Characterisation of heteromers and oligomers in the TNF family of ligands and receptors

TNF family ligands and receptors fulfill a number of functions, mainly in the immune system. For example, the ligands BAFF and APRIL control growth and survival of mature Β cells at various stages of differentiation. TNF family ligands usually form homotrimers, but heteromers have also been described for lymphotoxin α1β2 and for BAFF and APRIL. Interestingly, twenty BAFF homotrimers can assemble into virus-like particles coined BAFF 60-mer, which are superior to BAFF 3-mer regarding their ability to signal in primary Β cells. A screen was performed in 293T cells, by co-transfecting differently tagged ligands, to identify six novel heteromers. The specificity of these novel heteromers, however, did not correspond to that of orphan receptors in the TNFR family. Little is known about heteromers of BAFF and APRIL, in particular their receptor-binding specificity and their ability to signal. A method to produce and purify heteromers of defined stoechiometry was developed, and the resulting reagents were used to demonstrate that BAFF2APRIL, like BAFF, binds to all BAFF receptors - namely BAFFR, TACI and Β CM A -, while APRIL2BAFF and APRIL only binds to TACI and BCMA. Heteromers could signal via their cognate receptors, sometimes as potently and sometimes less potently than homomers, depending on the receptors. A promising system to measure the activity of single-chain homo- and heteromers in vivo was set up: it measures mature Β cell rescue upon administration of single-chain ligands into BAFF-ko mice. To tackle the question of the physiological importance of BAFF 60-mer, a point mutation that prevents assembly of mouse BAFF into 60-mer while retaining its ability to form trimers was identified. This mutation (E247K) was introduced by homologous recombination into mouse embryonic stem cells that are now being used to generate knock-in mice. Results obtained in this work will help to better understand the role of various BAFF and APRIL forms that are elevated in a several autoimmune diseases. - Les ligands et récepteurs de la famille du TNF joue un rôle prédominant dans le système immunitaire. Par exemple, les ligands BAFF et APRIL contrôlent la croissance et la survie des cellules Β matures à différents stades de différenciation. Ces ligands existent souvent sous forme d'homotrimères (3-mer), bien que des héteromères aient été décrits pour la lymphotoxine α1β2 et pour BAFF et APRIL. Dans le cas de BAFF, vingt trimères peuvent, telle une particule virale, s'assembler en 60-mer qui surpasse le 3-mer pour signaler dans des cellules Β primaires. Un crible effectué dans des cellules 293T, par co-transfection de ligands différemment marqués, a permis d'identifier six nouveaux heteromères dont la spécificité n'a, hélas, pas correspondu à celle d'un récepteur orphelin de la famille du TNFR. Les connaissances sur la spécificité de liaison aux récepteurs et la capacité à signaler des heteromères de BAFF et d'APRIL sont fragmentaires. Une méthode pour produire et purifier des heteromères "simple chaîne" de stoechiométrie déterminée a été mise au point, et les réactifs ainsi obtenus utilisés pour démontrer que BAFF2APRIL, comme BAFF, lie tous les récepteurs de BAFF - c'est-à-dire BAFFR, TACI et BCMA -, alors qu'APRIL2BAFF et APRIL ne lient que TACI et BCMA. Les héteromères peuvent transmettre des signaux, parfois aussi bien et parfois plus faiblement que les homomères, selon les récepteurs. Un système prometteur pour mesurer l'activité des ligands simple chaîne in vivo a été mis au point. Il mesure la réapparition de cellules Β matures dans des souris déficientes pour BAFF après administration des ligands. Pour s'attaquer à la question de l'importance physiologique du 60-mer de BAFF, ime mutation empêchant l'assemblage en 60-mer sans affecter la capacité à former des trimères a été identifiée. Cette mutation (E247K) a été introduite par recombinaison homologue dans des cellules souches embryonnaires de souris qui sont utilisées pour obtenir des souris déficientes en BAFF 60-mer. Les résultats de ces travaux contribueront à mieux cerner le rôle des différentes formes de BAFF et d'APRIL produites en excès dans plusieurs maladies auto-immunes.

