18F-FLT and 125I-IdUrd uptake increase in human tumour cell lines induced by the thymidylate synthase inhibitor FdUrd.

Aim: 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FdUrd) depletes the endogenous 5'-deoxythymidine triphosphate (dTTP) pool. We hypothesized whether uptake of exogenous dThd analogues could be favoured through a feedback enhanced salvage pathway and studied the FdUrd effect on cellular uptake of 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine (18F-FLT) and 5-125I-iodo-2'-deoxyuridine (125I-IdUrd) in different cancer cell lines in parallel. Methods: Cell uptake of 18F-FLT and 125I-IdUrd was studied in 2 human breast, 2 colon cancer and 2 glioblastoma lines. Cells were incubated with/without 1 µmol/l FdUrd for 1 h and, after washing, with 1.2 MBq 18F-FLT or 125I-IdUrd for 0.3 to 2 h. Cell bound 18F-FLT and 125I-IdUrd was counted and expressed in % incubated activity (%IA). Kinetics of 18F-FLT cell uptake and release were studied with/without FdUrd modulation. 2'-3H-methyl-fluorothymidine (2'-3H-FLT) uptake with/without FdUrd pretreatment was tested on U87 spheroids and monolayer cells. Results: Basal uptake at 2 h of 18F-FLT and 125I-IdUrd was in the range of 0.8-1.0 and 0.4-0.6 Bq/cell, respectively. FdUrd pretreatment enhanced 18F-FLT and 125I-IdUrd uptake 1.2-2.1 and 1.7-4.4 fold, respectively, while co-incubation with excess thymidine abrogated all 18F-FLT uptake. FdUrd enhanced 18F-FLT cellular inflow in 2 breast cancer lines by factors of 1.8 and 1.6, respectively, while outflow persisted at a slightly lower rate. 2'-3H-FLT basal uptake was very low while uptake increase after FdUrd was similar in U87 monolayer cells and spheroids. Conclusions: Basal uptake of 18F-FLT was frequently higher than that of 125I-IdUrd but FdUrd induced uptake enhancement was stronger for 125I-IdUrd in five of six cell lines. 18F-FLT outflow from cells might be an explanation for the observed difference with 125I-IdUrd.

Cellular delivery of pyrenyl-arene ruthenium complexes by a water-soluble arene ruthenium metalla-cage.

Three pyrenyl-arene ruthenium complexes (M(1)-M(3)) of the general formula [Ru(η(6)-arene-pyrenyl)Cl(2)(pta)] (pta = 1,3,5-triaza-7-phosphaadamantane) have been synthesised and characterised. Prior to the coordination to ruthenium, pyrene was connected to the arene ligand via an alkane chain containing different functional groups: ester (L(1)), ether (L(2)) and amide (L(3)), respectively. Furthermore, the pyrenyl moieties of the M(n) complexes were encapsulated within the hydrophobic cavity of the water soluble metalla-cage, [Ru(6)(η(6)-p-cymene)(6)(tpt)(2)(donq)(3)](6+) (tpt = 2,4,6-tri-(pyridin-4-yl)-1,3,5-triazine; donq = 5,8-dioxydo-1,4-naphthoquinonato), while the arene ruthenium end was pointing out of the cage, thus giving rise to the corresponding host-guest systems [M(n)⊂Ru(6)(η(6)-p-cymene)(6)(tpt)(2)(donq)(3)](6+) ([M(n)⊂cage](6+)). The antitumor activity of the pyrenyl-arene ruthenium complexes (M(n)) and the corresponding host-guest systems [M(n)⊂cage][CF(3)SO(3)](6) were evaluated in vitro in different types of human cancer cell lines (A549, A2780, A2780cisR, Me300 and HeLa). Complex M(2), which contains an ether group within the alkane chain, demonstrated at least a 10 times higher cytotoxicity than the reference compound [Ru(η(6)-p-cymene)Cl(2)(pta)] (RAPTA-C). All host-guest systems [M(n)⊂cage](6+) showed good anticancer activity with IC(50) values ranging from 2 to 8 μM after 72 h exposure. The fluorescence of the pyrenyl moiety allowed the monitoring of the cellular uptake and revealed an increase of uptake by a factor two of the M(2) complex when encapsulated in the metalla-cage [Ru(6)(η(6)-p-cymene)(6)(tpt)(2)(donq)(3)](6+).

Interaction of cationic ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles with human melanoma cells.

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles (USPIONs) are currently under development for the intracellular delivery of therapeutics. However, the mechanisms of cellular uptake and the cellular reaction to this uptake, independent of therapeutics, are not well defined. The interactions of biocompatible cationic aminoUSPIONs with human cells was studied in 2D and 3D cultures using biochemical and electron microscopy techniques. AminoUSPIONs were internalized by human melanoma cells in 2D and 3D cultures. Uptake was clathrin mediated and the particles localized in lysosomes, inducing activation of the lysosomal cathepsin D and decreasing the expression of the transferrin receptor in human melanoma cells and/or skin fibroblasts. AminoUSPIONs deeply invaded 3D spheroids of human melanoma cells. Thus, aminoUSPIONs can invade tumors and their uptake by human cells induces cell reaction.

