Optimisation du transfert de gènes dans la rétine par des vecteurs lentiviraux lors de maladies dégénératives de la rétine

Certaines dégénérescences rétiniennes sont engendrées par des mutations¦génétiques et conduisent à la perte des cellules photosensibles, les¦photorécepteurs (cônes et/ou bâtonnets), et donc à la cécité (Roy et al., 2010).¦La prévalence est de 1/3000 chez les Caucasiens. Les Rétinites Pigmentaires¦(RP) en composent la majorité des cas, suivent l'Amaurose congénitale de¦Leber et la maladie de Stargardt. Il n'y a pas une mutation type associés à une¦maladie mais diverses mutations peuvent aboutir à une dégénérescence de la¦rétine. Tout comme le reste du système nerveux central, la rétine lésée n'a pas¦les capacités de se régénérer. Un objectif du traitement est de ralentir la¦dégénérescence de la rétine dans le but de la stabiliser. La thérapie génique¦constitue actuellement la seule approche thérapeutique à même de traiter les¦dégénérescences rétiniennes d'origine génétique. Elle consiste à utiliser un virus¦modifié, qui n'a plus les capacités de se reproduire, appelé vecteur pour cibler¦certaines cellules afin d'ajouter un gène sain ou d'inhiber un gène malade. Les¦virus associés à l'adénovirus (AAV) et les Lentivirus (LV) sont les 2 principaux¦types de virus utilisés en thérapie génique en ophtalmologie. D'autres vecteurs¦existent, comme les adénovirus et le virus de l'anémie infectieuse équine. Des¦études de thérapie génique effectuées chez l'homme avec le vecteur AAV ont¦démontré une sensible amélioration des fonctions visuelles (acuité visuelle,¦champ visuel, pupillométrie et le déplacement dans un environnement avec une¦lumière tamisée) chez des patients atteints d'Amaurose congénitale de Leber¦(Maguire et al., Ali et al., Hauswirth et al., Bennett et al.). Le vecteur utilisé au¦cours de ce travail est un LV, qui a pour avantage de pouvoir transporter de¦grands gènes. Lorsque ce vecteur est pseudotypé avec une enveloppe VSVG, il¦transduit (transférer un gène qui sera fonctionnel dans la cellule cible) bien¦l'épithélium pigmentaire rétinien (nécessaire à la survie et à la fonction des¦photorécepteurs). Afin de changer le tropisme du vecteur, celui testé dans cette¦étude contient une enveloppe de type Mokola qui cible efficacement les cellules¦gliales du cerveau et donc probablement aussi les cellules de Müller de la rétine.¦Le but à court terme est de transformer génétiquement ces cellules pour leur¦faire sécréter des molécules favorisant la survie des photorécepteurs. Pour¦révéler la cellule ciblée par le vecteur, le gène qui sera exprimé dans les cellules¦transduites code pour la protéine fluorescente verte 2 (GFPII) et n'a pas de¦fonction thérapeutique. Après avoir produit le virus, deux types de souris ont été¦injectées : des souris dépourvues du gène de la rhodopsine appelées Rho -/- et¦des souris sauvages appelées C57BL6. Les souris Rho -/- ont été choisies en¦tant que modèle de dégénérescence rétinienne et les souris C57BL6 en tant que¦comparatif. Les souris Rho -/- et C57BL56 ont été injectées entre le 2ème et le¦3ème mois de vie et sacrifiées 7 jours après. Des coupes histologiques de la rétine¦ont permis de mesurer et comparer pour chaque oeil, les distances de¦transduction du RPE et de la neurorétine (= toute la rétine sauf le RPE). La¦distance sur laquelle le RPE est transduit détermine la taille de la bulle¦d'injection alors que la distance sur laquelle la neurorétine est transduite¦détermine la capacité du vecteur à diffuser dans la rétine. Les résultats montrent¦une expression plus importante de la GFPII dans le RPE que dans la neurorétine¦chez les souris Rho -/- et C57BL6. Les principales cellules transduites au¦niveau de la neurorétine sont, comme attendu, les cellules de Müller. Lorsque¦l'on compare les proportions de neurorétine et de RPE transduites, on constate¦qu'il y a globalement eu une meilleure transduction chez les souris Rho -/-¦que chez les souris C57BL6. Cela signifie que le vecteur est plus efficace pour¦transduire une rétine dégénérée qu'une rétine saine. Pour déterminer quels types¦de cellules exprimaient la GFPII, des anticorps spécifiques de certains types de¦cellules ont été utilisés. Ces résultats sont similaires à ceux d'autres études¦effectuées précédemment, dont celle de Calame et al. en 2011, et tendent à¦prouver que le vecteur lentiviral avec l'enveloppe Mokola et le promoteur EFs¦est idéal pour transduire avec un gène thérapeutique des cellules de Müller dans¦des rétines en dégénérescence.