Dibenzofuran degradation by Sphingomonas wittichii RW1 under environmental stresses

Sphingomonas wittichii is a gram-negative Alpha-proteobacterium, capable of degrading xenobiotic compounds such as dibenzofuran (DBF), dibenzo-p-dioxin, carbazole, 2-hydroxybiphenyl or nitro diphenyl ether herbicides. The metabolism of strain RW1 has been the subject of previous studies and a number of genes involved in DBF degradation have been characterized. It is known that RW1 posseses a unique initial DBF dioxygenase (encoded by the dxnAl gene) that catalyzes the first step in the degradation pathway. None of the organisms known to be able to degrade DBF have a similar dioxygenase, the closest match being the DBF dioxygenase from Rhodococcus sp. with an overall amino acid similarity of 45%. Genes participating in the conversion of the metabolite salicylate via the ortho-cleavage pathway to TCA cycle intermediates were identified as well. Apart from this scarce information, however, there is a lack of global knowledge on the genes that are involved in DBF degradation by strain RW1 and the influence of environmental stresses on DBF-dependent global gene expression. A global analysis is necessary, because it may help to better understand the behaviour of the strain under field conditions and suggest improvements for the current bioaugmentation practice. Chapter 2 describes the results of whole-genome analysis to characterize the genes involved in DBF degradation by RW1. Micro-array analysis allowed us to detect differences in gene transcription when strain RW1 was exposed to DBF. This was complemented by ultra-high throughput sequencing of mutants no longer capable of growing on salicylate and DBF. Some of the genes of the ortho-cleavage pathway were induced 2 to 4 times in the presence of DBF, as well as the initial DBF dioxygenase. However two gene clusters, named 4925 and 5102 were induced up to 19 times in response to DBF induction. The cluster 4925 is putatively participating in a meta-cleavage pathway while the cluster 5102 might be part of a gentisate pathway. The three pathways, ortho-cleavage, meta-cleavage and gentisate pathway seem to be active in parallel when strain RW1 is exposed to DBF, presenting evidence for a redundancy of genes for DBF degradation in the genome of RW1. Chapter 3 focuses on exploiting genetic tools to construct bioreporters representative for DBF degradation in RW1. A set of basic tools for genetic manipulation in Sphingomonas wittichii RW1 was tested and optimized. Both plasmids and mini-transposons were evaluated for their ability to be maintained in RW1 with or without antibiotic selection pressure, and for their ability to lead to fluorescent protein expression in strain RW1 from a constitutive promoter. Putative promoter regions of three of the previously found DBF-induced genes (Swit_4925, Swit_5102 and Swit_4897-dxnAl) were then used to construct eg/^-bioreporters in RW1. Chapter 4 describes the use of the constructed RW1-based bioreporter strains for examining the expression of the DBF degradation pathway genes under microcosm conditions. The bioreporter strains were first exposed to different carbon sources in liquid culture to calibrate the egfp induction. Contrary to our expectations from micro-array analysis only the construct with the promoter from gene cluster 4925 responded to DBF, whereas the other two constructs did not show specific induction with DBF. The response from the bioreporters was subsequently tested for sensitivity to water stress, given that this could have an important impact in soils. Exposure to liquid cultures with decreasing water potential, achieved by NaCl or PEG addition to the growth media, showed that eGFP expression in RW1 from the promoter regions 4925 and 5102 was not directly influenced by water stress, but only through an overall reduction in growth rate. In contrast, expression of eGFP from the dxnAl or an uspA promoter was also directly dependent on the extent of water stress. The RW1 with the 4925 construct was subsequently used in soil microcosms to evaluate DBF bioavailability to the cells in presence or absence of native