Interaction between neuropeptide Y (NPY) and brain-derived neurotrophic factor in NPY-mediated neuroprotection against excitotoxicity : a role for microglia

The neuroprotective effect of neuropeptide Y (NPY) receptor activation was investigated in organotypic mouse hippocampal slice cultures exposed to the glutamate receptor agonist alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA). Exposure of 2-week-old slice cultures, derived from 7-day-old C57BL/6 mice, to 8 microm AMPA, for 24 h, induced degeneration of CA1 and CA3 pyramidal cells, as measured by cellular uptake of propidium iodide (PI). A significant neuroprotection, with a reduction of PI uptake in CA1 and CA3 pyramidal cell layers, was observed after incubation with a Y(2) receptor agonist [NPY(13-36), 300 nm]. This effect was sensitive to the presence of the selective Y(2) receptor antagonist (BIIE0246, 1 microm), but was not affected by addition of TrkB-Fc or by a neutralizing antibody against brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Moreover, addition of a Y(1) receptor antagonist (BIBP3226, 1 microm) or a NPY-neutralizing antibody helped to disclose a neuroprotective role of endogenous NPY in CA1 region. Cultures exposed to 8 microm AMPA for 24 h, displayed, as measured by an enzyme-linked immunosorbent assay, a significant increase in BDNF. In such cultures there was an up-regulation of neuronal TrkB immunoreactivity, as well as the presence of BDNF-immunoreactive microglial cells at sites of injury. Thus, an increase of AMPA-receptor mediated neurodegeneration, in the mouse hippocampus, was prevented by neuroprotective pathways activated by NPY receptors (Y(1) and Y(2)), which can be affected by BDNF released by microglia and neurons.

Mechanisms of interaction of therapeutic nanoparticles with cells

Nanoparticles (NPs) have gained a lot of interest in recent years due to their huge potential for applications in industry and medicine. Their unique properties offer a large number of attractive possibilities in the biomedical field, providing innovative tools for diagnosis of diseases and for novel therapies. Nevertheless, a deep understanding of their interactions with living tissues and the knowledge about their possible effects in the human body are necessary for the safe use of nanoparticulate formulations. The aim of this PhD project was to study in detail the interactions of therapeutic NPs with living cells, including cellular uptake and release, cellular localization and transport across the cell layers. Moreover, the effects of NPs on the cellular metabolic processes were determined using adapted in vitro assays. We evaluated the biological effect of several NPs potentially used in the biomedical field, including titanium dioxide (Ti02) NPs, 2-sized fluorescent silica NPs, ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) NPs, either uncoated or coated with oleic acid or with polyvinylamine (aminoPVA) and poly(lactic-co-glycolic acid) - polyethylene-oxide (PLGA-PEO) NPs. We have found that the NPs were internalized by the cells, depending on their size, chemical composition, surface coating and also depending on the cell line considered. The uptake of aminoPVA-coated USPIO NPs by endothelial cells was enhanced in the presence of an external magnetic field. None of the tested USPIO NPs and silica NPs was transported across confluent kidney cell layers or brain endothelial cell layers, even in the presence of a magnetic field. However, in an original endothelium-glioblastoma barrier model which was developed, uncoated USPIO NPs were directly transferred from endothelial cells to glioblastoma cells. Following uptake, Ti02 NPs and uncoated USPIO NPs were released by the kidney cells, but not by the endothelial cells. Furthermore, these NPs induced an oxidative stress and autophagy in brain endothelial cells, possibly associated with their enhanced agglomeration in cell medium. A significant DNA damage was found in brain endothelial cells after their exposure to TiO2NPs. Altogether these results extend the existing knowledge about the effects of NPs on living cells with regard to their physicochemical characteristics and provide interesting tools for further investigation. The development of the in vitro toxicological assays with a special consideration for risk evaluation aims to reduce the use of animal experiments. -Les nanoparticules (NPs) présentent beaucoup d'intérêt dans le domaine biomédical et industriel. Leurs propriétés uniques offrent un grand nombre de possibilités de solutions innovantes pour le diagnostique et la thérapie. Cependant, pour un usage sûr des NPs il est nécessaire d'acquérir une connaissance approfondie des mécanismes d'interactions des NPs avec les tissus vivants et de leur effets sur le corps humain. Le but de ce projet de thèse était d'étudier en détail les mécanismes d'interactions de NPs thérapeutiques avec des cellules vivantes, en particulier les mécanismes d'internalisation cellulaire et leur subséquente sécrétion par les cellules, leur localisation cellulaire, leur transport à travers des couches cellulaires, et l'évaluation des effets de NPs sur le métabolisme cellulaire, en adaptant les méthodes existante d'évaluation cyto-toxico logique s in vitro. Pour ces expériences, les effets biologiques de nanoparticules d'intérêt thérapeutique, telles que des NPs d'oxyde de titane (TiO2), des NPs fluorescents de silicate de 2 tailles différentes, des NPs, d'oxyde de fer super-para-magnétiques ultra-petites (USPIO), soit non- enrobées soit enrobées d'acide oléique ou de polyvinylamine (aminoPVA), et des NPs d'acide poly(lactique-co-glycolique)-polyethylene-oxide (PLGA-PEO) ont été évalués. Les résultats ont démontré que les NPs sont internalisées par les cellules en fonction de leur taille, composition chimique, enrobage de surface, et également du type de cellules utilisées. L'internalisation cellulaire des USPIO NPs a été augmentée en présence d'un aimant externe. Aucune des NPs de fer et de silicate n'a été transportée à travers des couches de cellules épithéliales du rein ou endothéliales du cerveau, même en présence d'un aimant. Cependant, en développant un modèle original de barrière endothélium-glioblastome, un transfert direct de NPs d'oxyde de fer de cellule endothéliale à cellule de glioblastome a été démontré. A la suite de leur internalisation les NPs d'oxyde de fer et de titane sont relâchées par des cellules épithéliales du rein, mais pas des cellules endothéliales du cerveau. Dans les cellules endothéliales du cerveau ces NPs induisent en fonction de leur état d'agglomération un stress oxydatif et des mécanismes d'autophagie, ainsi que des dommages à l'ADN des cellules exposées aux NPs d'oxyde de titane. En conclusion, les résultats obtenus élargissent les connaissances sur les effets exercés par des NPs sur des cellules vivantes et ont permis de développer les outils expérimentaux pour étudier ces effets in vitro, réduisant ainsi le recours à des expériences sur animaux.

