Towards a system analysis of the early steps of infectious endocarditis pathogenesis

L'endocardite infectieuse (EI) est une maladie potentiellement mortelle qui doit être prévenue dans toute la mesure du possible. Au cours de ces dernières 50 années, les recommandations Américaines et Européennes pour la prophylaxie de PEI proposaient aux patients à risques de prendre un antibiotique, préventif avant de subir une intervention médico-chirurgicale susceptible d'induire une bactériémie transitoire. Cependant, des études épidémiologiques récentes ont montré que la plupart des EI survenaient en dehors de tous actes médico-chirurgicaux, et indépendamment de la prise ou non de prophylaxie antibiotique . L'EI pourrait donc survenir suite à la cumulation de bactériémies spontanées de faibles intensités, associées à des activités de la vie courante telle que le brossage dentaire pour le streptocoques, ou à partir de tissus colonisés ou de cathéters infectés pour les staphylocoques. En conséquence, les recommandations internationales pour la prophylaxie de PEI ont été revues et proposent une diminution drastique de l'utilisation d'antibiotiques. Cependant, le risque d'EI représenté par le cumul de bactériémies de faibles intensités n'a pas été démontré expérimentalement. Nous avons développé un nouveau modèle d'EI expérimentale induite par une inoculation en continu d'une faible quantité de bactéries, simulant le cumul de bactériémies de faibles intensités chez l'homme, et comparé l'infection de Streptococcus gordonii et de Staphylococcus aureus dans ce modèle avec celle du modèle d'IE induite par une bactériémie brève, mais de forte intensité. Nous avons démontré, après injection d'une quantité égale de bactéries, que le nombre de végétations infectées était similaire dans les deux types d'inoculations. Ces résultats expérimentaux ont confirmé l'hypothèse qu'une exposition cumulée à des bactériémies de faibles intensités, en dehors d'une procédure médico-chirurgicale, représentait un risque pour le développement d'une El, comme le suggéraient les études épidémiologiques. En plus, ces résultats ont validé les nouvelles recommandations pour la prophylaxie de l'El, limitant drastiquement l'utilisation d'antibiotiques. Cependant, ces nouvelles recommandations laissent une grande partie (> 90%) de cas potentiels d'EI sans alternatives de préventions, et des nouvelles stratégies prophylactiques doivent être investiguées. Le nouveau modèle d'EI expérimentale représente un modèle réaliste pour étudier des nouvelles mesures prophylactiques potentielles appliquées à des expositions cumulées de bactériémies de faible nombre. Dans un contexte de bactériémies spontanées répétitives, les antibiotiques ne peuvent pas résoudre le problème de la prévention de l'EI. Nous avons donc étudié la une alternative de prévention par l'utilisation d'agents antiplaquettaires. La logique derrière cette approche était basée sur le fait que les plaquettes sont des composants clés dans la formation des végétations cardiaques, et le fait que les bactéries capables d'interagir avec les plaquettes sont plus enclines à induire une El. Les agents antiplaquettaires utilisés ont été l'aspirine (inhibiteur du COX1), la ticlopidine (inhibiteur du P2Y12, le récepteur de l'ADP), et l'eptifibatide et Pabciximab, deux inhibiteurs du GPIIb/IIIa, le récepteur plaquettaire pour le fibrinogène. Les anticoagulants étaient le dabigatran etexilate, inhibant lathrombine et l'acenocumarol, un antagoniste de la vitamine K. L'aspirine, la ticlopidine ou l'eptifibatide seuls n'ont pas permis de prévenir l'infection valvulaire (> 75% animaux infectés). En revanche, la combinaison d'aspirine et de ticlopidine, aussi bien que l'abciximab, ont protégé 45% - 88% des animaux de l'EI par S. gordonii et par S. aureus. L'antithrombotique dabigatran etexilate à protégé 75% des rats contre l'EI par S. aureus, mais pas (< 30% de protection) par S. gordonii. L'acenocoumarol n'a pas eu d'effet sur aucun des deux organismes. En général, ces résultats suggèrent un possible rôle pour les antiplaquettaires et du dabigatran etexilate dans la prophylaxie de l'EI dans un contexte de bactériémies récurrentes de faibles intensités. Cependant, l'effet bénéfique des antiplaquettaires doit être soupesé avec le risque d'hémorragie inhérent à ces molécules, et le fait que les plaquettes jouent un important rôle dans les défenses de l'hôte contre les infections endovasculaires. En plus, le double effet bénéfique du dabigatran etexilate devrait être revu chez les patients porteurs de valves prothétiques, qui ont besoin d'une anticoagulation à vie, et chez lesquels l'EI à S. aureus est associée avec une mortalité de près de 50%. Comme l'approche avec des antiplaquettaires et des antithrombotiques pourrait avoir des limites, une autre stratégie prophylactique pourrait être la vaccination contre des adhésines de surfaces des pathogènes. Chez S. aureus, la protéine de liaison au fibrinogène, ou dumping factor A (ClfA), et la protéine de liaison à la fibronectine (FnbpA) sont des facteurs de virulence nécessaires à l'initiation