microbiota or other contaminated material. We found that RW1 could grow on DBF added to soil, but bioreporter expression suggested that competition with native microbiota for DBF intermediates may limit its ability to proliferate to a maximum. Chapter 5 describes the results from the experiments carried out to more specifically detect genes of RW1 that might be implicated in water stress resistance. Hereto we created transposon mutagenesis libraries in RW1, either with a classical mini-Tn5 or with a variant that would express egfp when the transposon would insert in a gene induced under water stress. Classical mutant libraries were screened by replica plating under high and low water stress conditions (achieved by adding NaCl to the agar medium). In addition, we screened for smaller microcolonies formed by mutants in agarose beads that could be analized with flow cytometry. A number of mutants impaired to grow on NaCl-supplemented media were recovered and the transposon insertion sites sequenced. In a second procedure we screened by flow cytometry for mutants with a higher eGFP production after exposure to growth medium with higher NaCl concentrations. Mutants from both libraries rarely overlapped. Discovered gene functions of the transposon insertions pointed to compatible solute synthesis (glutamate and proline), cell membrane synthesis and modification of cell membrane composition. The results obtained in the present study give us a more complete picture of the mechanisms of DBF degradation by S. wittichii RW1, how it reacts to different DBF availability and how the DBF catabolic activity may be affected by the conditions found in contaminated environments. - Sphingomonas wittichii est une alpha-protéobactérie gram-négative, capable de dégrader des composés xénobiotiques tels que le dibenzofurane (DBF), la dibenzo-p-dioxine, le carbazole, le 2-hydroxybiphényle ou les herbicides dérivés du nitro-diphényléther. Le métabolisme de la souche RW1 a fait l'objet d'études antérieures et un certain nombre de gènes impliqués dans la dégradation du DBF ont été caractérisés. Il est connu que RW1 possède une unique dioxygénase DBF initiale (codée par le gène dxnAl) qui catalyse la première étape de la voie de dégradation. Aucun des organismes connus pour être capables de dégrader le DBF n'a de dioxygénase similaire. L'enzyme la plus proche étant la DBF dioxygénase de Rhodococcus sp. avec 45% d'acides aminés conservés. Les gènes qui participent à la transformation du salicylate en métabolites intermédiaires du cycle de Krebs par la voie ort/io-cleavage ont aussi été identifiés. Outre ces informations lacunaires, il y a un manque de connaissances sur l'ensemble des gènes impliqués dans la dégradation du DBF par la souche RW1 ainsi que l'effet des stress environnementaux sur l'expression génétique globale, en présence du DBF. Une analyse globale est nécessaire, car elle peut aider à mieux comprendre le comportement de la souche dans les conditions de terrain et de proposer des améliorations pour l'utilisation de la bio-augmentation comme technique de bio-remédiation. Le chapitre 2 décrit les résultats de l'analyse du génome pour caractériser les gènes impliqués dans la dégradation du DBF par RW1. Une analyse de micro-arrays nous a permis de détecter des différences dans la transcription des gènes lorsque la souche RW1 a été exposée au DBF. L'analyse a été complétée par le criblage à ultra-haut débit de mutants qui n'étaient plus capables de croître avec le salicylate ou le DBF comme seule source de carbone. Certains des gènes de la voie ortho-cleavage, dont la DBF dioxygénase initiale, ont xî été induits 2 à 4 fois, en présence du DBF. Cependant, deux groupes de gènes, nommés 4925 et 5102 ont été induits jusqu'à 19 fois en réponse au DBF. Le cluster 4925 participe probablement dans une voie de meta-cleavage tandis que le cluster 5102 pourrait faire partie d'une voie du gentisate. Les trois voies, ortho-cleavage, meta-cleavage et la voie du gentisate semblent être activées en parallèle lorsque la souche RW1 est exposée au DBF, ce qui représente une redondance de voies pour la dégradation du DBF dans le génome