkanoates in peroxisomes.

Degradation of fatty acids having cis-double bonds on even-numbered carbons requires the presence of auxiliary enzymes in addition to the enzymes of the core beta-oxidation cycle. Two alternative pathways have been described to degrade these fatty acids. One pathway involves the participation of the enzymes 2, 4-dienoyl-coenzyme A (CoA) reductase and Delta(3)-Delta(2)-enoyl-CoA isomerase, whereas the second involves the epimerization of R-3-hydroxyacyl-CoA via a 3-hydroxyacyl-CoA epimerase or the action of two stereo-specific enoyl-CoA hydratases. Although degradation of these fatty acids in bacteria and mammalian peroxisomes was shown to involve mainly the reductase-isomerase pathway, previous analysis of the relative activity of the enoyl-CoA hydratase II (also called R-3-hydroxyacyl-CoA hydro-lyase) and 2,4-dienoyl-CoA reductase in plants indicated that degradation occurred mainly through the epimerase pathway. We have examined the implication of both pathways in transgenic Arabidopsis expressing the polyhydroxyalkanoate synthase from Pseudomonas aeruginosa in peroxisomes and producing polyhydroxyalkanoate from the 3-hydroxyacyl-CoA intermediates of the beta-oxidation cycle. Analysis of the polyhydroxyalkanoate synthesized in plants grown in media containing cis-10-heptadecenoic or cis-10-pentadecenoic acids revealed a significant contribution of both the reductase-isomerase and epimerase pathways to the degradation of these fatty acids.

Effect of two types of biosurfactants on phenanthrene availability to the bacterial bioreporter Burkholderia sartisoli strain RP037.

Biosurfactants are tensio-active agents that have often been proposed as a means to enhance the aqueous solubility of hydrophobic organic contaminants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Biosurfactant-producing bacteria such as those belonging to the genus Pseudomonas might therefore enhance PAH availability to PAH-degrading bacteria. We tested the effects of two types of biosurfactants produced by Pseudomonas sp., cyclic lipopeptides and rhamnolipids, on phenanthrene bioavailability. Bioavailability was judged from growth rates on phenanthrene and from specific induction of a phenanthrene-responsive GFP-reporter in Burkholderia sartisoli strain RP037. Co-culturing of strain RP037 with the lipopeptide-producing bacterium Pseudomonas putida strain PCL1445 enhanced GFP expression compared to a single culture, but this effect was not significantly different when strain RP037 was co-cultivated with a non-lipopeptide-producing mutant of P. putida. The addition of partially purified supernatant extracts from the P. putida lipopeptide producer equally did not unequivocally enhance phenanthrene bioavailability to strain RP037 compared to controls. In contrast, a 0.1% rhamnolipid solution strongly augmented RP037 growth rates on phenanthrene and led to a significantly larger proportion of cells in culture with high GFP expression. Our data therefore suggest that biosurfactant effects may be strongly dependent on the strain and type of biosurfactant.

Oxygen-sensing reporter strain of Pseudomonas fluorescens for monitoring the distribution of low-oxygen habitats in soil.

The root-colonizing bacterium Pseudomonas fluorescens CHA0 was used to construct an oxygen-responsive biosensor. An anaerobically inducible promoter of Pseudomonas aeruginosa, which depends on the FNR (fumarate and nitrate reductase regulation)-like transcriptional regulator ANR (anaerobic regulation of arginine deiminase and nitrate reductase pathways), was fused to the structural lacZ gene of Escherichia coli. By inserting the reporter fusion into the chromosomal attTn7 site of P. fluorescens CHA0 by using a mini-Tn7 transposon, the reporter strain, CHA900, was obtained. Grown in glutamate-yeast extract medium in an oxystat at defined oxygen levels, the biosensor CHA900 responded to a decrease in oxygen concentration from 210 x 10(2) Pa to 2 x 10(2) Pa of O(2) by a nearly 100-fold increase in beta-galactosidase activity. Half-maximal induction of the reporter occurred at about 5 x 10(2) Pa. This dose response closely resembles that found for E. coli promoters which are activated by the FNR protein. In a carbon-free buffer or in bulk soil, the biosensor CHA900 still responded to a decrease in oxygen concentration, although here induction was about 10 times lower and the low oxygen response was gradually lost within 3 days. Introduced into a barley-soil microcosm, the biosensor could report decreasing oxygen concentrations in the rhizosphere for a 6-day period. When the water content in the microcosm was raised from 60% to 85% of field capacity, expression of the reporter gene was elevated about twofold above a basal level after 2 days of incubation, suggesting that a water content of 85% caused mild anoxia. Increased compaction of the soil was shown to have a faster and more dramatic effect on the expression of the oxygen reporter than soil water content alone, indicating that factors other than the water-filled pore space influenced the oxygen status of the soil. These experiments illustrate the utility of the biosensor for detecting low oxygen concentrations in the rhizosphere and other soil habitats.