et l'évolution de PEI. Elles représentent donc des cibles potentielles pour le développement de vaccins contre cette infection. Récemment, des nombreuses publications ont décrit que la bactérie Lactococcus lactis pouvait être utilisée comme vecteur pour la diffusion d'antigènes bactériens in vivo, et que cette approche pourrait être une stratégie de vaccination contre les infections bactériennes. Nous avons exploré l'effet de l'immunisation par des recombinant de L. lactis exprimant le ClfA, la FnbpA, ou le ClfA ensemble avec et une forme tronquée de la FnbpA (Fnbp, comprenant seulement le domaine de liaison à la fibronectine mais sans le domaine A de liaison au fibrinogène [L. lactis ClfA/Fnbp]), dans la prophylaxie de PIE expérimentale à S. aureus. L. lactis ClfA a été utilisés comme agent d'immunisation contre la souche S. aureus Newman (qui a particularité de n'exprimer que le ClfA, mais pas la FnbpA). L. lactis ClfA, L. lactis FnbpA, et L. lactis ClfA/Fnbp, ont été utilisé comme agents d'immunisation contre une souche isolée d'une IE, S. aureus P8 (exprimant ClfA et FnbpA). L'immunisation avec L. lactis ClfA a généré des anticorps anti-ClfA fonctionnels, capables de bloquer la liaison de S. aureus Newman au fibrinogène in vitro et protéger 13/19 (69%) animaux d'une El due à S. aureus Newman (P < 0.05 comparée aux contrôles). L'immunisation avec L. lactis ClfA, L. lactis FnbpA, ou L. lactis ClfA/Fnbp, a généré des anticorps contre chacun de ces antigènes. Cependant, ils n'ont pas permis de bloquer l'adhésion de S. aureus P8 au fibrinogène et à la fibronectine in vitro. De plus, l'immunisation avec L. lactis ClfA ou L. lactis FnbpA s'est avérée inefficace in vivo (< 10% d'animaux protégés d'une El) et l'immunisation avec L. lactis ClfA/Fnbp a fourni une protection limitée de l'EI (8/23 animaux protégés; P < 0.05 comparée aux contrôles) après inoculation avec S. aureus P8. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que L. lactis est un système efficace pour la présentation d'antigènes in vivo et potentiellement utile pour la prévention de PEI à S. aureus. Cependant, le répertoire de protéines de surface de S. aureus capable d'évoquer une panoplie d'anticorps efficace reste à déterminer.. En résumé, notre étude a démontré expérimentalement, pour la première fois, qu'une bactériémie répétée de faible intensité, simulant la bactériémie ayant lieu, par exemple, lors des activités de la vie quotidienne, est induire un taux d'EI expérimentale similaire à celle induite par une bactériémie de haute intensité suite à une intervention médicale. Dans ce contexte, où l'utilisation d'antibiotiques est pas raisonnable, nous avons aussi montré que d'autres mesures prophylactiques, comme l'utilisation d'agents antiplaquettaires ou antithrombotiques, ou la vaccination utilisant L. lactis comme vecteur d'antigènes bactériens, sont des alternatives prometteuses qui méritent d'être étudiées plus avant. Thesis Summary Infective endocarditis (IE) is a life-threatening disease that should be prevented whenever possible. Over the last 50 years, guidelines for IE prophylaxis proposed the use of antibiotics in patients undergoing dental or medico-surgical procedures that might induce high, but transient bacteremia. However, recent epidemiological studies indicate that IE occurs independently of medico-surgical procedures and the fact that patients had taken antibiotic prophylaxis or not, i.e., by cumulative exposure to random low-grade bacteremia, associated with daily activities (e.g. tooth brushing) in the case of oral streptococci, or with a colonized site or infected device in the case of staphylococci. Accordingly, the most recent American and European guidelines for IE prophylaxis were revisited and updated to drastically restrain antibiotic use. Nevertheless, the relative risk of IE represented by such cumulative low-grade bacteremia had never been demonstrated experimentally. We developed a new model of experimental IE due to continuous inoculation of low-grade bacteremia, mimicking repeated low-grade bacteremia in humans, and compared the infectivity of Streptococcus gordonii and Staphylococcus aureus in this model to that in the model producing brief, high-level bacteremia. We demonstrated that, after injection of identical bacterial numbers, the rate of infected vegetations was similar in both types of challenge. These experimental results support the hypothesis that cumulative exposure to low-grade bacteremia, outside the context of procedure-related bacteremia, represents a genuine risk of IE, as suggested by human epidemiological studies. In addition, they validate the newer guidelines for IE prophylaxis, which drastic limit the procedures in which antibiotic prophylaxis is indicated. Nevertheless, these refreshed guidelines leave the vast majority (> 90%) of potential IE cases without alternative propositions of prevention, and novel strategies must be considered to propose effective alternative and "global" measures to prevent IE initiation. The more realistic experimental model of IE induced by low-grade bacteremia provides