Reversible and irreversible pollutant-induced bacterial cellular stress effects measured by ethidium bromide uptake and efflux.

Chemical pollution is known to affect microbial community composition but it is poorly understood how toxic compounds influence physiology of single cells that may lay at the basis of loss of reproductive fitness. Here we analyze physiological disturbances of a variety of chemical pollutants at single cell level using the bacterium Pseudomonas fluorescens in an oligotrophic growth assay. As a proxy for physiological disturbance we measured changes in geometric mean ethidium bromide (EB) fluorescence intensities in subpopulations of live and dividing cells exposed or not exposed to different dosages of tetradecane, 4-chlorophenol, 2-chlorobiphenyl, naphthalene, benzene, mercury chloride, or water-dissolved oil fractions. Because ethidium bromide efflux is an energy-dependent process any disturbance in cellular energy generation is visible as an increased cytoplasmic fluorescence. Interestingly, all pollutants even at the lowest dosage of 1 nmol/mL culture produced significantly increased ethidium bromide fluorescence compared to nonexposed controls. Ethidium bromide fluorescence intensities increased upon pollutant exposure dosage up to a saturation level, and were weakly (r(2) = 0.3905) inversely correlated to the proportion of live cells at that time point in culture. Temporal increase in EB fluorescence of growing cells is indicative for toxic but reversible effects. Cells displaying high continued EB fluorescence levels experience constant and permanent damage, and no longer contribute to population growth. The procedure developed here using bacterial ethidium bromide efflux pump activity may be a useful complement to screen sublethal toxicity effects of chemicals.

Proteomics fingerprinting of phagosome maturation and evidence for the role of a Galpha during uptake.

Phagocytosis, whether of food particles in protozoa or bacteria and cell remnants in the metazoan immune system, is a conserved process. The particles are taken up into phagosomes, which then undergo complex remodeling of their components, called maturation. By using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry combined with genomic data, we identified 179 phagosomal proteins in the amoeba Dictyostelium, including components of signal transduction, membrane traffic, and the cytoskeleton. By carrying out this proteomics analysis over the course of maturation, we obtained time profiles for 1,388 spots and thus generated a dynamic record of phagosomal protein composition. Clustering of the time profiles revealed five clusters and 24 functional groups that were mapped onto a flow chart of maturation. Two heterotrimeric G protein subunits, Galpha4 and Gbeta, appeared at the earliest times. We showed that mutations in the genes encoding these two proteins produce a phagocytic uptake defect in Dictyostelium. This analysis of phagosome protein dynamics provides a reference point for future genetic and functional investigations.

A cell biological view of the siderophore pyochelin iron uptake pathway in Pseudomonas aeruginosa.

Pyochelin (PCH) is a siderophore produced and secreted by Pseudomonas aeruginosa for iron capture. Using (55) Fe uptake and binding assays, we showed that PCH-Fe uptake in P. aeruginosa involves, in addition to the highly studied outer membrane transporter FptA, the inner membrane permease FptX, which recognizes PCH-(55) Fe with an affinity of 0.6 ± 0.2 nM and transports the ferri-siderophore complex from the periplasm into the cytoplasm: fptX deletion inhibited (55) Fe accumulation in the bacterial cytoplasm. Chromosomal replacement was used to generate P. aeruginosa strains producing fluorescent fusions with FptX, PchR (an AraC regulator), PchA (the first enzyme involved in the PCH biosynthesis) and PchE (a non-ribosomic peptide-synthetase involved in a further step). Fluorescence imaging and cellular fractionation showed a uniform repartition of FptX in the inner membrane. PchA and PchE were found in the cytoplasm, associated to the inner membrane all over the bacteria and also concentrated at the bacterial poles. PchE clustering at the bacterial poles was dependent on PchA expression, but on the opposite PchA clustering and membrane association was PchE-independent. PchA and PchE cellular organization suggests the existence of a siderosome for PCH biosynthesis as previously proposed for pyoverdine biosynthesis (another siderophore produced by P. aeruginosa).

Modulation of the airway allergic response : characterization of the cellular and molecular mechanisms

