Ligand binding transmits conformational changes across the membrane-spanning region to the intracellular side of the 5-HT3 serotonin receptor.

Conformational changes of channel activation: Five enhanced green fluorescent protein (EGFP) molecules (green cylinders) were integrated into the intracellular part of the homopentameric ionotropic 5-HT3 receptor. This allowed the detection of extracellular binding of fluorescent ligands (?) to EGFP by FRET, and also enabled the quantification of agonist-induced conformational changes in the intracellular region of the receptor by homo-FRET between EGFPs. The approach opens novel ways for probing receptor activation and functional screening of therapeutic compounds.

Study of conformational changes of ASIC1a by voltage-clamp fluorometry

Le fonctionnement du système nerveux est sensible aux variations de la concentration d'acide. Une acidification des tissus peut se produire pendant une activité neuronale intense ou dans des situations physiopathologiques telles que l'inflammation ou les lésions cérébrales. Les canaux ioniques sensibles à l'acide (ASIC) sont activés par acidification et jouent un rôle important dans la détection des changements d'acide. Les ASICs contribuent à la dégénérescence neuronale après une lésion cérébrale, puisque leur inhibition limite la lésion neuronale. L'acidification induite par une inflammation du tissu nerveux conduit à des stimuli de douleur, qui sont détectés par ces canaux. En effet, les toxines qui bloquent spécifiquement les ASICs montrent des effets analgésiques dans des modèles animaux. La structure 3D d'ASIC peut être comparée à une main qui tient une boule entre son pouce et le doigt. Les différents domaines d'ASIC sont appelés doigt, pouce, jointure, boule-ß et paume. Les domaines transmembranaires représentent le poignet de cette main. Mon projet de thèse vise à décrire les mouvements survenant sur ce canal pendant son activité. A cet effet, j'ai utilisé une technique combinée qui permet la mesure des mouvements en temps réel durant l'activité du canal. J'ai montré les réarrangements des domaines extracellulaires pendant l'activité ASIC. Ces mouvements sont transmis au pore du canal, ou ils contrôlent sa fermeture et ouverture. La direction de ces mouvements a été évaluée pour les domaines doigt et jointure, et nous avons montré qu'ils s'éloignent de la boule-ß lors de l'acidification. J'ai également été en mesure de décrire les mouvements qui se produisent dans la poche acidique, une zone qui est considérée comme importante, car elle représente le site de liaison de certaines toxines de venin qui agissent sur les ASICs. J'ai ainsi pu montrer que les domaines doigt et le pouce qui forment la poche acidique se rapprochent l'un de l'autre pendant l'activation du canal. Ces résultats sont en accord avec des observations précédentes réalisées sur les ASICs par d'autres chercheurs. Enfin, cette analyse approfondie permet d'améliorer les connaissances sur le contrôle de l'activité ASIC; de plus, les mécanismes trouvés ici sont probablement partagés entre les canaux de la famille à laquelle appartiennent les ASICs. -- Les acid-sensing ion channels (ASICs) sont des canaux sodiques ouverts par les protons et principalement exprimés dans le système nerveux. Ils sont impliqués dans la détection des protons dans de nombreux états physiologiques et pathologiques comme l'ischémie et la perception de la douleur. La structure cristalline de l'isoforme ASIC1 de poulet a été déterminée dans l'état désensibilisé et ouvert. Les études fonctionnelles indiquent que la protonation des résidus clés dans la boucle extracellulaire déclenche des changements de conformation conduisant à l'ouverture du canal. Cependant, les mécanismes moléculaires qui relient la protonation à l'ouverture et la fermeture du canal n'ont pas encore été clarifiés. Dans cette étude, nous avons utilisé la voltage-clamp fluorimétrie (VCF) pour révéler les mouvements de l'activité associée qui se produisent dans les différents domaines de l'ASICla. Les fluorophores positionnés dans le pouce, la paume, le doigt, l'articulation et dans les domaines de l'entrée du pore extracellulaire ont montré des signaux de VCF liés à des changements de conformation au cours de l'activité du canal. La synchronisation des changements de fluorescence indique une séquence complexe de mouvements en fonction du pH. La cinétique de la fluorescence et des signaux de courant ont été comparés les uns aux autres afin de déterminer si le mouvement détecté par le signal de fluorescence correspond à une transition fonctionnelle définie du canal. Certains des résidus testés se sont révélés être étroitement liés à la désensibilisation du canal ou au rétablissement après la désensibilisation. En outre, nous avons trouvé qu'un tryptophane endogène de la boule-ß diminue le signal de fluorescence des sondes positionnées dans les domaines doigt et jointure. L'augmentation observée de ces signaux indique que ces domaines s'éloignent à une distance à partir de la boucle de la boule-ß. Sur la base de ce principe, nous avons généré des paires Trp-Cys « quencher», dans lequel le Cys est utilisé comme site d'ancrage pour attacher le fluorophore. Ensuite, nous avons évalué les changements de conformation qui se produisent au niveau de la poche acide, une zone importante pour la fonction et la régulation d'ASIC. Les signaux de fluorescence indiquent un mouvement de l'hélice supérieure du pouce vers le doigt et une rotation de la boule-ß dans le sens horaire. L'analyse de la cinétique indique que les mouvements des sous-domaines qui composent la poche acide se produisent pendant la désensibilisation du canal. Mon projet de doctorat représente la première analyse approfondie des changements conformationnels dépendants de l'activité des ASICs et fournit des informations sur les mécanismes de contrôle de l'activité du canal qui sont probablement partagés avec d'autres canaux proches.