Pratiquer la religion ensemble : analyse des paroisses et communautés religieuses en Suisse dans une perspective de sociologie des organisations

RESUMÉ DE LA THÈSE EN FRANÇAIS La présente recherche se veut être un examen de la première enquête quantitative menée en Suisse sur les paroisses et communautés religieuses. La recherche vise de à appréhender la dynamique institutionnelle du champ religieux de ce pays. En relation avec une enquête similaire menée aux États-Unis (National Congregations Study, Chaves, 2004) la présente recherche analyse les données récoltées auprès d'un échantillon représentatif de plus de mille responsables spirituels des communautés religieuses de Suisse. Dans la perspective de la sociologie des organisations, elle examine le positionnement des communautés dans le champ institutionnel pour comprendre comment elles s'activent pour se maintenir dans la durée. Les communautés, pour assurer leurs services sur le long terme, sont imbriquées dans des structures confessionnelles avec des contraintes administratives diverses selon leur reconnaissance légale. En conséquence, la dynamique du champ religieux institutionnel est différenciée en trois environnements, selon leur degré de reconnaissance, qui demandent des réponses particulières à chacun pour pouvoir s'adapter et perdurer. Ces trois environnements poussent les groupes qui s'y logent à adopter des structures identiques. Pratiquer la religion ensemble, c'est ainsi se rendre dans une communauté avec une forme de rituel et d'engagement des membres correspondant à la reconnaissance du groupe par la société. Même pratiquée fortuitement, la religion collective est loin d'être un acte fortuit. RESUMÉ DE LA THÈSE EN ANGLAIS Practice the religion together Analysis of parishes and religious congregations in Switzerland in a perspective of sociology of organization This research is intended as a review of the first quantitative survey conducted in Switzerland on parishes and religious communities. The research aims to understand the dynamics of institutional religious field in this country. In connection with a similar survey conducted in the U.S. (National Congregations Study, Chaves, 2004) this research examines data gathered from a representative sample of over a thousand spiritual leaders of religious communities in Switzerland. From the perspective of sociology of organization, it examines the position of communities in the institutional field to understand how they are activated to maintain over time. Communities to ensure their services over the long term, are nested within denominational structures with different administrative constraints according to their legal recognition. Consequently, the dynamics of the religious field is differentiated into three institutional environments according to their degree of recognition, which require specific responses to each in order to adapt and endure. These three environments grow groups staying there to adopt identical structures.

Etude des propriétés dynamiques de la sécrétion régulée des vésicules glutamatergiques des astrocytes