an accurate experimental setting to study new preventive measures applying to cumulative exposure to low bacterial numbers. Since in a context of spontaneous low-grade bacteremia antibiotics are unlikely to solve the problem of IE prevention, we addressed the role of antiplatelet and anticoagulant agents for the prophylaxis of experimental IE induced by S. gordonii and S. aureus. The logic of this approach was based on the fact that platelets are key players in vegetation formation and vegetation enlargement, and on the fact that bacteria capable of interacting with platelets are more prone to induce IE. Antiplatelet agents included the COX1 inhibitor aspirin, the inhibitor of the ADP receptor P2Y12 ticlopidine, and two inhibitors of the platelet fibrinogen receptor GPIIb/IIIa, eptifibatide and abciximab. Anticoagulants included the thrombin inhibitor dabigatran etexilate and the vitamin K antagonist acenocoumarol. Aspirin, ticlopidine or eptifibatide alone failed to prevent aortic infection (> 75% infected animals). In contrast, the combination of aspirin with ticlopidine, as well as abciximab, protected 45% to 88% of animals against IE due to S. gordonii and S. aureus. The antithrombin dabigatran etexilate protected 75% of rats against IE due to S. aureus, but failed (< 30% protection) against S. gordonii. Acenocoumarol had no effect against any bacteria. Overall, these results suggest a possible role for antiplatelet agents and dabigatran etexilate in the prophylaxis of IE in humans in a context of recurrent low- grade bacteremia. However, the potential beneficial effect of antiplatelet agents should be balanced against the risk of bleeding and the fact that platelets play an important role in the host defenses against intravascular infections. In addition, the potential dual benefit of dabigatran etexilate might be revisited in patients with prosthetic valves, who require life-long anticoagulation and in whom S. aureus IE is associated with high mortality rate. Because the antiplatelet and anticoagulant approach might be limited in the context of S. aureus bacteremia, other prophylactic strategies for the prevention of S. aureus IE, like vaccination with anti-adhesion proteins was tested. The S. aureus surface proteins fibrinogen-binding protein clumping-factor A (ClfA) and the fibronectin-binding protein A (FnbpA) are critical virulence factors for the initiation and development of IE. Thus, they represent key targets for vaccine development against this disease. Recently, numerous reports have described that the harmless bacteria Lactococcus lactis can be used as a bacterial vector for the efficient delivery of antigens in vivo, and that this approach is a promising vaccination strategy against bacterial infections. We therefore explored the immunization capacity of non- living recombinant L. lactis ClfA, L. lactis FnbpA, or L. lactis expressing ClfA together with Fnbp (a truncated form of FnbpA with only the fibronectin-binding domain but lacking the fibrinogen-binding domain A [L. lactis ClfA/Fnbp]), to protect against S. aureus experimental IE. L. lactis ClfA was used as immunization agent against the laboratory strain S. aureus Newman (expressing ClfA, but lacking FnbpA). L. lactis ClfA, L. lactis FnbpA, as well as L. lactis ClfA/Fnbp, were used as immunization agents against the endocarditis isolate S. aureus P8 (expressing both ClfA and FnbpA). Immunization with L. lactis ClfA produced anti-ClfA functional antibodies, which were able to block the binding of S. aureus Newman to fibrinogen in vitro and protect 13/19 (69%) animals from IE due to S. aureus Newman (P < 0.05 compared to controls). Immunization with L. lactis ClfA, L. lactis FnbpA or L. lactis ClfA/Fnbp, produced antibodies against each antigen. However, they were not sufficient to block S. aureus P8 binding to fibrinogen and fibronectin in vitro. Moreover, immunization with L. lactis ClfA or L. lactis FnbpA was ineffective (< 10% protected animals) and immunization with L. lactis ClfA/Fnbp conferred limited protection from IE (8/23 protected animals; P < 0.05 compared to controls) after challenge with S. aureus P8. Together, these results indicate that L. lactis is an efficient delivering antigen system potentially useful for preventing S. aureus IE. They also demonstrate that expressing multiple antigens in L. lactis, yet to be elucidated, will be necessary to prevent IE due to clinical S. aureus strains fully equipped with virulence determinants. In summary, our study has demonstrated experimentally, for the first time, the hypothesis that low-grade bacteremia, mimicking bacteremia occurring outside of a clinical intervention, is equally prone to induce experimental IE as high-grade bacteremia following medico-surgical procedures. In this context, where the use of antibiotics for the prophylaxis of IE is limited, we showed that other prophylactic measures, like the use of antiplatelets, anticoagulants, or vaccination employing L. lactis as delivery vector of bacterial antigens, are reasonable alternatives that warrant to be further investigated.