de RW1. Le chapitre 3 se concentre sur l'exploitation des outils génétiques pour la construction de biorapporteurs de la dégradation du DBF par RW1. Un ensemble d'outils de base pour la manipulation génétique dans Sphingomonas wittichii RW1 a été testé et optimisé. Deux plasmides et mini-transposons ont été évalués pour leur capacité à être maintenu dans RW1 avec ou sans pression de sélection par des antibiotiques, et pour leur capacité à exprimer la protéine fluorescente verte (eGFP) dans la souche RW1. Les trois promoteurs des gènes Swit_4925, Swit_5102 et Swit_4897 (dxnAl), induits en réponse au DBF, ont ensuite été utilisés pour construire des biorapporteurs dans RW1. Le chapitre 4 décrit l'utilisation des souches biorapportrices construites pour l'analyse de l'expression des gènes de la voie de dégradation du DBF dans des microcosmes avec différents types de sols. Les souches biorapportrices ont d'abord été exposées à différentes sources de carbone en cultures liquides afin de calibrer l'induction de la eGFP. La construction avec le promoteur du gène 4925 a permis une réponse au DBF. Mais contrairement à nos attentes, basées sur les résultats de l'analyse des micro-arrays, les deux autres constructions n'ont pas montré d'induction spécifique au DBF. La réponse des biorapporteurs a ensuite été testée pour la sensibilité au stress hydrique, étant donné que cela pourrait avoir un impact important dans les microcosmes. La diminution du potentiel hydrique en culture liquide est obtenue par addition de NaCl ou de PEG au milieu de croissance. Nous avons montré que l'expression de la eGFP contrôlée par les promoteurs 4925 et 5102 n'était pas directement influencée par le stress hydrique, mais seulement par une réduction globale des taux de croissance. En revanche, l'expression de la eGFP dépendante des promoteurs dxnAl et uspA était aussi directement dépendante de l'ampleur du stress hydrique. La souche avec la construction 4925 a été utilisée par la suite dans des microcosmes avec différents types de sols pour évaluer la biodisponibilité du DBF en présence ou absence des microbes indigènes et d'autres composés contaminants. Nous avons constaté que RW1 pouvait se développer si le DBF a été ajouté au sol, mais l'expression de la eGFP par le biorapporteur suggère que la compétition avec la microbiota indigène pour les métabolites intermédiaires du DBF peut limiter sa capacité à proliférer de manière optimale. Le chapitre 5 décrit les résultats des expériences réalisées afin de détecter spécifiquement les gènes de RW1 qui pourraient être impliquées dans la résistance au stress hydrique. Ici on a crée des bibliothèques de mutants de RW1 par transposon, soit avec un mini-Tn5 classique ou avec une variante qui exprime la eGFP lorsque le transposon s'insère dans un gène induit par le stress hydrique. Les bibliothèques de mutants ont été criblées par la méthode classique de repiquage sur boîtes, dans des conditions de stress hydrique élevé (obtenu par l'addition de NaCl dans les boîtes). En outre, nous avons criblé des micro¬colonies dans des billes d'agarose qui ont pu être analysées par cytométrie de flux. Un certain nombre de mutants déficients à croître sur des milieux supplémentés avec du NaCl ont été isolés et les sites d'insertion du transposon séquencés. Dans une deuxième procédure nous avons criblé par cytométrie de flux des mutants avec une production de eGFP supérieure, après exposition à un milieu de croissance avec une concentration élevée de NaCl. Les mutants obtenus dans les deux bibliothèques n'étaient pas similaires. Les fonctions des gènes où se trouvent les insertions de transposons sont impliqués dans la synthèse de solutés compatibles (glutamate et de la proline), dans la synthèse de la membrane cellulaire et dans la modification de la composition de la membrane cellulaire. Les résultats obtenus dans la présente étude nous donnent une image plus complète des mécanismes de dégradation du DBF par S. wittichii RW1, comment cette souche réagit à la disponibilité du DBF et comment l'activité catabolique peut être affectée par les conditions rencontrées dans des environnements contaminés.