Time-Lapse AFM Imaging of DNA Conformational Changes Induced by Daunorubicin.

Cancer is a major health issue that absorbs the attention of a large part of the biomedical research. Intercalating agents bind to DNA molecules and can inhibit their synthesis and transcription; thus, they are increasingly used as drugs to fight cancer. In this work, we show how atomic force microscopy in liquid can characterize, through time-lapse imaging, the dynamical influence of intercalating agents on the supercoiling of DNA, improving our understanding of the drug's effect.

Human immunoglobulins and Fc fragments promote microtubule assembly via tau proteins and induce conformational changes of neuronal microtubules in vitro.

The influence of human immunoglobulins (Ig) in neuronal cytoskeleton stability was studied in vitro. Here we show that human Ig and Fc fragments stimulate animal and human microtubule assembly by binding to microtubules via tau isoforms. In presence of Ig, microtubules show increased aggregation, twisting and rigidity. Non-immune Ig and Fc fragments promote microtubule assembly in temperature-dependent manner and stabilize microtubules at a molecular ratio of 1 Ig per 4 tubulin dimers. These in vitro data provide an experimental support for an immuno-mediated modulation of the cytoskeleton. In conjunction with previous neuropathological data, they suggest that Ig could participate in early stages of neurodegeneration by affecting the microtubule stability in vivo.

Conformational changes modulate the activity of human RAD51 protein.

Homologous recombination provides a major pathway for the repair of DNA double-strand breaks in mammalian cells. Defects in homologous recombination can lead to high levels of chromosomal translocations or deletions, which may promote cell transformation and cancer development. A key component of this process is RAD51. In comparison to RecA, the bacterial homologue, human RAD51 protein exhibits low-level strand-exchange activity in vitro. This activity can, however, be stimulated by the presence of high salt. Here, we have investigated the mechanistic basis for this stimulation. We show that high ionic strength favours the co-aggregation of RAD51-single-stranded DNA (ssDNA) nucleoprotein filaments with naked duplex DNA, to form a complex in which the search for homologous sequences takes place. High ionic strength allows differential binding of RAD51 to ssDNA and double-stranded DNA (dsDNA), such that ssDNA-RAD51 interactions are unaffected, whereas those between RAD51 and dsDNA are destabilized. Most importantly, high salt induces a conformational change in RAD51, leading to the formation of extended nucleoprotein filaments on ssDNA. These extended filaments mimic the active form of the Escherichia coli RecA-ssDNA filament that exhibits efficient strand-exchange activity.

Full activation of the T cell receptor requires both clustering and conformational changes at CD3.

T cell receptor (TCR-CD3) triggering involves both receptor clustering and conformational changes at the cytoplasmic tails of the CD3 subunits. The mechanism by which TCRalphabeta ligand binding confers conformational changes to CD3 is unknown. By using well-defined ligands, we showed that induction of the conformational change requires both multivalent engagement and the mobility restriction of the TCR-CD3 imposed by the plasma membrane. The conformational change is elicited by cooperative rearrangements of two TCR-CD3 complexes and does not require accompanying changes in the structure of the TCRalphabeta ectodomains. This conformational change at CD3 reverts upon ligand dissociation and is required for T cell activation. Thus, our permissive geometry model provides a molecular mechanism that rationalizes how the information of ligand binding to TCRalphabeta is transmitted to the CD3 subunits and to the intracellular signaling machinery.