Sensing, uptake and response to c4-dicarboxylic acids in pseudomonas aeruginosa pao1

C4-dicarboxylates are one of the preferred carbon and energy sources for the growth of P. aeruginosa, a ubiquitous and metabolically versatile bacterium. However, despite their importance, C4-dicarboxylates sensing and uptake systems were poorly understood in P. aeruginosa and only little information was available in the literature. In our work, the C4-dicarboxylate transport (Dct) system in P. aeruginosa was found to be composed of a novel two-component system, called DctB/DctD, regulating together with the sigma factor RpoN the expression of two newly identified C4-dicarboxylate transporters: DctA and DctPQM. Inactivation of the dct A, dctB or dctD gene caused a growth defect of the strain in minimal media supplemented with succinate, fumarate or malate, indicating their major role in Dct. However, residual growth of the dctA mutant in these media suggested the presence of redundant C4-dicarboxylate transporter(s). Tn5 insertion mutagenesis of the kdctA mutant, combined with a screening for growth on succinate, led to the identification of a second Dct system, the DctPQM transporter, belonging to the tripartite ATP-independent periplasmic (TRAP) family of carriers. AdctAAdctPQM double mutant showed no growth on malate and fumarate albeit residual growth on succinate suggested that additional transporters for succinate are present. Competition experiments demonstrated that the DctPQM carrier was more efficient than the DctA carrier for the utilization of succinate at μΜ concentrations, whereas DctA was the major transporter at mM concentrations. For the first time, high- and low-affinity uptake systems for succinate (DctA and DctPQM) are reported to function co-ordinately to transport C4- dicarboxylates. Most probably, the presence of redundant uptake systems contributes to the versatility of this bacterium. Next, the regulation of the Dct system was investigated. While performing a parallel study about the carbon catabolite repression (CCR) phenomenon in P. aeruginosa, a link between the CCR cascade (CbrAB/CrcZ/Crc) and the Dct system was observed. Crc is a translational repressor acting when preferred carbon sources (like C4-dicarboxylates) are present. CrcZ is a small RNA acting as a functional antagonist of Crc and induced by the CbrA/CbrB two-component system when non preferred carbon sources (like mannitol) are utilized. Novel targets of the CbrAB/CrcZ/Crc system in P. aeruginosa were identified using transcriptome analysis; among them dctA and dctPQM were detected. CCR is regulating the dct transporter genes expression depending on the succinate concentrations in the medium of growth; this modulation of CCR is possible because, at the same time, succinate concentrations tune CCR. In a medium containing high succinate concentrations, CrcZ levels were low and therefore Crc inhibited the translation of mRNA targets. Whereas in a medium containing low succinate concentrations, the subsequent increase of CrcZ levels sequestered Crc, inhibiting its activity. This model shows for the first time that CCR possesses a feedback-based circuitry, a very important type of regulatory loop that confers the best adaptive response under changing environmental conditions. The expression of the dct transporter genes is also found to be regulated by the RNA chaperone protein Hfq. Hfq has the same post-transcriptional effect than Crc at high concentration of succinate, i.e. inhibiting dctP and dctR and indirectly favouring dctA expression. Moreover, an additional indirect positive regulation of dctP expression by Hfq was found. Finally, a metabolome approach was performed to investigate the internal signals modulating CCR via induction of CbrA activity in P. aeruginosa PAOl and P. putida KT2442. The results of the analysis are currently under study in the laboratory. - Les acides C4-dicarboxyliques font partie des sources de carbone et d'énergie préférés de P. aeruginosa, une bactérie versatile et ubiquitaire. Néanmoins, malgré leur importance, comment la présence des acides C4-dicarboxyliques dans le milieu est sentie par la bactérie et comment ils sont transportés dans la cellule chez P. aeruginosa n'étaient pas connus. De plus, peu