ABSTRACT Allergic asthma is a major complication of atopy. Its severity correlates with the presence of activated T lymphocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Mechanisms that protect against asthma are poorly understood. Based on oral models of mucosal tolerance induction, models using the nasal route showed that uptake of important amounts of antigen can induce tolerance and reverse the allergic phenotype. 1L-10 producing regulatory T cells were proposed as key players in tolerance induction, but other players, e.g. dendritic cells (DC), B cells and epithelial cells may have to be taken into consideration. The objective of the present study is to characterize the effects of a therapeutic intranasal treatment (INT) in a murine model of asthma and to determine, in this model, the cellular and molecular mechanisms leading to protection against asthma. First, we established an asthma model by sensitizing the BALB/c mouse to ovalbumin (OVA) by two intraperitoneal injections of alum-adsorbed OVA and three inhalations of aerosolized OVA. Then OVA was applied to the nasal mucosa of OVA- sensitized mice. Mice were later re-exposed to OVA aerosols to assess the protection induced by OVA INT. OVA sensitization induced strong eosinophil recruitment, OVA-specific T cell proliferation and IgE production. Three intranasal treatments at 24-hour intervals with 1.5 mg OVA drastically reduced inflammatory cell recruitment into the BALF and inhibited OVA-specific IgE production upon allergen re-exposure. T cell proliferation in ex vivo bronchial lymph node (BLN) cells was inhibited, as well as TH2 cytokine production. Protection against OVA-induced bronchial inflammation was effective for an extended period of time and treated mice resisted a second re-exposure. Transfer of CD4+ cells from BLN and lungs of OVA-treated mice protected asthmatic recipient mice from subsequent aerosol challenge indicating an involvement of CD4+ T regulatory cells in this protection. RESUME L'asthme allergique est une manifestation clinique majeure de l'atopie. La sévérité de l'asthme est liée à la présence de lymphocytes T activés ainsi que d'éosinophiles dans le lavage broncho-alvéolaire (LBA). Les mécanismes permettant de se prémunir contre l'asthme sont mal connus. Basés sur des modèles muqueux d'induction de tolérance par la voie orale, des modèles utilisant la voie nasale ont montré que d'importantes quantités d'antigène peuvent induire une tolérance et ainsi reverser le phénotype allergique. Des cellules régulatrices produisant de l'IL-10 pourraient jouer un rôle clé dans l'induction de la tolérance mais d'autres acteurs tels que les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules épithéliales doivent aussi être prises en compte. L'objectif de la présente étude est de caractériser les effets d'un traitement intranasal thérapeutique dans un modèle murin d'asthme et de déterminer dans ce modèle les mécanismes cellulaires et moléculaires conférant une protection contre l'asthme. En premier lieu, un modèle d'asthme allergique a été établi en sensibilisant des souris BALB/c à l'ovalbumine (OVA) par deux injections intraperitonéales d'OVA adsorbé sur de l'alum et trois séances d'OVA en aérosol. Dans un second temps, de l'OVA a été administrée sur la muqueuse nasale des souris sensibilisées à l'OVA. Les souris furent ensuite challengées par des aérosols d'OVA afin d'évaluer la protection conférée par le traitement intranasal à l'OVA. La sensibilisation à l'OVA a induit un fort recrutement d'éosinophiles, une réponse proliférative des cellules T à l'OVA ainsi qu'une production d'lgE spécifiques. Trois traitements intranasaux à 24 heures d'intervalle avec 1.5 mg d'OVA ont permis de réduire drastiquement le recrutement des cellules inflammatoires dans le LBA ainsi que d'inhiber la production d'lgE spécifiques à l'OVA produits lors d'une ré-exposition à l'OVA. La prolifération en réponse à l'OVA de cellules extraites ex vivo de ganglions bronchiques a, elle aussi, été inhibée de même que la production de cytokines TH2. La protection contre l'inflammation provoquée par l'aérosol est efficace pour une longue période et les souris traitées résistent à une seconde ré- exposition. Le transfert de cellules CD4+ issues de ganglions bronchiques et de poumons de souris traitées à l'OVA protège les souris asthmatiques receveuses contre les effets inflammatoires d'un aérosol, indiquant que des cellules T CD4+ régulatrices pourraient être impliquées dans cette protection. RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC L'asthme est une affection des voies respiratoires qui se caractérise par une contraction de la musculature des voies aériennes, une production de mucus et d'anticorps de l'allergie (IgE). On parle d'asthme allergique lorsque les facteurs déclenchant l'asthme sont des allergènes inhalés tels que acariens, pollens ou poils d'animaux. Le système immunitaire des patients asthmatiques a un défaut de programmation qui le rend réactif à des substances qui sont normalement inoffensives. Le traitement actuel de l'asthme repose sur le soulagement des symptômes grâce à des produits à base de stéroïdes. Les techniques permettant de reprogrammer le système immunitaire (immunothérapie) ne sont pas efficaces pour tous les antigènes et prennent beaucoup de temps. En conséquence, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant une telle reprogrammation afin d'en améliorer le rendement et l'efficacité. Dans ce but, des modèles d'immunothérapie ont été mis au point chez la souris. Ils permettent une plus grande liberté d'investigation. Dans cette étude, un modèle d'asthme allergique dans la souris a été établi par une sensibilisation à un antigène particulier : l'ovalbumine (OVA). Ce modèle présente les caractéristiques principales de l'asthme humain : recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons, augmentation de la production d'anticorps et de la résistance des bronches aux flux respiratoires. Cette souris asthmatique a ensuite été traitée par application nasale d'OVA. Comparées aux souris non traitées, les souris traitées à l'OVA ont moins de cellules inflammatoires dans leurs poumons et produisent moins d'anticorps IgE. D'autres marqueurs inflammatoires sont aussi fortement diminués. Des cellules de poumons ou de ganglions bronchiques prélevées sur des souris traitées injectées dans des souris asthmatiques améliorent les symptômes de l'asthme. Ces cellules pourraient donc avoir un rôle régulateur dans l'asthme. Les caractériser et les étudier afin d'être capable de les générer est crucial pour les futures thérapies de l'asthme.

Uptake of particulate vaccine adjuvants by dendritic cells activates the NALP3 inflammasome.

Many currently used and candidate vaccine adjuvants are particulate in nature, but their mechanism of action is not well understood. Here, we show that particulate adjuvants, including biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLG) and polystyrene microparticles, dramatically enhance secretion of interleukin-1beta (IL-1beta) by dendritic cells (DCs). The ability of particulates to promote IL-1beta secretion and caspase 1 activation required particle uptake by DCs and NALP3. Uptake of microparticles induced lysosomal damage, whereas particle-mediated enhancement of IL-1beta secretion required phagosomal acidification and the lysosomal cysteine protease cathepsin B, suggesting a role for lysosomal damage in inflammasome activation. Although the presence of a Toll-like receptor (TLR) agonist was required to induce IL-1beta production in vitro, injection of the adjuvants in the absence of TLR agonists induced IL-1beta production at the injection site, indicating that endogenous factors can synergize with particulates to promote inflammasome activation. The enhancement of antigen-specific antibody production by PLG microparticles was independent of NALP3. However, the ability of PLG microparticles to promote antigen-specific IL-6 production by T cells and the recruitment and activation of a population of CD11b(+)Gr1(-) cells required NALP3. Our data demonstrate that uptake of microparticulate adjuvants by DCs activates the NALP3 inflammasome, and this contributes to their enhancing effects on innate and antigen-specific cellular immunity.