Real-time monitoring of protein conformational changes using a nano-mechanical sensor.

Proteins can switch between different conformations in response to stimuli, such as pH or temperature variations, or to the binding of ligands. Such plasticity and its kinetics can have a crucial functional role, and their characterization has taken center stage in protein research. As an example, Topoisomerases are particularly interesting enzymes capable of managing tangled and supercoiled double-stranded DNA, thus facilitating many physiological processes. In this work, we describe the use of a cantilever-based nanomotion sensor to characterize the dynamics of human topoisomerase II (Topo II) enzymes and their response to different kinds of ligands, such as ATP, which enhance the conformational dynamics. The sensitivity and time resolution of this sensor allow determining quantitatively the correlation between the ATP concentration and the rate of Topo II conformational changes. Furthermore, we show how to rationalize the experimental results in a comprehensive model that takes into account both the physics of the cantilever and the dynamics of the ATPase cycle of the enzyme, shedding light on the kinetics of the process. Finally, we study the effect of aclarubicin, an anticancer drug, demonstrating that it affects directly the Topo II molecule inhibiting its conformational changes. These results pave the way to a new way of studying the intrinsic dynamics of proteins and of protein complexes allowing new applications ranging from fundamental proteomics to drug discovery and development and possibly to clinical practice.

Study of biomacromolecule conformational changes by Scanning Force Microscopy

L?objectif de ce travail de thèse est l?étude des changements conformationels des biomacromolecules à l?échelle d?une molécule unique. Pour cela on a utilisé la Microscopie à Force Atomique (AFM) appliqué à l?étude des protéines et des acides nucléiques déposés sur une surface. Dans ce type de microscopie, une pointe très fine attachée à l?extrémité d?un levier est balayée au dessus d?une surface. L?interaction de la pointe avec la surface de l?échantillon induit la déflection du levier et ce phénomène permet de reconstruire la topographie de l?échantillon. Très importante dans cette technique est la possibilité de travailler en liquide. Cela permet de étudier les biomolécules en conditions quasi-physiologiques sans qu?elles perdent leur activité. On a étudié GroEL, la chaperonin de E.coli, qui est un homo oligomère avec une structure à double anneau qui joue un rôle très important dans le repliement des protéines dénaturées et celles qui viennent d?être synthétisées. En particulier on a focalisé notre attention sur la stabilité mécanique et sur les changements conformationels qui ont lieu pendant l?activité de GroEL. Une analyse détaillée des changements dans la stabilité mécanique et des effets produits par la liaison et l?hydrolyse de l?ATP est présentée dans ce travail. On a montré que le point le plus faible dans la structure de GroEL est l?interface entre les deux anneaux et que l?étape critique dans l?affaiblissement de la structure est l?hydrolyse de l?ATP. En ce qui concerne le changement conformationel, le passage d?une surface hydrophobe à hydrophile, induit par l?hydrolyse de l?ATP, a été montré. Ensuite on a étudié le changement dans la conformation et dans la topologie de l?ADN résultant de l?interaction avec des molécules spécifiques et en réponse à l?exposition des cellules de E.coli à des conditions de stress. Le niveau de surenroulement est un paramètre très sensible, de façon variée, à tous ces facteurs. Les cellules qui ont crus à de températures plus élevées que leur température optimale ont la tendance à diminuer le nombre de surenroulements négatif pour augmenter la stabilité thermique de leur plasmides. L?interaction avec des agents intercalant induit une transition d?un surenroulement négatif à un surenroulement positif d?une façon dépendante de la température. Finalement, l?effet de l?interaction de l?ADN avec des surfaces différentes a été étudié et une application pratique sur les noeuds d?ADN est présentée.