Coupled reproductive ecologies in a plant-pollinator-seed predator system

Résumé de la thèseBien que le mutualisme puisse être considéré comme une relation harmonieuse entre différentes espèces, son étude révèle plutôt une exploitation réciproque où chaque partenaire tente de maximiser ses bénéfices tout en réduisant ses coûts. Dans ce contexte, l'identification des facteurs qui favorisent ou contrarient, au cours de l'évolution, une issue mutualiste est une étape majeure pour pouvoir reconstruire les étapes clés menant à l'apparition et au maintien des interactions mutualistes. Le but de ce doctorat était l'identification des traits phénotypiques qui permettent à la plante Silene latofolia (Caryophyllacée)et à son pollinisateur - prédateur de graines, la phalène Hadena bicruris (Noctuidé), d'augmenter les bénéfices nets que chacun retire de l'interaction. Ce système d'étude est particulièrement bien approprié à l'étude de ces traits, car on peut assez facilement estimer la qualité et la quantité des descendants (fitness) des deux partenaires. En effet, la femelle papillon pond un oeuf dans la fleur qu'elle pollinise et sa larve se développe dans le fruit, consommant les graines de la plante. Ainsi, sur une même plante, il est possible d'estimer les succès respectifs de la plante et du papillon à obtenir une descendance. De plus, le conflit d'intérêt autour des graines qui sont indispensables, à la fois à la plante et au papillon, peut stimuler l'évolution de traits qui limitent la surexploitation réciproque des partenaires. Dans une première étude, j'ai montré que le papillon mâle était un pollinisateur efficace de S. latifolia et qu'ainsi, il permettait à la plante d'augmenter le nombre de graines produites (i.e.bénéfice) sans pour autant augmenter la quantité de larves sur la plante. Dans ce système, les papillons pondent un seul oeuf par fleur, déposé soit à l'intérieur de la fleur, dans le tube de corolle, soit sur le pétale. Ma seconde étude montre que les plantes répondent différemment à la présence des oeufs suivant leur position. Aussi, quand l'oeuf est placé dans la fleur, la plante a davantage tendance à ne pas développer le fruit de la fleur infesté ou bien à produire des fruits plus petits que lorsque l'oeuf est placé sur le pétale. Enfin, j'ai montré que la femelle du papillon pond plus souvent sur le pétale lorsque elle visite des fleurs dotées d'un long tube de corolle, et que les larves issues de ces oeufs ont moins de chances de réussir à pénétrer dans le fruit que les larves issues des oeufs placés à l'intérieur de la fleur. Aussi, la variation observée du site de ponte pourrait être causé par la morphologie de la fleur qui contraint le papillon à pondre sur le pétale. Vu dans leur ensemble, les résultats obtenus pendant ce doctorat suggèrent que la participation des mâles à la pollination, l'absence de développement des fruits et la profondeur du tube de corolle pourraient réduire les coûts que S. latifolia subit dans son interaction avec H. bicruris. Par ailleurs, je n'ai pas détecté de mécanismes qui permettraient au papillon de réduire les coûts que la plante pourrait lui imposer. La prochaine étape serait de déterminer l'effet des traits identifiés dans ce doctorat sur la fitness globale de la plante et du papillon pour estimer pleinement leur efficacité à réduire les coûts et à favoriser une issue mutualiste. De même, il faudrait évaluer l'effet de ces traits en populations naturelles pour identifier le rôle des facteurs environnementaux sur leur efficacité.AbstractAlthough mutualisms can be regarded as harmonious relationships between the interacting partners, they are best conceptualized as reciprocal exploitations in which each partner attempts to increase its own benefits and decrease its costs. To date, identifying the factors which promote or discourage mutualistic outcomes remains a