Brain lactate kinetics: Modeling evidence for neuronal lactate uptake upon activation.

A critical issue in brain energy metabolism is whether lactate produced within the brain by astrocytes is taken up and metabolized by neurons upon activation. Although there is ample evidence that neurons can efficiently use lactate as an energy substrate, at least in vitro, few experimental data exist to indicate that it is indeed the case in vivo. To address this question, we used a modeling approach to determine which mechanisms are necessary to explain typical brain lactate kinetics observed upon activation. On the basis of a previously validated model that takes into account the compartmentalization of energy metabolism, we developed a mathematical model of brain lactate kinetics, which was applied to published data describing the changes in extracellular lactate levels upon activation. Results show that the initial dip in the extracellular lactate concentration observed at the onset of stimulation can only be satisfactorily explained by a rapid uptake within an intraparenchymal cellular compartment. In contrast, neither blood flow increase, nor extracellular pH variation can be major causes of the lactate initial dip, whereas tissue lactate diffusion only tends to reduce its amplitude. The kinetic properties of monocarboxylate transporter isoforms strongly suggest that neurons represent the most likely compartment for activation-induced lactate uptake and that neuronal lactate utilization occurring early after activation onset is responsible for the initial dip in brain lactate levels observed in both animals and humans.

Defining molecular components of symbiotic phosphate uptake in rice

Phosphate (Pi) acquisition of crops via arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis acquires increasing importance due to the limited rock Pi reserves and the demand for environmentally sustainable agriculture. However, the symbiotic Pi uptake machinery has not been characterized in any monocotyledonous plant species. Among these, rice is the primary staple food for more than half of the human population and thus central for future food security. However, the relevance of the AM symbiosis for rice Pi nutrition is presently unclear. Here, we show that 70% of the overall Pi acquired by rice is delivered via the symbiotic route. To better understand this pathway we combined genetic, molecular and physiological approaches to determine the specific functions of the two rice Pi transporters, PT11 and PT13, which are expressed only during AM symbiosis. The PT11 lineage of proteins is present in mono- and dicotyledons whereas PT13, while found across the Poaceae, is absent from dicotyledons. Surprisingly, mutations in either PT11 or PT13 affected fungal colonization and arbuscule formation demonstrating that both genes are essential for AM symbiosis between rice and Glomus intra.rad.ices. Importantly, for symbiotic Pi uptake, only PT11 is necessary and sufficient. We found that mycorrhizal rice, remarkably, received almost all Pi via the symbiotic route. Such dominating mycorrhizal Pi uptake was found in plants grown under controlled conditions as well as in field soils, suggesting that the AM symbiosis is relevant for the Pi nutrition of field grown rice. Development of smaller arbuscules in PT11 mutants suggested that symbiotic Pi signaling is required for fungal nourishment by the plant. However, co-culture of mutant with wild type nurse plants did not restore normal arbuscule size in mutant roots, indicating that other factors than malnutrition accounted for the altered arbuscule phenotype. Surprisingly, the loss of PT13 did not affect symbiotic Pi uptake although it impacted arbuscule morphology, suggesting that PT13 is involved in signaling during arbuscule development. However, induction of PT13 was not only monitored in arbusculated cells but also in inner cortex cells of non-inoculated roots of plants grown under high Pi fertilization conditions. According to preliminary observations, PT13 localized at the tonoplast in arbusculated and non-arbusculated cells, suggesting that it might be involved in transporting Pi into the vacuole, possibly for maintaining cellular Pi homeostasis. The further investigation showed that fungal colonization level was significantly affected in the crown roots of two ptlS mutant alleles, but not in large lateral roots, implying the possible role of PT13 for maintaining Pi homeostasis in the crown roots. - L'acquisition de phosphate (Pi) par les plantes cultivées s'effectue grâce à une symbiose mycorhizienne arbasculaire (AM). L'étude de cette symbiose devient fondamentale puisque d'une part, les réserves en phosphate minéral sont limitées, et, d'autre part, la demande pour une agriculture écologiquement soutenable se renforce. La machinerie d'absorption symbiotique du phosphate n'est cependant pas encore élucidée chez les plantes monocotylédones. Parmi celles-ci, le riz occupe une place primordiale. Aliment de base pour plus de la moitié de la population mondiale, il revêt de ce fait une dimension essentielle en termes de sécurité alimentaire. Pourtant, l'importance de la symbiose AM chez le riz dans le processus d'acquisition du phosphate n'est, encore de nos jours, que peu comprise. Dans cette étude, nous montrons que 70% du phosphate acquis par le riz est mis à disposition de la plante grâce à la symbiose AM. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons employé des approches physiologiques et génétiques nous permettant de déterminer les fonctions spécifiques de deux transporteurs de Pi, PT11 et PT13, présents chez le riz et exprimés uniquement durant la symbiose AM. La famille de gènes à laquelle appartient PT11 est présente chez les monocotylédones ainsi que chez les dicotylédones tandis que PT13, bien que retrouvé au sein des Poaceae, est absent chez les dicotylédones. Etonnamment, des versions mutées de PT11 ou de PT13 affectent la colonisation par le champignon endo-mycorhizien ainsi que la formation d'arbuscules, démontrant l'importance de ces deux gènes dans la symbiose AM entre le riz et Glomus intraradices. Il est à noter que seul PT11 se révèle nécessaire et suffisant pour l'apport de Pi grâce à la symbiose. Nous avons observé que la presque totalité du phosphate dont dispose le riz lors d'une symbiose AM provient du champignon. De telles proportions ont été observées tant chez des plantes cultivées en conditions contrôlées que chez des plantes cultivées dans les champs. Cela suggère l'importance de la symbiose AM dans le processus d'acquisition du Pi chez le riz cultivé à l'extérieur. Le développement d'arbuscules plus petits chez le mutant PT11 tend à montrer qu'une voie signalétique impliquant le Pi symbiotique est nécessaire pour l'entretien du champignon par la plante. Toutefois, une co-culture du mutant avec des plantes sauvages ne permet pas de restaurer des arbuscules de taille normale dans les racines du mutant. Ce résultat indique le rôle de facteurs autres que la malnutrition aboutissant à la formation d'arbuscules altérés. Si la perte de PT13 n'affecte pas l'acquisition de phosphate symbiotique, la morphologie de l'arbuscule est, quant à elle, modifiée. Ceci suggère un rôle de PT13 durant le développement de l'arbuscule. Or, l'induction de PT13 est non seulement détectée dans des cellules contenant des arbuscules mais également dans des cellules du cortex, ceci chez des plantes cultivées sans champignon mais dans des conditions de fortes concentrations en engrais phosphaté. En accord avec des observations précédentes, PT13 est localisé au niveau du tonoplaste des cellules contenant ou non des arbuscules. Ceci suggère que PT13 pourrait être impliqué dans le transport du Pi vers la vacuole, éventuellement pour maintenir une certaine homéostasie du phosphate. Dans cette étude, nous démontrons également que le niveau de colonisation par le champignon est affecté de manière significative dans les racines principales des deux allèles du mutants ptl3, mais pas dans les grosses racines latérales. Cela impliquerait un rôle possible de PT13 dans le maintien de l'homéostasie du phosphate dans les racines principales. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Le phosphate (Pi), l'un des éléments minéraux essentiel au développement des plantes, se trouve généralement en faible quantité dans le sol, limitant ainsi la croissance des plantes. Le rendement de la production agricole dépend dès lors de l'addition d'engrais contenant du phosphate inorganique (Pi), obtenu à partir de ressources minières riches en phosphate. Or, ces ressources devraient être épuisées d'ici la fin du siècle. Les racines des plantes possèdent des transporteurs de phosphate efficaces leur permettant d'acquérir rapidement le Pi présent dans le sol. Comme le Pi s'avère immobile dans le sol, l'absorption rapide par les racines crée des zones pauvres en Pi autour des systèmes racinaires. Pour surmonter cet obstacle, les plantes ont développé une symbiose avec des champignons endomycorhiziens, la symbiose mycorhizienne arbusculaire (AM). Cette association leur donne accès à d'autres ressources en phosphate puisque le mycélium de ces champignons se développe sur une surface 100 fois supérieure à celle des racines. Cela augmente considérablement la surface de nutrition, dépassant ainsi la zone appauvrie en Pi. Le phosphate, transporté grâce au champignon jusqu'à l'intérieur des racines, est fourni à la plante par le biais de structures établies à l'intérieur des cellules végétales, appelées arbuscules. De leur côté, les plantes possèdent des transporteurs spécifiques afin de recevoir le Pi fourni par les champignons. A l'heure actuelle, la machinerie nécessaire à cette absorption a été uniquement décrite chez des plantes dicotylédones. Or, comprendre l'apport de phosphate par les champignons mycorhiziens s'avère particulièrement pertinent dans le cas des espèces monocotylédones cultivées telles que les céréales. Ces dernières constituent en effet la majeure partie de l'alimentation humaine. Parmi les céréales, le riz demeure l'aliment de base de la population mondiale, d'où son importance en terme de sécurité alimentaire. Durant mon travail de thèse, j'ai identifié et caractérisé le transporteur du riz impliqué dans l'apport de phosphate par ce type de symbiose AM. J'ai également démontré que le riz, lorsqu'il vit en symbiose, bénéficie de la presque totalité du Pi transporté par le champignon. Environ 40% de la production globale de riz est cultivée dans des conditions permettant la symbiose avec des mycorhizes arbusculaires. Les variétés de riz adaptées à ces conditions aérobiques deviennent des alternatives favorables aux cultivars actuels nécessitant une forte irrigation. Elles se révèlent en effet plus tolérantes aux pénuries d'eau et permettent l'utilisation de pratiques agricoles moins intensives. Les données présentées dans cette étude enrichissent nos connaissances concernant l'absorption du phosphate chez le riz grâce à la symbiose AM. Ces connaissances peuvent s'avérer décisives pour le développement de cultivars du riz plus adaptés à une agriculture écologiquement soutenable.

Roles of astrocytic sodium dynamics in the neurometabolic coupling : a study by cellular imaging