Catabolic ornithine carbamoyltransferase of Pseudomonas aeruginosa. Importance of the N-terminal region for dodecameric structure and homotropic carbamoylphosphate cooperativity.

Pseudomonas aeruginosa has an anabolic (ArgF) and a catabolic (ArcB) ornithine carbamoyltransferase (OTCase). Despite extensive sequence similarities, these enzymes function unidirectionally in vivo. In the dodecameric catabolic OTCase, homotropic cooperativity for carbamoylphosphate strongly depresses the anabolic reaction; the residue Glu1O5 and the C-terminus are known to be essential for this cooperativity. When Glu1O5 and nine C-terminal amino acids of the catabolic OTCase were introduced, by in vitro genetic manipulation, into the closely related, trimeric, anabolic (ArgF) OTCase of Escherichia coli, the enzyme displayed Michaelis-Menten kinetics and no cooperativity was observed. This indicates that additional amino acid residues are required to produce homotropic cooperativity and a dodecameric assembly. To localize these residues, we constructed several hybrid enzymes by fusing, in vivo or in vitro, the E. coli argF gene to the P. aeruginosa arcB gene. A hybrid enzyme consisting of 101 N-terminal ArgF amino acids fused to 233 C-terminal ArcB residues and the reciprocal ArcB-ArgF hybrid were both trimers with little or no cooperativity. Replacing the seven N-terminal residues of the ArcB enzyme by the corresponding six residues of E. coli ArgF enzyme produced a dodecameric enzyme which showed a reduced affinity for carbamoylphosphate and an increase in homotropic cooperativity. Thus, the N-terminal amino acids of catabolic OTCase are important for interaction with carbamoylphosphate, but do not alone determine dodecameric assembly. Hybrid enzymes consisting of either 26 or 42 N-terminal ArgF amino acids and the corresponding C-terminal ArcB residues were both trimeric, yet they retained some homotropic cooperativity. Within the N-terminal ArcB region, a replacement of motif 28-33 by the corresponding ArgF segment destabilized the dodecameric structure and the enzyme existed in trimeric and dodecameric states, indicating that this region is important for dodecameric assembly. These findings were interpreted in the light of the three-dimensional structure of catabolic OTCase, which allows predictions about trimer-trimer interactions. Dodecameric assembly appears to require at least three regions: the N- and C-termini (which are close to each other in a monomer), residues 28-33 and residues 147-154. Dodecameric structure correlates with high carbamoylphosphate cooperativity and thermal stability, but some trimeric hybrid enzymes retain cooperativity, and the dodecameric Glu1O5-->Ala mutant gives hyperbolic carbamoylphosphate saturation, indicating that dodecameric structure is neither necessary nor sufficient to ensure cooperativity.

Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex.

The membrane-bound form of Fas ligand (FasL) signals apoptosis in target cells through engagement of the death receptor Fas, whereas the proteolytically processed, soluble form of FasL does not induce cell death. However, soluble FasL can be rendered active upon cross-linking. Since the minimal extent of oligomerization of FasL that exerts cytotoxicity is unknown, we engineered hexameric proteins containing two trimers of FasL within the same molecule. This was achieved by fusing FasL to the Fc portion of immunoglobulin G1 or to the collagen domain of ACRP30/adiponectin. Trimeric FasL and hexameric FasL both bound to Fas, but only the hexameric forms were highly cytotoxic and competent to signal apoptosis via formation of a death-inducing signaling complex. Three sequential early events in Fas-mediated apoptosis could be dissected, namely, receptor binding, receptor activation, and recruitment of intracellular signaling molecules, each of which occurred independently of the subsequent one. These results demonstrate that the limited oligomerization of FasL, and most likely of some other tumor necrosis factor family ligands such as CD40L, is required for triggering of the signaling pathways.

Direct visualization of the trimeric structure of the ASIC1a channel, using AFM imaging.

There has been confusion about the subunit stoichiometry of the degenerin family of ion channels. Recently, a crystal structure of acid-sensing ion channel (ASIC) 1a revealed that it assembles as a trimer. Here, we used atomic force microscopy (AFM) to image unprocessed ASIC1a bound to mica. We detected a mixture of subunit monomers, dimers and trimers. In some cases, triple-subunit clusters were clearly visible, confirming the trimeric structure of the channel, and indicating that the trimer sometimes disaggregated after adhesion to the mica surface. This AFM-based technique will now enable us to determine the subunit arrangement within heteromeric ASICs.

