Development of metabolic labeling strategies to study changes in protein expression

Résumé : Les progrès techniques de la spectrométrie de masse (MS) ont contribué au récent développement de la protéomique. Cette technique peut actuellement détecter, identifier et quantifier des milliers de protéines. Toutefois, elle n'est pas encore assez puissante pour fournir une analyse complète des modifications du protéome corrélées à des phénomènes biologiques. Notre objectif était le développement d'une nouvelle stratégie pour la détection spécifique et la quantification des variations du protéome, basée sur la mesure de la synthèse des protéines plutôt que sur celle de la quantité de protéines totale. Pour cela, nous volions associer le marquage pulsé des protéines par des isotopes stables avec une méthode d'acquisition MS basée sur le balayage des ions précurseurs (precursor ion scan, ou PIS), afin de détecter spécifiquement les protéines ayant intégré les isotopes et d'estimer leur abondance par rapport aux protéines non marquées. Une telle approche peut identifier les protéines avec les plus hauts taux de synthèse dans une période de temps donnée, y compris les protéines dont l'expression augmente spécifiquement suite à un événement précis. Nous avons tout d'abord testé différents acides aminés marqués en combinaison avec des méthodes PIS spécifiques. Ces essais ont permis la détection spécifique des protéines marquées. Cependant, en raison des limitations instrumentales du spectromètre de masse utilisé pour les méthodes PIS, la sensibilité de cette approche s'est révélée être inférieure à une analyse non ciblée réalisée sur un instrument plus récent (Chapitre 2.1). Toutefois, pour l'analyse différentielle de deux milieux de culture conditionnés par des cellules cancéreuses humaines, nous avons utilisé le marquage métabolique pour distinguer les protéines d'origine cellulaire des protéines non marquées du sérum présentes dans les milieux de culture (Chapitre 2.2). Parallèlement, nous avons développé une nouvelle méthode de quantification nommée IBIS, qui utilise des paires d'isotopes stables d'acides aminés capables de produire des ions spécifiques qui peuvent être utilisés pour la quantification relative. La méthode IBIS a été appliquée à l'analyse de deux lignées cellulaires cancéreuses complètement marquées, mais de manière différenciée, par des paires d'acides aminés (Chapitre 2.3). Ensuite, conformément à l'objectif initial de cette thèse, nous avons utilisé une variante pulsée de l'IBIS pour détecter des modifications du protéome dans des cellules HeLa infectée par le virus humain Herpes Simplex-1 (Chapitre 2.4). Ce virus réprime la synthèse des protéines des cellules hôtes afin d'exploiter leur mécanisme de traduction pour la production massive de virions. Comme prévu, de hauts taux de synthèse ont été mesurés pour les protéines virales détectées, attestant de leur haut niveau d'expression. Nous avons de plus identifié un certain nombre de protéines humaines dont le rapport de synthèse et de dégradation (S/D) a été modifié par l'infection virale, ce qui peut donner des indications sur les stratégies utilisées par les virus pour détourner la machinerie cellulaire. En conclusion, nous avons montré dans ce travail que le marquage métabolique peut être employé de façon non conventionnelle pour étudier des dimensions peu explorées en protéomique. Summary : In recent years major technical advancements greatly supported the development of mass spectrometry (MS)-based proteomics. Currently, this technique can efficiently detect, identify and quantify thousands of proteins. However, it is not yet sufficiently powerful to provide a comprehensive analysis of the proteome changes correlated with biological phenomena. The aim of our project was the development of ~a new strategy for the specific detection and quantification of proteomé variations based on measurements of protein synthesis rather than total protein amounts. The rationale for this approach was that changes in protein synthesis more closely reflect dynamic cellular responses than changes in total protein concentrations. Our starting idea was to couple "pulsed" stable-isotope labeling of proteins with a specific MS acquisition method based on precursor ion scan (PIS), to specifically detect proteins that incorporated the label and to simultaneously estimate their abundance, relative to the unlabeled protein isoform. Such approach could highlight proteins with the highest synthesis rate in a given time frame, including proteins specifically up-regulated by a given biological stimulus. As a first step, we tested different isotope-labeled amino acids in combination with dedicated PIS methods and showed that this leads to specific detection of labeled proteins. Sensitivity, however, turned out to be lower than an untargeted analysis run on a more recent instrument, due to MS hardware limitations (Chapter 2.1). We next used metabolic labeling to distinguish the proteins of cellular origin from a high background of unlabeled (serum) proteins, for the differential analysis of two serum-containing culture media conditioned by labeled human cancer cells (Chapter 2.2). As a parallel project we developed a new quantification method (named ISIS), which uses pairs of stable-isotope labeled amino acids able to produce specific reporter ions, which can be used for relative quantification. The ISIS method was applied to the analysis of two fully, yet differentially labeled cancer cell lines, as described in Chapter 2.3. Next, in line with the original purpose of this thesis, we used a "pulsed" variant of ISIS to detect proteome changes in HeLa cells after the infection with human Herpes Simplex Virus-1 (Chapter 2.4). This virus is known to repress the synthesis of host cell proteins to exploit the translation machinery for the massive production of virions. As expected, high synthesis rates were measured for the detected viral proteins, confirming their up-regulation. Moreover, we identified a number of human proteins whose synthesis/degradation ratio (S/D) was affected by the viral infection and which could provide clues on the strategies used by the virus to hijack the cellular machinery. Overall, in this work, we showed that metabolic labeling can be employed in alternative ways to investigate poorly explored dimensions in proteomics.