<br/><br/>The aim of the present thesis work is to study the conformational changes of biomacromolecules at the single molecule level. To that end, Atomic Force Microcopy (AFM) imaging was performed on proteins and nucleic acids adsorbed onto a surface. In this microcopy technique a very sharp tip attached at the end of a soft cantilever is scanned over a surface, the interaction of the tip with the sample?s surface will induce the deflection of the cantilever and thus it will make possible to reconstruct the topography. A very important feature of AFM is the possibility to operate in liquid, it means with the sample immersed in a buffer solution. This allows one to study biomolecules in quasi-physiological conditions without loosing their activity. We have studied GroEL, the chaperonin of E.coli, which is a double-ring homooligomer which pays a very important role in the refolding of unfolded and newly synthetized polypeptides. In particular we focus our attention on its mechanical stability and on the conformational change that it undergoes during its activity cycle. A detailed analysis of the change in mechanical stability and how it is affected by the binding and hydrolysis of nucleotides is presented. It has been shown that the weak point of the chaperonin complex is the interface between the two rings and that the critical step to weaken the structure is the hydrolysis of ATP. Concerning the conformational change we have directly measured, with a nanometer scale resolution, the switching from a hydrophobic surface to a hydrophilic one taking place inside its cavity induced by the ATP hydrolysis. We have further studied the change in the DNA conformation and topology as a consequence of the interaction with specific DNA-binding molecules and the exposition of the E.coli cells to stress conditions. The level of supercoiling has been shown to be a very sensitive parameter, even if at different extents, to all these factors. Cells grown at temperatures higher than their optimum one tend to decrease the number of the negative superhelical turns in their plasmids in order to increase their thermal stability. The interaction with intercalating molecules induced a transition from positive to negative supercoiling in a temperature dependent way. The effect of the interaction of the DNA with different surfaces has been investigated and a practical application to DNA complex knots is reported.<br/><br/>Observer les objets biologiques en le touchant Schématiquement le Microscope a Force Atomique (AFM) consiste en une pointe très fine fixée a l?extrémité d?un levier Lors de l?imagerie, la pointe de l?AFM gratte la surface de l?échantillon, la topographie de celui-ci induit des déflections du levier qui sont enregistrées au moyen d?un rayon laser réfléchi par le levier. Ces donnés sont ensuit utilisés par un ordinateur pour reconstituer en 3D la surface de l?échantillon. La résolution de l?instrument est fonction entre autre de la dureté, de la rugosité de l?échantillon et de la forme de la pointe. Selon l?échantillon et la pointe utilisée la résolution de l?AFM peut aller de 0.1 A (sur des cristaux) a quelque dizaine de nanomètres (sur des cellules). Cet instrument est particulierment intéressant en biologie en raison de sa capacité à imager des échantillons immergés dans un liquide, c?est à dire dans des conditions quasiphysiologiques. Dans le cadre de ce travail nous avons étudié les changements conformationels de molécules biologiques soumises à des stimulations externes. Nous avons essentielment concentré notre attention sur des complexes protéiques nommé Chaperons Moléculaires et sur des molécules d?ADN circulaire (plasmides). Les Chaperons sont impliqués entre autre dans la résistance des organismes vivants aux stress thermiques et osmotiques. Leur activité consiste essentielment à aider les autres protéines à être bien pliés dans leur conformation finale et, en conséquence, à eviter que ils soient dénaturées et que ils puissent s?agréger. L?ADN, quant à lui est la molécule qui conserve, dans sa séquence, l?information génétique de tous les organismes vivants. Ce travail a spécifiquement concerné l?étude des changements conformationels des chaperonins suit a leur activation par l?ATP. Ces travaux ont montrés a l?échelle de molécule unique la capacité de ces protéines de changer leur surface de hydrophobique a hydrophilique. Nous avons également utilisé l?AFM pour étudier le changement du nombre des surenroulements des molécules d?ADN circulaire lors d?une exposition à un changement de température et de force ionique. Ces travaux ont permis de montrer comment la cellule regle le nombre de surenroulements dans ces molécules pour répondre et contrôler l?expression génétique même dans de conditions extrêmes. Pour les deux molécules en général, c?était très important d?avoir la possibilité de observer leur transitions d?une conformation a l?autre directement a l?échelle d?une seul molécule et, surtout, avec une résolution largement au dessous des la longueur d?onde de la lumière visible que représente le limite pour l?imagerie optique.

Changes of MAP2 phosphorylation during brain development.