major goal to reconstruct the ecological conditions leading to mutualisms. The aim of this PhD thesis was to identify phenotypic traits that may increase the net benefits of each partner in the interaction between the plant Silene latifolia (Caryophyllaceae) and its pollinator / seed predator, the moth Hadena bicruris (Noctuidae). This study system is particularly well suited because the fitness of both interacting species can be assessed. The female moth lays its egg in the flower it pollinated, and its offspring grows in the fruit, feeding on the seeds of the plant, which allows for the follow-up of both larva and fruit fates. Furthermore, the inherent conflict of interest over the seeds as plant progeny vs. larval resource may stimulate the evolution of traits that reduce overexploitation in both the moth and plant. In a first study, I show that male moths are efficient pollinators, hence increasing seed production without increasing oviposition. The contribution of male moths to pollination might thus improve the net benefits of the interaction for the host plant. Females of the H. bicruris moth lay a single egg per flower, and place it either inside the corolla tube or on the petal. My second study shows that plants are more likely to abort the infested flower or to produce a smaller fruit when the egg was experimentally placed inside the flower compared to plants that received an egg on the petal. Finally, female moths were found to lay their eggs more frequently on the petal when visiting a flower with a deep corolla tube, and larvae hatching from these eggs less likely to successfully attack the fruit. Variation in egg position on the flower may thus be the result of a constraint imposed by floral morphology. Overall, this PhD work suggests that the pollination by male moths, flower abortion, and deep corolla tube may efficiently reduce the costs experienced by S. latifolia in its interaction with H. bicruris. Interestingly, no apparent mechanism of costs reduction was detected for the moth. Further studies should focus on the effects of these traits (i) in the long term fitness of both the plant and the insect and (ii) their interactions with environmental factors (biotic and abiotic) that may affect their efficiency in natural populations.

Regulatory roles of the GacS/GacA two-component system in plant-associated and other gram-negative bacteria.

The sensor kinase GacS and the response regulator GacA are members of a two-component system that is present in a wide variety of gram-negative bacteria and has been studied mainly in enteric bacteria and fluorescent pseudomonads. The GacS/GacA system controls the production of secondary metabolites and extracellular enzymes involved in pathogenicity to plants and animals, biocontrol of soilborne plant diseases, ecological fitness, or tolerance to stress. A current model proposes that GacS senses a still-unknown signal and activates, via a phosphorelay mechanism, the GacA transcription regulator, which in turn triggers the expression of target genes. The GacS protein belongs to the unorthodox sensor kinases, characterized by an autophosphorylation, a receiver, and an output domain. The periplasmic loop domain of GacS is poorly conserved in diverse bacteria. Thus, a common signal interacting with this domain would be unexpected. Based on a comparison with the transcriptional regulator NarL, a secondary structure can be predicted for the GacA sensor kinases. Certain genes whose expression is regulated by the GacS/GacA system are regulated in parallel by the small RNA binding protein RsmA (CsrA) at a posttranscriptional level. It is suggested that the GacS/GacA system operates a switch between primary and secondary metabolism, with a major involvement of posttranscriptional control mechanisms.

cDNA cloning and mapping of a novel islet-brain/JNK-interacting protein.