Analyse rétrospective de la prise en charge du cancer ovarien au Centre Hospitalier Universitaire Vaudois

Introduction:¦L'incidence annuelle du cancer de l'ovaire en Suisse est de 600 cas, il touche principalement les femmes âgées de plus de 60 ans. Le cancer de l'ovaire est aujourd'hui la 1ère cause de mortalité par cancer gynécologique chez la femme. Le but de notre recherche, est de créer une base de données de toutes les¦patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire et hospitalisées au CHUV pour la prise en charge de leur maladie.¦Cette étude rétrospective monocentrique nous permettra en premier lieu d'analyser les caractéristiques de¦cette tumeur présentées par les patientes, les traitements instaurés pour traiter ce cancer et les taux de¦récidives et de survie des patientes en fonction de ces variables.¦Méthodologie:¦Analyse rétrospective de 147 patientes diagnostiquées d'un cancer de l'ovaire et hospitalisées au CHUV entre¦septembre 2001 et mars 2010 pour la prise en charge de leur tumeur ovarienne. Utilisation du programme informatique ARCHIMED qui contient les dossiers médicaux de toutes les patientes inclues dans l'étude et création de 2 bases des données. La 1ère base de données regroupe l'ensemble des patientes de l'étude y¦compris les tumeurs type borderline, la 2ème base de données concerne uniquement les patientes ayant récidivé de leur tumeur. Les tumeurs bénignes ont été exclues de l'étude.¦Résultats:¦La probabilitéde survie à 1 an chez les patientes avec un cancer de l'ovaire, tous stades FIGO et prises en¦charge confondus, hospitalisées au CHUV est de 88,04% (95% CI = 0.7981-­‐0.9306), à 3 ans la probabilité de survie est de 70,4% (95% CI = 0.5864-­‐0.7936), et à plus de 5 ans, elle est de 60% (95% CI = 0.4315-­‐0.6859).¦Nous avons comparé le taux de survie en fonction du stade FIGO de la tumeur ovarienne et nous avons observé une différence significative de survie entre les stades FIGO précoces et les stades avancés (Pvaleur=¦0.0161).¦En plus d'une intervention chirurgicale, les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire sont normalement traitées par une chimiothérapie. Dans notre étude, 70 patientes ont bénéficié d'une chimiothérapie; un¦traitement adjuvant a été donné dans 78 % des cas (N = 55), un traitement néoadjuvant a été administré chez 22% des patientes (N=15). Le type combiné carboplatine-­‐taxane est la chimiothérapie la plus fréquente (75%). Au total sur l'étude, 66 patientes sur les 147 (44%) ont récidivé de leur tumeur. En ce qui¦concerne leur prise en charge, 46% des patientes ont reçu une chimiothérapie unique comme du gemzar, cealyx ou taxotère après leur récidive. Une cytoréduction secondaire a également été effectuée chez 33% de ces patientes ayant une récidive. Nous avons également étudié l'intervalle de temps entre la date de la¦récidive et celle du décès. Parmi les 28 patientes décédées chez les récidives, 10 d'entre-­‐elles (36%) ont survécu moins d'un an une fois la récidive diagnostiquée, 8 (28%) patientes ont survécu jusqu'à 2 ans, et¦les 10 (36%) autres patientes ont survécu de 2 à 5 ans. En ce qui concerne le taux de mortalité; 39 patientes sur les 147 étudiées sont décédées pendant la période d'observation, soit 26% des cas. La tumeur¦type borderline, présente une prolifération épithéliale atypique sans invasion dans le stroma et représente¦10 à 20% de toutes les tumeurs ovariennes. Dans notre étude, 41 patientes sont porteuses de cette tumeur¦(28%) et la moyenne d'âge est de 49 ans. En ce qui concerne leur prise en charge, l'intervention chirurgicale¦la plus fréquente, soit 23% des cas, est l'annexectomie unilatérale, qui reste une attitude conservative pour¦ces patientes désirant préserver leur fertilité. 6 patientes présentant ce type de tumeur ont récidivé, soit 14% des cas, avec une progression pelvienne, et 3 de ces 6 patientes sont décédées. Dans notre analyse, on observe que la probabilité de vivre plus longtemps que 1an pour les patientes ayant une tumeur borderline est de 93,8% (95% CI= 0.6323-­‐ 0.9910), à 3 ans elle est également de 93,8% (95% CI = 0.6323-­‐0.9910) et à 5 ans elle est de 78,1% (95% CI = 0.3171-­‐0.9483). Nous n'avons pas observé de¦différence de survie dans notre étude entre les patientes présentant une tumeur borderline et le « non‐borderline ». (Pvaleur=0.3301)