RESUME LARGE PUBLIC Le système nerveux central est principalement composé de deux types de cellules :les neurones et les cellules gliales. Ces dernières, bien que l'emportant en nombre sur les neurones, ont longtemps été considérées comme des cellules sans intérêts par les neuroscientifiques. Hors, les connaissances modernes à leurs sujets indiquent qu'elles participent à la plupart des tâches physiologiques du cerveau. Plus particulièrement, elles prennent part aux processus énergétiques cérébraux. Ceux-ci, en plus d'être vitaux, sont particulièrement intrigants puisque le cerveau représente seulement 2 % de la masse corporelle mais consomme environ 25 % du glucose (substrat énergétique) corporel. Les astrocytes, un type de cellules gliales, jouent un rôle primordial dans cette formidable utilisation de glucose par le cerveau. En effet, l'activité neuronale (transmission de l'influx nerveux) est accompagnée d'une augmentation de la capture de glucose, issu de la circulation sanguine, par les astrocytes. Ce phénomène est appelé le «couplage neurométabolique » entre neurones et astrocytes. L'ion sodium fait partie des mécanismes cellulaires entrant en fonction lors de ces processus. Ainsi, dans le cadre de cette thèse, les aspects dynamiques de la régulation du sodium astrocytaire et leurs implications dans le couplage neurométabolique ont été étudiés par des techniques d'imagerie cellulaires. Ces études ont démontré que les mitochondries, machineries cellulaires convertissant l'énergie contenue dans le glucose, participent à la régulation du sodium astrocytaire. De plus, ce travail de thèse a permis de découvrir que les astrocytes sont capables de se transmettre, sous forme de vagues de sodium se propageant de cellules en cellules, un message donnant l'ordre d'accroître leur consommation d'énergie. Cette voie de signalisation leur permettrait de fournir de l'énergie aux neurones suite à leur activation. RESUME Le glutamate libéré dans la fente synaptique pendant l'activité neuronale, est éliminé par les astrocytes environnants. Le glutamate est co-transporté avec des ions sodiques, induisant une augmentation intracellulaire de sodium (Na+i) dans les astrocytes. Cette élévation de Na+i déclenche une cascade de mécanismes moléculaires qui aboutissent à la production de substrats énergétiques pouvant être utilisés par les neurones. Durant cette thèse, la mesure simultanée du sodium mitochondrial (Na+mit) et cytosolique par des techniques d'imagerie utilisant des sondes fluorescentes spécifiques, a indiqué que les variations de Na+i induites par le transport du glutamate sont transmises aux mitochondries. De plus, les voies d'entrée et de sortie du sodium mitochondrial ont été identifiées. L'échangeur de Na+ et de Ca2+ mitochondrial semble jouer un rôle primordial dans l'influx de Na+mit, alors que l'efflux de Na+mit est pris en charge par l'échangeur de Na+ et de H+ mitochondrial. L'étude du Na+mit a nécessité l'utilisation d'un système de photoactivation. Les sources de lumière ultraviolette (UV) classiques utilisées à cet effet (lasers, lampes à flash) ayant plusieurs désavantages, une alternative efficace et peu coûteuse a été développée. Il s'agit d'un système compact utilisant une diode électroluminescente (LED) à haute puissance et de longueur d'onde de 365nm. En plus de leurs rôles dans le couplage neurométabolique, les astrocytes participent à la signalisation multicellulaire en transmettant des vagues intercellulaires de calcium. Ce travail de thèse démontre également que des vagues intercellulaires de sodium peuvent être évoquées en parallèle à ces vagues calciques. Le glutamate, suite à sa libération par un mécanisme dépendent du calcium, est réabsorbé par les transporteurs au glutamate. Ce mécanisme a pour conséquence la génération de vagues sodiques se propageant de cellules en cellules. De plus, ces vagues sodiques sont corrélées spatialement avec une consommation accrue de glucose par les astrocytes. En conclusion, ce travail de thèse a permis de montrer que le signal sodique astrocytaire, déclenché en réponse au glutamate, se propage à la fois de façon intracellulaire aux mitochondries et de façon intercellulaire. Ces résultats suggèrent que les astrocytes fonctionnent comme un réseau de cellules nécessaire au couplage énergétique concerté entre neurones et astrocytes et que le sodium est un élément clé dans les mécanismes de signalisations cellulaires sous-jacents. SUMMARY Glutamate, released in the synaptic cleft during neuronal activity, is removed by surrounding astrocytes. Glutamate is taken-up with Na+ ions by specific transporters, inducing an intracellular Na+ (Na+i) elevation in astrocytes which triggers a cascade of molecular mechanisms that provides metabolic substrates to neurons. Thus, astrocytic Na+i homeostasis represents a key component of the so-called neurometabolic coupling. In this context, the first part of this thesis work was aimed at investigating whether cytosolic Na+ changes are transmitted to mitochondria, which could therefore influence their function and contribute to the overall intracellular Na+ regulation. Simultaneous monitoring of both mitochondrial Na+ (Na+mit) and cytosolic Na+ changes with fluorescent dyes revealed that glutamate-evoked cytosolic Na+ elevations are indeed transmitted to mitochondria. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchangers have a prominent role in the regulation of Na+mit influx pathway, and Na+mit extrusion appears to be mediated by Na+/H+ exchangers. To demonstrate the implication of Na+/Ca2+ exchangers, this study has required the technical development of an UV-flash photolysis system. Because light sources for flash photolysis have to be powerful and in the near UV range, the use of UV lasers or flash lamps is usually required. As an alternative to these UV sources that have several drawbaks, we developped a compact, efficient and lowcost flash photolysis system which employs a high power 365nm light emitting diode. In addition to their role in neurometabolic coupling, astrocytes participate in multicellular signaling by transmitting intercellular Ca2+ waves. The third part of this thesis show that intercellular Na+ waves can be evoked in parallel to Ca2+ waves. Glutamate released by a Ca2+ wave-dependent mechanism is taken up by glutamate transporters, resulting in a regenerative propagation of cytosolic Na+ increases. Na+ waves in turn lead to a spatially correlated increase in glucose uptake. In conclusion, the present thesis demonstrates that glutamate-induced Na+ changes occurring in the cytosol of astrocytes propagate to both the mitochondrial matrix and the astrocytic network. These results furthermore support the view that astrocytic Na+ is a signal coupled to the brain energy metabolism.

Anthracene-tethered ruthenium(II) arene complexes as tools to visualize the cellular localization of putative organometallic anticancer compounds.

Anthracene derivatives of ruthenium(II) arene compounds with 1,3,5-triaza-7-phosphatricyclo[3.3.1.1]decane (pta) or a sugar phosphite ligand, viz., 3,5,6-bicyclophosphite-1,2-O-isopropylidene-α-d-glucofuranoside, were prepared in order to evaluate their anticancer properties compared to the parent compounds and to use them as models for intracellular visualization by fluorescence microscopy. Similar IC(50) values were obtained in cell proliferation assays, and similar levels of uptake and accumulation were also established. The X-ray structure of [{Ru(η(6)-C(6)H(5)CH(2)NHCO-anthracene)Cl(2)(pta)] is also reported.