The microtubule-associated protein MAP2 is essential for development of early neuronal morphology and maintenance of adult neuronal morphology. Several splice variants exist, MAP2a-d, with a lack of MAP2a in cat brain. MAP2 is widely used as a neuronal marker. In this study we compared five monoclonal antibodies (MAbs) against MAP2. They show differences in the immunocytochemical distribution of MAP2 isoforms during development of the visual cortex and cerebellum of the cat. Local and temporal differences were seen with MAb AP18, an antibody directed against a phosphorylation-dependent epitope near the N-terminal end. In large pyramidal dendrites in visual cortex, the AP18 epitope remained in parts immunoreactive after treatment with alkaline phosphatase. Three MAbs, AP14, MT-01, and MT-02, recognized the central region of the MAP2b molecule, which is not present in MAP2c and 2d, and reacted with phosphorylation-independent epitopes. During the first postnatal week the immunostaining in cerebellum differed between antibodies in that some cellular elements in external and internal granular layers and Purkinje cells were stained to various degrees, whereas at later stages staining patterns were similar. At early stages, antibody MT-02 stained cell bodies and dendrites in cerebral cortex and cerebellum. With progressing maturation, immunoreactivity became restricted to distal parts of apical dendrites of pyramidal cells and was absent from perikarya and finer proximal dendrites in cortex. MT-02 did not stain MAP2 in cerebellum of adult animals. This study demonstrates that the immunocytochemical detection of MAP2 depends on modifications such as phosphorylation and conformational changes of the molecule, and that MAP2 staining patterns differ between MAbs. Phosphorylation and specific conformations in the molecule may be essential for modulating function and molecular stability of MAP2, and monoclonal antibodies against such sites may provide tools for studying the functional role of modifications.

Structure-function relationships of the alpha1b-adrenergic receptor.

The alpha1b-adrenergic receptor (AR) is a member of the large superfamily of seven transmembrane domain (TMD) G protein-coupled receptors (GPCR). Combining site-directed mutagenesis of the alpha1b-AR with computational simulations of receptor dynamics, we have explored the conformational changes underlying the process of receptor activation, i.e. the transition between the inactive and active states. Our findings suggest that the structural constraint stabilizing the alpha1b-AR in the inactive form is a network of H-bonding interactions amongst conserved residues forming a polar pocket and R143 of the DRY sequence at the end of TMDIII. We have recently reported that point mutations of D142, of the DRY sequence and of A293 in the distal portion of the third intracellular loop resulted in ligand-independent (constitutive) activation of the alpha1b-AR. These constitutively activating mutations could induce perturbations resulting in the shift of R143 out of the polar pocket. The main role of R143 may be to mediate receptor activation by triggering the exposure of several basic amino acids of the intracellular loops towards the G protein. Our investigation has been extended also to the biochemical events involved in the desensitization process of alpha1b-AR. Our results indicate that immediately following agonist-induced activation, the alpha1b-AR can undergo rapid agonist-induced phosphorylation and desensitization. Different members of the G protein coupled receptor kinase family can play a role in agonist-induced regulation of the alpha1b-AR. In addition, constitutively active alpha1b-AR mutants display different phosphorylation and internalization features. The future goal is to further elucidate the molecular mechanism underlying the complex equilibrium between activation and inactivation of the alpha1b-AR and its regulation by pharmacological substances. These findings can help to elucidate the mechanism of action of various agents displaying properties of agonists or inverse agonists at the adrenergic system.

Cathepsin X cleavage of the beta2 integrin regulates talin-binding and LFA-1 affinity in T cells.

T cell migration, essential for immune surveillance and response, is mediated by the integrin LFA-1. CatX, a cysteine carboxypeptidase, is involved in the regulation of T cell migration by interaction with LFA-1. We show that sequential cleavage of C-terminal amino acids from the β(2) cytoplasmic tail of LFA-1, by CatX, enhances binding of the adaptor protein talin to LFA-1 and triggers formation of the latter's high-affinity form. As shown by SPR analysis of peptides constituting the truncated β(2) tail, the cleavage of three C-terminal amino acids by CatX resulted in a 1.6-fold increase of talin binding. Removal of one more amino acid resulted in a 2.5-fold increase over the intact tail. CatX cleavage increased talin-binding affinity to the MD but not the MP talin-binding site on the β(2) tail. This was shown by molecular modeling of the β(2) tail/talin F3 complex to be a result of conformational changes affecting primarily the distal-binding site. Analysis of LFA-1 by conformation-specific mAb showed that CatX modulates LFA-1 affinity, promoting formation of high-affinity from intermediate-affinity LFA-1 but not the initial activation of LFA-1 from a bent to extended form. CatX post-translational modifications may thus represent a mechanism of LFA-1 fine-tuning that enables the trafficking of T cells.