The role of the hypothalamic kisspeptin/GPR54 system in the control of GnRH neurons

Summary : The hypothalamus represents less than 1 % of the total volume of the brain tissue, yet it plays a crucial role in endocrine regulations. Puberty is defined as a process leading to physical, sexual and psychosocial maturation. The hypothalamus is central to this process, via the activation of GnRH neurons. Pulsatile GnRH secretion, minimal during childhood, increases with the onset of puberty. The primary function of GnRH is to regulate the growth, development and function of testes in boys and ovaries in girls, by stimulating the pituitary gland secretion of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). Several factors contribute to the timing of puberty, including sex and ethnicity, genetics, dietary intake and energy expenditure. Kisspeptins constitute a family of small peptides arising from the proteolytic cleavage of metastin, a peptide with 54 amino acids initially purified from human placenta. These kisspeptins were the subject of much attention following their discovery because of their antimetastatic properties, but it was more recently that their determining role in the reproductive function was demonstrated. It was shown that kisspeptins are ligands of a receptor, GPR54, whose natural inactivating mutation in humans, or knockout in the mouse, lead to infertility. GnRH neurons play a pivotal role in the central regulation of fertility. Kisspeptin greatly increases GnRH release and GnRH neuron firing activity, but the neurobiological mechanisms for these actions are unknown. Gprotein-coupled receptor 54, the receptor for kisspeptin, is expressed by GnRH neurons as well as other hypothalamic neurons, suggesting that both direct and indirect effects are possible. In the first part of my thesis, we investigated a possible connection between the acceleration of sexual development induced by leptin and hypothalamic metastin neurons. However, the data generated by our preliminary experiments confirmed that the commercially available antibodies are non-specific. This finding constituted a major drawback for our studies, which relied heavily upon the neuroanatomical study of the hypothalamic metastinergic pathways to elucidate their sensitivity to exogenous leptin. Therefore, we decided to postpone any further in vivo experiment until a better antibody becomes available, and focused on in vitro studies to better understand the mechanisms of action of kisspeptins in the modulation of the activity of GnRH neurons. We used two GnRH-expressing neuronal cell lines to investigate the cellular and molecular mechanisms of action of metastin in GnRH neurons. We demonstrated that kisspeptin induces an early activation of the MAP kinase intracellular signaling pathway in both cell lines, whereas the SAP/JNK or the Akt pathways were unaffected. Moreover, we found an increase in GnRH mRNA levels after 6h of metastin stimulation. Thus, we can conclude that kisspeptin regulates GnRH neurons both at the secretion and the gene expression levels. The MAPK pathway is the major pathway activated by metastin in GnRH expressing neurons. Taken together, these data provide the first mechanism of action of kisspeptin on GnRH neurons. Résumé : L'hypothalamus est une zone située au centre du cerveau, dont il représente moins de 1 du volume total. La puberté est la période de transition entre l'enfance et l'age adulte, qui s'accompagne de transformations somatiques, psychologiques, métaboliques et hormonales conduisant à la possibilité de procréer. La fonction principale de la GnRH est la régulation de la croissance, du développement et de la fonction des testicules chez les hommes, et des ovaires chez les femmes en stimulant la sécrétion de l'hormone lutéinisante (LH) et de l'hormone folliculostimulante (FSH) par la glande hypophysaire. Plusieurs facteurs contribuent au déclanchement de la puberté, y compris le sexe et l'appartenance ethnique, la génétique, l'apport alimentaire et la dépense énergétique. Les Kisspeptines constituent une famille de peptides résultant de la dissociation proteolytique de la métastine, un peptide de 54 acides aminés initialement purifié à partir de placenta humain. Ces kisspeptines ont fait l'objet de beaucoup d'attention à la suite de leur découverte en raison de leurs propriétés anti-metastatiques, et c'est plus récemment que leur rôle déterminant dans la fonction reproductive a été démontré. Les kisspeptines sont des ligands du récepteur GPR54, dont la mutation inactivatrice chez l'homme, ou le knockout chez la souris, conduisent à l'infertilité par hypogonadisme hypogonadotrope. Les neurones à GnRH jouent un rôle central dans le règlement des fonctions reproductrices et la kisspeptine stimule l'activité des neurones à GnRH et la libération de GnRH par ces neurones. Toutefois, les mécanismes neurobiologiques de ces actions ne sont pas connus. Dans la première partie de ma thèse, nous avons étudié le lien potentiel entre l'accélération du développement sexuel induite par la leptine et les neurones hypothalamiques à metastine. Les données générées dans cette première série d'expériences ont malheureusement confirmé que les anticorps anti-metastine disponibles dans le commerce sont aspécifiques. Ceci a constitué un inconvénient majeur pour nos études, qui devaient fortement s'appuyer sur l' étude neuroanatomique des neurones hypothalamiques à metastine pour évaluer leur sensibilité à la leptine exogène. Nous avons donc décidé de focaliser nos travaux sur une étude in vitro des mécanismes d'action de la kisspeptine pour moduler l'activité des neurones à GnRH. Nous avons utilisé deux lignées de cellules neuronales exprimant la GnRH pour étudier les mécanismes d'action cellulaires et moléculaires de la metastine dans des neurones. Nous avons ainsi pu démontrer que la kisspeptine induit une activation précoce de la voie f de signalisation de la MAP kinase dans les deux lignées cellulaires, alors que nous n'avons observé aucune activation de la voie de signalisation de la P13 Kinase et de la SAP/JNK. Nous avons en outre démontré une augmentation de l'expression de la GnRH par la stimulation avec la Kisspeptine. L'ensemble de ces données contribue à élucider le mécanisme d'action avec lequel la kisspeptine agit dans les neurones à GnRH, en démontrant un effet sur l'expression génique de la GnRH. Nous pouvons également conclure que la voie de la MAPK est la voie principale activée par la metastine dans les neurones exprimant la GnRH.

La gigantomachie de Lousanna-Vidy suivie de considérations sur la transmission du motif de l'anguipède