RESUME GRAND PUBLICLe cerveau est composé de différents types cellulaires, dont les neurones et les astrocytes. Faute de moyens pour les observer, les astrocytes sont très longtemps restés dans l'ombre alors que les neurones, bénéficiant des outils ad hoc pour être stimulés et étudiés, ont fait l'objet de toutes les attentions. Le développement de l'imagerie cellulaire et des outils fluorescents ont permis d'observer ces cellules non électriquement excitables et d'obtenir des informations qui laissent penser que ces cellules sont loin d'être passives et participent activement au fonctionnement cérébral. Cette participation au fonctionnement cérébral se fait en partie par le biais de la libération de substances neuro-actives (appellées gliotransmetteurs) que les astrocytes libèrent à proximité des synapses permettant ainsi de moduler le fonctionnement neuronal. Cette libération de gliotransmetteurs est principalement causée par l'activité neuronale que les astrocytes sont capables de sentir. Néanmoins, nous savons encore peu de chose sur les propriétés précises de la libération des gliotransmetteurs. Comprendre les propriétés spatio-temporelles de cette libération est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. En utilisant des outils fluorescents récemment développés et en combinant différentes techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu obtenir des informations très précises sur la libération de ces gliotransmetteurs par les astrocytes. Nous avons ainsi confirmé que cette libération était un processus très rapide et qu'elle était contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit une organisation complexe de la machinerie supportant la libération des gliotransmetteurs. Cette organisation complexe semble être à la base de la libération extrêmement rapide des gliotransmetteurs. Cette rapidité de libération et cette complexité structurelle semblent indiquer que les astrocytes sont des cellules particulièrement adaptées à une communication rapide et qu'elles peuvent, au même titre que les neurones dont elles seraient les partenaires légitimes, participer à la transmission et à l'intégration de l'information cérébrale.RESUMEDe petites vésicules, les « SLMVs » ou « Synaptic Like MicroVesicles », exprimant des transporteurs vésiculaires du glutamate (VGluTs) et libérant du glutamate par exocytose régulée, ont récemment été décrites dans les astrocytes en culture et in situ. Néanmoins, nous savons peu de chose sur les propriétés précises de la sécrétion de ces SLMVs. Contrairement aux neurones, le couplage stimulussécrétion des astrocytes n'est pas basé sur l'ouverture des canaux calciques membranaires mais nécessite l'intervention de seconds messagers et la libération du calcium par le reticulum endoplasmique (RE). Comprendre les propriétés spatio-temporelles de la sécrétion astrocytaire est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. Nous avons utilisé des outils fluorescents récemment développés pour étudier le recyclage des vésicules synaptiques glutamatergiques comme les colorants styryles et la pHluorin afin de pouvoir suivre la sécrétion des SLMVs à l'échelle de la cellule mais également à l'échelle des évènements. L'utilisation combinée de l'épifluorescence et de la fluorescence à onde évanescente nous a permis d'obtenir une résolution temporelle et spatiale sans précédent. Ainsi avons-nous confirmé que la sécrétion régulée des astrocytes était un processus très rapide (de l'ordre de quelques centaines de millisecondes). Nous avons découvert que cette sécrétion est contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit des compartiments cytosoliques délimités par le RE à proximité de la membrane plasmique et contenant les SLMVs. Cette organisation semble être à la base du couplage rapide entre l'activation des GPCRs et la sécrétion. L'existence de compartiments subcellulaires indépendants permettant de contenir les messagers intracellulaires et de limiter leur diffusion semble compenser de manière efficace la nonexcitabilité électrique des astrocytes. Par ailleurs, l'existence des différents pools de vésicules recrutés séquentiellement et fusionnant selon des modalités distinctes ainsi que l'existence de mécanismes permettant le renouvellement de ces pools lors de la stimulation suggèrent que les astrocytes peuvent faire face à une stimulation soutenue de leur sécrétion. Ces données suggèrent que la libération de gliotransmetteurs par exocytose régulée n'est pas seulement une propriété des astrocytes en culture mais bien le résultat d'une forte spécialisation de ces cellules pour la sécrétion. La rapidité de cette sécrétion donne aux astrocytes toutes les compétences pour pouvoir intervenir de manière active dans la transmission et l'intégration de l'information.ABSTRACTRecently, astrocytic synaptic like microvesicles (SLMVs), that express vesicular glutamate transporters (VGluTs) and are able to release glutamate by Ca2+-dependent regulated exocytosis, have been described both in tissue and in cultured astrocytes. Nevertheless, little is known about the specific properties of regulated secretion in astrocytes. Important differences may exist between astrocytic and neuronal exocytosis, starting from the fact that stimulus-secretion coupling in astrocytes is voltage independent, mediated by G-protein-coupled receptors and the release of Ca2+ from internal stores. Elucidating the spatiotemporal properties of astrocytic exo-endocytosis is, therefore, of primary importance for understanding the mode of communication of these cells and their role in brain signaling. We took advantage of fluorescent tools recently developed for studying recycling of glutamatergic vesicles at synapses like styryl dyes and pHluorin in order to follow exocytosis and endocytosis of SLMVs at the level of the entire cell or at the level of single event. We combined epifluorescence and total internal reflection fluorescence imaging to investigate, with unprecedented temporal and spatial resolution, the events underlying the stimulus-secretion in astrocytes. We confirmed that exo-endocytosis process in astrocytes proceeds with a time course on the millisecond time scale. We discovered that SLMVs exocytosis is controlled by local and fast Ca2+ elevations; indeed submicrometer cytosolic compartments delimited by endoplasmic reticulum (ER) tubuli reaching beneath the plasma membrane and containing SLMVs. Such complex organization seems to support the fast stimulus-secretion coupling reported here. Independent subcellular compartments formed by ER, SLMVs and plasma membrane containing intracellular messengers and limiting their diffusion seem to compensate efficiently the non-electrical excitability of astrocytes. Moreover, the existence of two pools of SLMVs which are sequentially recruited suggests a compensatory mechanisms allowing the refill of SLMVs and supporting exocytosis process over a wide range of multiple stimuli. These data suggest that regulated secretion is not only a feature of cultured astrocytes but results from a strong specialization of these cells. The rapidity of secretion demonstrates that astrocytes are able to actively participate in brain information transmission and processing.