Study of the incorporation and the anti-tumour efficacy of radio-iododeoxyuridine according to the cellular cycle and in presence of synthesis inhibitor of thymidine

Résumé La iododeoxyuridine (IdUrd), une fois marqué au 123I ou au 125I, est un agent potentiel pour des thérapies par rayonnements Auger. Cependant, des limitations restreignent son incorporation dans l'ADN. Afin d'augmenter celle-ci, différents groupes ont étudié la fluorodeoxyuridine (FdUrd), qui favorise l'incorporation d'analogue de la thymidine, sans toutefois parvenir à une toxicité associé plus importante. Dans notre approche, 3 lignées cellulaires de glioblastomes humains et une lignée de cancer ovarien ont été utilisées. Nous avons observé, 16 à 24 h après un court pré-traitement à la FdUrd, un fort pourcentage de cellules s'accumulant en phase S. Plus qu'une accumulation, c'était une synchronisation des cellules, celles-ci restant capables d'incorporer la radio-IdIrd et repartant dans le cycle cellulaire. De plus, ces cellules accumulées après un pré-traitement à la FdUrd étaient plus radio-sensibles. Après le même intervalle de 16 à 24 h suivant la FdUrd, les 4 lignées cellulaires ont incorporé des taux plus élevés de radio-IdUrd que sans ce prétraitement. Une corrélation temporelle entre l'accumulation des cellules en phase S et la forte incorporation de radio-IdUrd a ainsi été révélée 16 à 24 h après pré-traitement à la FdUrd. Les expériences de traitement par rayonnements Auger sur les cellules accumulées en phase S ont montré une augmentation significative de l'efficacité thérapeutique de 125I-IdUrd comparé aux cellules non prétraitées à la FdUrd. Une première estimation a permis de déterminer que 100 désintégrations de 125I par cellules étant nécessaires afin d'atteindre l'efficacité thérapeutique. De plus, p53 semble jouer un rôle dans l'induction directe de mort cellulaire après des traitements par rayonnements Auger, comme indiqué par les mesures par FACS d'apoptose et de nécrose 24 et 48 h après le traitement. Concernant les expériences in vivo, nous avons observé une incorporation marquée de la radio-IdUrd dans l'ADN après un pré-traitement à la FdUrd dans un model de carcinomatose ovarienne péritonéale. Une augmentation encore plus importante a été observée après injection intra-tumorale dans des transplants sous-cutanés de glioblastomes sur des souris nues. Ces modèles pourraient être utilisés pour de plus amples études de diffusion de radio-IdUrd et de thérapie par rayonnement Auger. En conclusion, ce travail montre une première application réussie de la FdUrd afin d'accroître l'efficacité de la radio-IdUrd par traitements aux rayonnements Auger. La synchronisation des cellules en phase S combinée avec la forte incorporation de radio-IdUrd dans l'ADN différées après un pré-traitement à la FdUrd ont montré le gain thérapeutique attendu in vitro. De plus, des études in vivo sont tout indiquées après les observations encourageantes d'incorporation de radio-IdUrd dans les models de transplants sous-cutanés de glioblastomes et de tumeurs péritonéales ovariennes. Summary Iododeoxyuridine (IdUrd), labelled with 123I or 125I, could be a potential Auger radiation therapy agent. However, limitations restrict its DNA incorporation in proliferating cells. Therefore, fluorodeoxyuridine (FdUrd), which favours incorporation of thymidine analogues, has been studied by different groups in order to increase radio-IdUrd DNA incorporation, however therapeutic efficacy increase could not be reached. In our approach, 3 human glioblastoma cell lines with different p53 expression and one ovarian cancer line were pre-treated with various FdUrd conditions. We observed a high percentage of cells accumulating in early S phase 16 to 24 h after a short and non-toxic FdUrd pre-treatment. More than an accumulation, this was a synchronization, cells remaining able to incorporate radio-IdUrd and re-entering the cell cycle. Furthermore, the S phase accumulated cells post FdUrd pre-treatment were more radiosensitive. After the same delay of 16 to 24 h post FdUrd pre-treatment, the 4 cell lines were incorporating higher rates of radio-IdUrd compared with untreated cells. A time correlation between S phase accumulation and high radio-IdUrd incorporation was therefore revealed 16 to 24 h post FdUrd pre-treatment. Auger radiation treatment experiments performed on S phase enriched cells showed a significant increase of killing efficacy of 125I-IdUrd compared with cells not pre-treated with FdUrd. A first estimation indicates further that about 100 125I decays were required to reach killing in the targeted cells. Moreover, p53 might play a role on the direct induction of cell death pathways after Auger radiation treatments, as indicated by differential apoptosis and necrosis induction measured by FACS 24 and 48 h after treatment initiation. Concerning in vivo results, we observed a marked DNA incorporation increase of radio-IdUrd after FdUrd pre-treatment in peritoneal carcinomatosis in SCID mice. Even higher incorporation increase was observed after intra-tumoural injection of radio-IdUrd in subcutaneous glioblastoma transplants in nude mice. These tumour models might be further useful for diffusion of radio-IdUrd and Auger radiation therapy studies. In conclusion, these data show a first successful application of thymidine synthesis inhibition able to increase the efficacy of radio-IdUrd Auger radiation treatment. The S phase synchronization combined with a high percentage DNA incorporation of radio-IdUrd delayed post FdUrd pre-treatment provided the expected therapeutic gain in vitro. Further in vivo studies are indicated after the observations of encouraging radio-IdUrd uptake experiments in glioblastoma subcutaneous xenografts and in an ovarian peritoneal carcinomatosis model.