Considérations méthodologiques Nous avons limité aux précisions indispensables à la compréhension de notre propos les considérations sur la gigantomachie en général. Nous renvoyons aux études signalées plus haut (supra, p. 7, n. 2), principalement pour ce qui concerne les géants avant leur transformation en anguipèdes à partir de l'époque hellénistique. Notre recherche de parallèles reposera sur quelques oeuvres d'art encore existantes : les sculptures décorant les plus importantes d'entre elles feront dès lors figure d'archétype, même si, bien sûr, rien ne permet d'exclure qu'il en ait existé de plus significatives. Parmi les nombreux monuments aujourd'hui disparus, respectivement parmi ceux qui seraient encore à découvrir, il s'en trouvait sans doute qui auraient été susceptibles de servir de modèle pour les sculptures ornant le fanum de Lousonna, duquel bien peu de restes nous sont parvenus. A l'exception de quelques renvois ponctuels, notre démarche s'est appuyée exclusivement sur du matériel et des informations déjà publiés. Pour la reconstitution des bas-reliefs de Lousonna, nous nous sommes inspiré généralement de sculptures hellénistiques et romaines dont l'ornementation présentait des similitudes avec les fragments à notre disposition ; la plupart des parallèles sont mentionnés dans le Lexicon Iconographicum Mythologiae Classicae. L'examen des volumes du Corpus Signorum Imperii Romani et de quelques autres recueils nous a permis de faire des propositions pour les cas restés en suspens. A une exception près, l'échantillonnage aéré formé à partir d'ensembles sculptés qui devaient avoir les mêmes caractéristiques que le matériel que nous tenterons d'identifier : ils comportaient des monstres anguipèdes avec les jambes se terminant par la tête du serpent, remontant au plus tard à la fin de la période romaine et produits dans un atelier gréco-romain. Afin de recréer avec le plus de vraisemblance possible l'environnement du fanum de Lousonna, nous avons recherché des édifices de caractéristiques semblables dans les catalogues de temples gallo-romains dressés par P. D. HORNE et A. C. KING (1980), respectivement I. FAUDUET et P. ARCELIN (1993). Tant l'absence presque complète de restes architecturaux susceptibles d'être rapportés à l'édifice religieux que la nature somme toute modeste du vicus lémanique nous ont fait opter pour une variante minimaliste, se limitant finalement à la structure supportant la gigantomachie devant un temple sans aucune décoration. Pour tenter de préciser les modalités de la transmission du thème des géants, nous envisagerons trois cheminements possibles : la tradition orale, la transmission littéraire et, enfin, la représentation iconographique, qu'il s'agisse de monuments, d'objets mobiliers ou même des quelques rares illustrations de textes antiques. Sauf indication contraire, les textes anciens sont cités dans les traductions des Belles-Lettres, des Sources chrétiennes ou de la Loeb Classical Library dont la liste figure à la page 161. La version française des textes dont aucune traduction n'était disponible est généralement due à François Mottas (traduction F.M.). Nous ne reportons les dates de naissance des auteurs ou des artistes mentionnés que lorsqu'elles sont utiles à la compréhension de notre exposé. En plus du rôle qu'ont pu jouer les oeuvres d'art disparues au cours des deux derniers millénaires, divers facteurs ont dû assurer la constitution et la mise au point d'un imaginaire