d'informations sur ces procédés ont été répertoriées dans la littérature. Grace à notre travail, le système de transport des acides C4-dicarboxyliques (Dct) chez P. aeruginosa a pu être caractérisé. En effet, il est composé d'un nouveau système à deux composants, nommé DctB/DctD, qui régule, en combinaison avec le facteur sigma alternatif RpoN, l'expression des deux nouveaux transporteurs des acides C4-dicarboxyliques: DctA et DctPQM. L'inactivation des gènes dctA, dctB or dctD cause un défaut de croissance des souches mutantes dans un milieu minimum contenant du succinate, fumarate ou malate; confirmation de leur rôle dans le Dct. Cependant, une croissance résiduelle du mutant dctA dans ces milieux suggérerait une redondance des transporteurs d'acides Grdicarboxyliques. Une expérience de mutagenèse dans la souche AdctA, utilisant le transposon Tn5, combiné avec un criblage génétique sur la croissance dans le succinate, nous a permis d'identifier le deuxième transporteur DctPQM. DctPQM appartient à la famille des transporteurs TRAP (tripartite ATP-independent periplasmic). Un double mutant AdctAAdctPQM ne pousse pas dans du malate ou fumarate mais par contre présente une croissance résiduelle dans le succinate suggérant l'existence de transporteurs supplémentaires pour le succinate. En réalisant des expériences de compétitions nous avons démontré que le transporteur DctPQM est plus efficace que le transporteur DctA pour l'utilisation de succinate à une concentration de l'ordre du μΜ. Par contre, DctA est le transporteur le plus important pour une concentration de succinate de l'ordre du raM. Pour la première fois, deux systèmes de transport, un avec une forte- et un avec une faible-affinité (DctA et DctPQM) pour le succinate, sont coordonnés dans leur activité de transport des acides C4- dicarboxyliques, probablement contribuant à la versatilité de la bactérie. Ensuite, nous avons étudié la régulation du system Dct. En effectuant, en parallèle, une étude sur le phénomène de la répression catabolique (RC) chez P. aeruginosa, un lien entre la RC et le système Dct a été observé. La cascade des régulateurs formant la RC est composée de CbrA/CbrB, CrcZ et Crc. Crc est un répresseur traductionnel qui agit quand des sources de carbone préférées (comme les acides C4-dicarboxyliques) sont présentes dans le milieu. CrcZ est un petit ARN non-codant qui agit comme antagoniste de Crc. L'expression de CrcZ est induite par le système à deux composants CbrA/CbrB lorsque une source de carbone non-préférée est utilisée (comme le mannitol). Des nouvelles cibles du système CbrAB/CrcZ/Crc chez P. aeruginosa ont été identifiées grâce à une analyse du transcriptome des souches mutantes des régulateurs de la cascade. Parmi les cibles identifiées, les gènes dctA et dctPQM étaient présents. La RC régule l'expression des transporteurs dct en fonction de la concentration de succinate dans le milieu de croissance. Cette régulation est possible parce que, en même temps, les acides C4- dicarboxyliques régulent la RC. Dans un milieu contenant une grande concentration du succinate, le niveau d'expression de CrcZ est faible, donc Crc peut inhiber l'expression de ces ARN messagers cibles. Par contre, dans un milieu avec une faible concentration de succinate, l'augmentation de l'expression de CrcZ titre Crc et inhibe son activité. Ce modèle de régulation rétroactive est très important pour le phénomène de la RC, parce qu'il permet à la bactérie d'accorder une meilleure réponse à un changement environnemental. L'expression des gènes codant pour les transporteurs dct sont aussi régulés par la protéine chaperonne d'ARN Hfq. Hfq semble avoir le même effet traductionnelle que Crc, lorsqu'il y a une forte concentration de succinate. Nous avons ainsi observé une régulation négative de l'expression du gène dct Ρ et dctR, qui code pour un répresseur de la transcription de dctA. Nous avons aussi observé une régulation positive de la transcription de dctP par Hfq, probablement de façon indirecte. Enfin, une analyse du metabolome a était utilisée pour chercher les signaux internes modulant la RC et, en particulier, l'activité de la protéine senseur CbrA chez P. aeruginosa PAOl et P. putida KT2442. Les résultats de l'analyse sont en cours d'étude dans le laboratoire.