Autonomie et vulnérabilité : état des lieux et essai d'articulation

Résumé Ce travail a commencé avec une confrontation entre les pensées de P. Ricoeur et E. Levinas sur le thème du rapport à autrui, cette confrontation portant particulièrement sur la place accordée par Levinas, dans son éthique, au thème de la vulnérabilité (ainsi que sur celui de la passivité), tandis que P. Ricoeur reste, selon moi, prioritairement un philosophe de l'activité et qui met, dans la question du rapport à autrui, l'accent sur la reconnaissance de l'autre dans l'empire de ses capacités. Ce débat, et les points qui retenaient en particulier mon attention, m'ont semblé pouvoir être inséré dans le contexte plus large d'une opposition entre éthique de l'autonomie et éthique de la vulnérabilité sur la base de lectures que j'effectuais par ailleurs dans le domaine des éthiques féminines, ou de ce que l'on appelle les éthiques du « care ». Les éthiques féminines, qui se sont développées les 30 dernières années, veulent revenir sur ce qu'elles identifient comme le modèle anthropologique de la modernité, qui privilégie une approche de l'homme en termes d'activité, de rationalité et d'autonomie au mépris d'autres traits comme la passivité, l'affectivité, la dépendance ou la vulnérabilité. Sans nier la rationalité ou l'autonomie de l'homme, elles veulent plutôt compléter une image qu'elles considèrent comme étant incomplète. Sur la base de leur anthropologie alternative, les auteurs qui appartiennent à ce courant proposent une nouvelle définition de l'éthique. Les éthiques du « care » se situent d'une manière générale dans une relation critique avec les éthiques de la justice comme avec les conceptions de l'agent et du patient moral héritées de la philosophie kantienne. Disons brièvement que, plutôt que de faire de l'autonomie et de son respect l'axe de leur réflexion morale, les éthiciennes du « care » insistent sur la signification morale de nos rapports de responsabilité ou de sollicitude à l'égard des personnes vulnérables. Dans la première partie de ma thèse, je reviens sur la genèse de la notion d'autonomie dans la philosophie morale et politique de la pré-modernité, en mettant le développement de ce concept en lien non seulement avec ce que J. Scheewind appelle les « morales de l'autogouvernement », mais aussi avec la naissance des philosophies du sujet et un mouvement général d'intériorisation des sources morales. J'essaye ensuite de dégager le sens de l'idée d'autonomie, sur la base de la notion de liberté positive élaborée par Berlin, avant de distinguer ses différentes significations (autonomie politique, personnelle, morale/autonomie procédurale vs substantielle, autonomie comme capacité, comme droit ou comme idéal). Je me concentre particulièrement sur la conception hiérarchique de l'autonomie personnelle développée par Frankfurt et Dworkin, avant de revenir à la conception kantienne de l'autonomie morale. Je consacre ensuite une section aux conceptions relationnelles de l'autonomie, ce qui me permet de faire le lien avec le thème de la vulnérabilité. Pour le développement historique de cette notion dans la pensée contemporaine, j'insiste, outre sur les éthiques du « care », sur les développements de la bioéthique et la philosophie de H. Jonas. Après un travail de définition du concept de vulnérabilité, j'élabore les éléments d'une éthique de la vulnérabilité que j'essaie d'articuler à la notion d'autonomie. Dans la deuxième partie, je confronte les éthiques de Ricoeur et de Levinas dans la perspective de l'opposition autonomie/vulnérabilité, en montrant leurs limites respectives.