de plus en plus élaboré des gigantomachies. La mémoire a certes sa part dans l'inspiration des artistes qui réalisèrent les sculptures de la cité lémanique; mais si un mythe ou le récit d'un événement peuvent s'être transmis de bouche à oreille au cours des siècles, certaines ressemblances dans l'attitude des personnages sont trop frappantes, même en tenant compte de ces gestes qu'il n'existe qu'une seule façon de représenter: il n'est dès lors pas possible d'imaginer que la transmission des détails des scènes se serait pratiquée uniquement par voie orale. Si le voyage touristique; tel que nous l'entendons de nos jours, n'a pas existé, les personnes susceptibles d'avoir ramené des informations de leurs déplacements à travers l'Empire sont plus nombreuses qu'on ne le croirait au premier abord. Fonctionnaires allant prendre leur charge ou en mission dans une contrée voisine; soldats, parmi lesquels des mercenaires gaulois; pèlerins ayant visité de grands sanctuaires, comme celui d'Esculape à Pergame, emplacement de la gigantomachie la plus impressionnante, ou d'autres lieux de culte; jeunes fortunés ayant étudié à Athènes; commerçants accompagnés par des muletiers ou des portefaix acheminant leurs marchandises; membres de corporations ou artisans exerçant des métiers itinérants; esclaves, dont l'exportation devait représenter une source de revenus intéressante pour les commerçants romains; en dernier lieu, sans parler des artistes eux-mêmes, ces arpenteurs-géomètres chargés de toutes sortes de relevés qui accompagnaient les empereurs lors de leurs déplacements (infra, p. 36). Il faudra cependant rester prudent quant à l'affirmation d'une connaissance visuelle directe que les sculpteurs de Lousonna auraient eue des réalisations antiques avec lesquelles nous mettrons la gigantomachie en parallèle. Même si elle n'a toujours pas pu être prouvée, la circulation de cahiers de modèles semble bel et bien assurée: dans un atelier, les maîtres ont forcément passé leurs croquis à leurs successeurs et ceci s'est peut-être répété pour plusieurs générations d'artisans. Sans parler des monnaies, d'autres moyens de transmission peuvent encore être mentionnés : éventuelles éditions illustrées de textes antiques, motifs gravés sur des gemmes ou représentés sur des récipients décorés... Une observation s'impose ici : la plupart des monuments que nous utiliserons pour notre reconstitution existaient encore lors de l'érection de notre gigantomachie. Une fois les bas-reliefs de Lousonna reconstitués, restait donc à combler l'absence de toute étude sur la survie de la gigantomachie à travers les âges et à préciser l'emploi qui en serait fait à la Renaissance. Divers recueils d'ouvrages consacrés à la mythologie et remontant à cette période nous ont permis de décrire les modalités de la reprise du récit de la guerre des géants; en l'absence de toute synthèse sur ceux-ci dans la peinture de la Renaissance, c'est en partant de l'examen des nombreux travaux consacrés au Palazzo del Te à Mantoue que nous avons pu établir un lien entre les représentations de géants peintes durant la première moitié du 16ème siècle, au cours duquel la gigantomachie était redevenue un sujet d'actualité. Le monument de la bourgade lémanique comporte encore neuf personnages et constitue, avec celui d'Yzeures-sur-Creuse, l'exemplaire le plus complet découvert dans la partie occidentale de l'Empire romain : il méritait bien d'être à l'origine d'une telle démarche.

HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.

Qualités psychométriques de la version française de la TAS-20 et prévalence de l'alexithymie chez 264 adolescents tout-venant [The 20-item Toronto alexithymia scale: structural validity, internal consistency and prevalence of alexithymia in a Swiss adolescent sample]

L'objectif de cette étude est d'examiner la structure factorielle et la consistance interne de la TAS-20 sur un échantillon d'adolescents (n = 264), ainsi que de décrire la distribution des caractéristiques alexithymiques dans cet échantillon. La structure à trois facteurs de la TAS-20 a été confirmée par notre analyse factorielle confirmatoire. La consistance interne, mesurée à l'aide d'alpha de Cronbach, est acceptable pour le premier facteur (difficulté à identifier les sentiments (DIF)), bonne pour le second (difficulté à verbaliser les sentiments (DDF)), mais en revanche, faible pour le troisième facteur (pensées orientées vers l'extérieur (EOT)). Les résultats d'une Anova mettent en évidence une tendance linéaire indiquant que plus l'âge augmente plus le niveau d'alexithymie (score total TAS-20), la difficulté à identifier les sentiments et les pensées orientées vers l'extérieur diminuent. En ce qui concerne la prévalence de l'alexithymie, on remarque en effet que 38,5 % des adolescents de moins de 16 ans sont considérés comme alexithymiques, contre 30,1 % des 16-17 ans et 22 % des plus de 17 ans. Notre étude indique donc que la TAS-20 est un instrument adéquat pour évaluer l'alexithymie à l'adolescence, tout en suggérant quelques précautions étant donné l'aspect développemental de cette période.

Gouvernance locale et trajectoires de developpement touristique : comparaison des cas de Finhaut, Montreux et Zermatt entre 1850 et 2012