Historical review: Negative efficacy and the constitutive activity of G-protein-coupled receptors.

The idea that a receptor can produce signalling without agonist intervention and that several antagonists can be 'active' in repressing such spontaneous activity is contained in the concept of ligand-induced conformational changes. Yet, this idea was neglected by pharmacologists for many years. In this article, we review the events that brought inverse agonism and constitutive activity to general attention and made this phenomenon a topic of current research. We also suggest a classification of antagonists based on the cooperativity that links their primary site of interaction with other functional domains of the receptor.

Biochemical characterization of recombinant human telomerase

Résumé Les télomères sont les structures ADN-protéines des extrémités des chromosomes des eucaryotes. L'ADN télomérique est constitué de courtes séquences répétitives. L'intégrité des télomères est essentielle pour protéger les extrémités des chromosomes contre les systèmes de dégradations et pour les distinguer des cassures de l'ADN double brin. Parce que la machinerie de la réplication de l'ADN n'est pas capable de répliquer l'extrémité des chromosomes, les télomères raccourcissent au fur et à mesure des cycles de réplication. Dès que les télomères atteignent une longueur critique, leur structure protectrice est perdue. Cela induit un signal de dommage de l'ADN et l'arrêt du cycle cellulaire. Pour contrebalancer le raccourcissement des télomères, les cellules qui s'auto régénèrent, dont les cellules de la moelle osseuse, les lymphocytes activés et 80-90% des cellules cancéreuses, expriment la télomérase. C'est une ribonucléoprotéine qui a la capacité de synthétiser des séquences télomériques par transcription inverse d'une courte séquence contenue dans sa propre sous-unité ARN avec laquelle elle est associée. La télomérase humaine est une enzyme processive au niveau de l'addition des nucléotides et aussi des répétitions télomériques. La télomérase de levure et la télomérase humaine sont toutes deux dimériques et il a été montré que la télomérase humaine recombinante contient deux ARN qui coopèrent pour fonctionner ainsi que deux sous-unités catalytiques. Cependant, il n'a pas encore été montré quel est le rôle de la dimérisation dans l'activité de la télomérase. Afin d'élucider ce rôle, nous avons exprimé, reconstitué et purifié la télomérase humaine dimérique recombinante. Et pour étudier l'effet d'ARN mutants sur l'activité de la télomérase, nous avons développé une méthode pour reconstituer et enrichir en hétérodimères de télomérase. Les hétérodimères contiennent une sous-unité ARN sauvage et une sous-unité ARN mutée au niveau de la séquence de la matrice. Sur l'ARN muté nous avons introduit une étiquette aptamer ARN-S1 puis nous avons purifié la télomérase via l'etiquette Si. Nous avons montré que la dimérisation est essentielle pour l'activité de la télomérase. Nos données indiquent que chaque télomérase du dimère allonge leur substrat, l'ADN télomérique, indépendamment l'une de l'autre à chaque cycle d'élongation mais que l'addition itérative de répétitions télomériques nécessite une coopération entre les deux télomérases du dimère. Nous proposons donc un modèle dans lequel les deux télomérases du dimères se lient et allongent deux substrats télomères et que pendant l'élongation processive les deux enzymes subissent un changement de conformation de manière coordonnée, ce changement va permettre le repositionnement des substrats pour d'autres cycles d'additions de répétitions télomériques. Dyskeratosis congenita est une maladie mortelle due majoritairement au disfonctionnement de la moelle osseuse. Dans la forme autosomale de la maladie, l'ARN de la télomérase contient des mutations. En utilisant notre système de reconstitution, nous avons montré que ces ARN mutés, qui ont perdu leur activité enzymatique dans le cas d'un homodimère de mutants, sont dominant négatifs quand ils sont présents dans les hétérodimères sauvage/mutant. Cet effet trans-dominant négatif pourrait contribuer à la progression de la maladie. Abstract Telomeres are protein-DNA structures at the ends of linear eukaryotic chromosomes. The telomeric DNA consists of tandemly repeated sequences. Telomeric integrity is essential to protect chromosomal ends from nucleolytic degradation and to prevent their recognition as DNA double strand breaks. Due to the inability of the conventional DNA replication machinery to replicate terminal DNA stretches, telomeres shorten with continuous rounds of DNA replication. As soon as telomeres reach a critical length, their protective structure is lost and the deprotected telomeres will induce a DNA damage response leading to cell cycle arrest. To counteract telomere shortening, self-renewing cells, including bone marrow cells, activated lymphocytes and 80-90% of cancer cells express the cellular reverse transcriptase telomerase, which has the capacity to synthesize telomeric repeats by reverse transcription of a short template sequence encoded by its stably associated RNA subunit. Human telomerase is a processive enzyme for nucleotide as well as repeat addition. Both yeast and human telomerase are dimeric enzymes and recombinant human telomerase has been shown to contain two functionally cooperating RNAs and most probably also two protein subunits. However, it has remained unclear how dimerization may contribute to telomerase activity. To study the role of dimerization, we expressed, reconstituted and purified recombinant human telomerase. We also developed a new method to reconstitute and enrich for telomerase heterodimers containing wild-type (wt) and mutant telomerase RNA subunits. To this end we introduced an S1-RNA-aptamer tag into telomerase RNA and purified telomerase reconstituted with a mixture of untagged and tagged RNA via the S1-tag. Using this experimental system, we introduced template mutations in the tagged RNA subunit and examined the effect of mutant RNAs on wt telomerase activity in wt/mutant heterodimers. We obtained evidence that dimerization is essential for telomerase activity. Our data indicate that the two subunits elongate telomere substrates independently of each other during single rounds of elongation, but that iterative addition of telomeric repeats requires cooperation between the two subunits. We suggest a model, in which dimeric telomerases bind and elongate two telomere substrates and that the two subunits undergo coordinated conformational changes during processive elongation that enable repositioning the substrates for subsequent rounds of repeat addition. Dyskeratosis congenita is a multisystemic disease with bone marrow failure as the major cause of death. The autosomal form of this disease was found to harbor mutations in the telomerase RNA. Using our reconstitution system, we tested whether mutant dyskeratosis telomerase RNAs behaved in a dominant negative manner. We observed that dyskeratosis telomerase RNA mutants, which lacked enzymatic activity were dominant negative, when present in wt/ mutant heterodimers. The transdominant negative effect of these mutants may contribute to disease progression.