IB1/JIP-1 is a scaffold protein that regulates the c-Jun NH(2)-terminal kinase (JNK) signaling pathway, which is activated by environmental stresses and/or by treatment with proinflammatory cytokines including IL-1beta and TNF-alpha. The JNKs play an essential role in many biological processes, including the maturation and differentiation of immune cells and the apoptosis of cell targets of the immune system. IB1 is expressed predominantly in brain and pancreatic beta-cells where it protects cells from proapoptotic programs. Recently, a mutation in the amino-terminus of IB1 was associated with diabetes. A novel isoform, IB2, was cloned and characterized. Overall, both IB1 and IB2 proteins share a very similar organization, with a JNK-binding domain, a Src homology 3 domain, a phosphotyrosine-interacting domain, and polyacidic and polyproline stretches located at similar positions. The IB2 gene (HGMW-approved symbol MAPK8IP2) maps to human chromosome 22q13 and contains 10 coding exons. Northern and RT-PCR analyses indicate that IB2 is expressed in brain and in pancreatic cells, including insulin-secreting cells. IB2 interacts with both JNK and the JNK-kinase MKK7. In addition, ectopic expression of the JNK-binding domain of IB2 decreases IL-1beta-induced pancreatic beta-cell death. These data establish IB2 as a novel scaffold protein that regulates the JNK signaling pathway in brain and pancreatic beta-cells and indicate that IB2 represents a novel candidate gene for diabetes.

The histone-interacting domain of nuclear factor I activates simian virus 40 DNA replication in vivo.

Efficient initiation of SV40 DNA replication requires transcription factors that bind auxiliary sequences flanking the minimally required origin. To evaluate the possibility that transcription factors may activate SV40 replication by acting on the chromatin structure of the origin, we used an in vivo replication system in which we targeted GAL4 fusion proteins to the minimally required origin. We found that the proline-rich transcriptional activation domain of nuclear factor I (NF-I), which has been previously shown to interact with histone H3, specifically activates replication. Evaluation of a series of deletion and point mutants of NF-I indicates that the H3-binding domain and the replication activity coincide perfectly. Assays with other transcription factors, such as Sp1, confirmed the correlation between the interaction with H3 and the activation of replication. These findings imply that transcription factors such as NF-I can activate SV40 replication via direct interaction with chromatin components, thereby contributing to the relief of nucleosomal repression at the SV40 origin.

Comparative population genetic structure in a plant-pollinator/seed predator system.

Comparative analyses of spatial genetic structure of populations of plants and the insects they interact with provide an indication of how gene flow, natural selection and genetic drift may jointly influence the distribution of genetic variation and potential for local co-adaptation for interacting species. Here, we analysed the spatial scale of genetic structure within and among nine populations of an interacting species pair, the white campion Silene latifolia and the moth Hadena bicruris, along a latitudinal gradient across Northern/Central Europe. This dioecious, short-lived perennial plant inhabits patchy, often disturbed environments. The moth H. bicruris acts both as its pollinator and specialist seed predator that reproduces by laying eggs in S. latifolia flowers. We used nine microsatellite markers for S. latifolia and eight newly developed markers for H. bicruris. We found high levels of inbreeding in most populations of both plant and pollinator/seed predator. Among populations, significant genetic structure was observed for S. latifolia but not for its pollinator/seed predator, suggesting that despite migration among populations of H. bicruris, pollen is not, or only rarely, carried over between populations, thus maintaining genetic structure among plant populations. There was a weak positive correlation between genetic distances of S. latifolia and H. bicruris. These results indicate that while significant structure of S. latifolia populations creates the potential for differentiation at traits relevant for the interaction with the pollinator/seed predator, substantial gene flow in H. bicruris may counteract this process in at least some populations.