La performance que constitue pour une station le fait de connaître le succès touristique, parfois sur plusieurs décennies, n'est de loin pas anodine, surtout si l'on observe que certains lieux traversent des phases de crise plus ou moins longues et plus ou moins marquées et que d'autres encore parviennent à se reconvertir avec succès en diversifiant leurs activités économiques. C'est du point de vue du système de gouvernance locale et de la gestion des ressources foncières, immobilières et infrastructurelles que nous nous sommes intéressés à cette problématique. Notre questionnement était double : d'une part, comprendre comment ces deux dimensions s'articulaient entre elles via la proposition d'un cadre conceptuel que nous avons nommé l'Arrangement Politique Local et, d'autre part, étudier comment elles influençaient les différentes phases comme le démarrage du tourisme, le succès, la crise ou la sortie du tourisme, que peut expérimenter un lieu touristique au cours de son évolution. Le travail empirique a porté sur les trajectoires de développement de trois lieux ou anciens lieux touristiques. Finhaut, après une période de succès qui a fait de la station la deuxième du Valais au début du XXe siècle, a vu après la première guerre mondiale son activité touristique décliner puis péricliter, le tourisme ayant à l'heure actuelle quasiment disparu. Montreux, de station touristique importante dès les années 1880, a ensuite évolué vers une ville grâce à un processus d'urbanisation ainsi qu'à une diversification des activités économiques. Enfin, Zermatt représente une économie touristique en constante croissance depuis plus de 100 ans. L'analyse de ces trois trajectoires touristiques entre 1850 et 2012 a permis de montrer que la création et la gestion des ressources foncières, immobilières et infrastructurelles à des fins touristiques étaient liées aux caractéristiques du système de gouvernance locale, en particulier à la possession ou non par les acteurs locaux des moyens d'action principaux que sont l'argent, l'organisation, le consensus, le soutien politique et les connaissances. Notre étude a également mis en évidence de fortes différences entre les Arrangements Politiques Locaux lors des phases de succès et ceux durant les moments de crise, ces différences portant sur l'importance de l'implication des autorités politiques locales dans le développement touristique, l'existence d'un leadership touristique, la capacité des acteurs locaux à être actifs à des positions politiques et touristiques aux échelons institutionnels supérieurs, l'importance de la collaboration publique/privés, la capacité d'adaptation et de réaction des acteurs locaux face aux événements, la réussite ou non des stratégies permettant la création et l'utilisation des ressources dans un but touristique ainsi que la capacité de mobilisation des moyens d'action nécessaires.

Aspects de la représentation de l'autre dans les romans grecs et "Les Métamorphoses" d'Apulée

Les romans grecs et les Métamorphoses d'Apulée - même si les modalités sont différentes pour ce dernier - sont des fictions en prose qui fonctionnent autour de topoi auxquels la figure de l'Autre n'échappe pas. Bien que le monde grec soit alors radicalement différent de ce qu'il était au Ve siècle avant J.-C, période à laquelle l'identité grecque est construite par opposition à la figure du barbare, les romanciers qui prennent la plume à partir du 1er siècle avant notre ère utilisent un certain nombre de stéréotypes hérités de l'époque classique, alors mise à l'honneur par le mouvement de la Seconde Sophistique. Il s'agit d'étudier dans le détail certains éléments de la représentation de l'Autre pour déterminer qui il est, comment il se comporte, ce qui le constitue en Autre. Puis, à partir de cette esquisse, nécessairement incomplète, d'évaluer ce que cette représentation peut induire sur l'image de l'identité grecque à l'époque impériale, par le jeu de miroir que F. Hartog a décelé dans l'oeuvre d'Hérodote. Une première partie est consacrée aux rapports entre l'homme et l'animal ainsi qu'à l'image de la sauvagerie, ce qui permet d'explorer les bornes romanesques de l'humanité. La seconde partie s'attache à des éléments que l'époque classique a plus particulièrement mis en avant pour distinguer les Grecs des non-Grecs : le critère de la langue, l'art de faire la guerre et le discours politique qui est tenu sur les institutions barbares. La troisième partie étudie la place des dieux et des pratiques religieuses dans la définition de l'Autre. J'espère ainsi contribuer à la compréhension du genre romanesque et des représentations culturelles de l'empire « gréco-romain ». -- The Greek novels and The Metamorphoses of Apuleius, even if it is in different terms for the last, are prose fictions which are based on topoi, and the figure of the Other is one of them. Although the Greek world was radically different of what it was in the fifth century BC, time during which Greek identity is contructed as opposed to the figure of the barbaros, the authors of novels, who wrote from the first century BC onward, used some stereotypes inherited from classical period, which was celebrated by the Second Sophistic movement. The aim of this thesis is to study in detail some elements of the representation of the Other to determine who it is, how he behaves, what makes him other. Then, from this sketch, necessarily incomplete, to evaluate what this representation says about the image of Greek identity in the imperial age, according to the play of the mirror detected by F. Hartog in the text of Herodotus. The first part of the thesis is dedicated to the relationship between man and animal and to the image of savagery, in order to explore the novelistic limits of humanity. The second part concentrates on elements that classical period had particularly insisted on to promote the distinction between Greeks and non-Greeks : the linguistic criterion, the way to make war, and the politic discourse on the barbaric institutions. The third part study the place of the gods and of religious practices in the definition of the Other. I hope to contribute to the understanding of novel genre and of cultural representations of the « greco- roman- empire ».