A gating mutation in the internal pore of ASIC1a.

Using a substituted cysteine accessibility scan, we have investigated the structures that form the internal pore of the acid-sensing ion channel 1a. We have identified the amino acid residues Ala-22, Ile-33, and Phe-34 in the amino terminus and Arg-43 in the first transmembrane helix, which when mutated into cysteine, were modified by intracellular application of MTSET, resulting in channel inhibition. The inhibition of the R43C mutant by internal MTSET requires opening of the channel. In addition, binding of Cd2+ ions to R43C slows the channel inactivation. This indicates that the first transmembrane helix undergoes conformational changes during channel inactivation. The effect of Cd2+ on R43C can be obtained with Cd2+ applied at either the extracellular or the intracellular side, indicating that R43C is located in the channel pore. The block of the A22C, I33C, and F34C mutants by MTSET suggests that these residues in the amino terminus of the channel also participate to the internal pore.

Induction of MC-1 immunoreactivity in axons after injection of the Fc fragment of human immunoglobulins in macaque monkeys.

Although previous studies have suggested an increased activation of humoral immunity in neurodegenerative diseases, it remains unclear whether this phenomenon is secondary to lesion formation or contributes directly to their development. Using stereotaxic injections in macaque monkey cerebral cortex, we studied the effects of human immunoglobulins on the neuronal cytoskeleton. Under these conditions, several MC-1-immunoreactive axons were observed in the vicinity of injection site. No MC-1 or TG-3 staining was detected in neuronal soma. Ultrastructurally, several axons in the same area displayed curly formations and accumulation of twisted tubules but not paired helical filaments. These data suggest that Fc fragment induce conformational changes of tau and subtle structural alterations in axons in this model. Immunocytochemical analyses in human autopsy materials revealed the presence of human Fc fragments as well as Fc receptors only in large pyramidal neurons known to be vulnerable in brain aging and Alzheimer's disease, further supporting a possible role of immunoglobulins in neurodegeneration.