Anti-tumour effect of monoclonal antibodies against selected antigens expressed by B-cells in Chronic Lymphocytic Leukaemia : strategies to enhance the efficacy of immunotherapy

Résumé : Les anticorps monoclonaux ont une place de plus en plus prépondérante dans le traitement des lymphomes et leucémies. Dans cette étude, trois anticorps monoclonaux murins, dirigés contre les antigènes CDS, CD71 et HLA-DR exprimés à la surface des cellules de leucémies lymphoïdes chroniques (LLC), ont été évalués. In vitro, les anticorps radiomarqués ont montrés des bonnes liaisons spécifiques sur les différentes cellules cibles. L'anti-CD71 inhibait la prolifération de la plupart des lignées cellulaires testées avec une accumulation des cellules en phase S précoce du cycle cellulaire. L'anti-HLA-DR inhibait aussi la prolifération des lignées leucémique JOK1-5.3 et lymphoïde Daudi. Cette inhibition était associée à une agrégation des cellules. Aucune induction d'apoptose n'a pu être clairement observée avec ces anticorps. L'anti-CD5 n'a montré aucun effet d'inhibition de croissance in vitro. In vivo, l'injection des anticorps individuellement augmentait significativement la survie médiane de souris SCID greffées avec des cellules JOK1-5.3 en i.p. De plus, l'anticorps antiCD5 combiné à l'anti-HLA-DR ou l'anti-CD71, sous certaines conditions, inhibait complètement le développement tumoral dans la quasi totalité des souris traitées avec une augmentation significative de l'efficacité comparée aux anticorps seuls. L'augmentation de l'efficacité thérapeutique des anticorps monoclonaux par les cytokines, dont l'IL-2, a déjà été montrée dans la littérature. Au regard du meilleur comportement de l'IL-2 sous la forme complexée à un anticorps anti-IL-2, nous avons évalué l'efficacité de l'IL-2/anti-IL-2 seul ou combinés au rituximab chez différents modèles tumoraux s.c. (BL60.2, Daudi, Ramos) ou i.p. (JOK15.3) de souris SCID. Le complexe IL-2/anti-IL-2 a montré un effet anti-tumoral dans les souris greffées avec BL60.2 et Daudi. Le traitement IL-2/anti-IL-2 combiné au rituximab a montré une efficacité accrue chez des souris avec BL60.2 par rapport au rituximab seul. En revanche, nous n'avons pas observé de différence avec IL-2/anti-IL-2 seul.Aussi, nous avons évalué l'utilisation de l'agent couplant tri-fonctionnel TMEA pour produire des anticorps bispecifiques. Les expériences préliminaires avec les anticorps rituximab et herceptine, ont mis en évidence sur gel SDS-Page la formation de dimers (~100kDa) et de trimers (~150kDa). Les anticorps bispecifiques sont composés d'un fragment Fab' d'une spécificité et de un ou deux fragments Fab' de l'autre spécificité permettant de moduler la capacité de liaison. Nous avons enfin montré qu'une construction anti-CD5/anti-CD20 était capable de se lier indépendamment ou simultanément à ses antigènes cibles. En conclusion, ce travail a montré l'efficacité thérapeutique des trois anticorps monoclonaux étudiés dans un model de LLC in vivo, et plus particulièrement l'intérêt de certaines combinaisons. D'autre part, nous avons montré l'efficacité anti-tumorale du complexe IL-2/anti-IL-2 in vivo. Des études futures devront permettre de définir un régime favorable pour augmenter l'efficacité de la thérapie avec les anticorps monoclonaux. Enfin, nous avons montré la faisabilité d'utiliser l'agent couplant TMEA pour produire des anticorps bispécifiques fonctionnels.Abstract : Monoclonal antibody (mAb) therapy has become an integral part in different treatments of lymphomas and leukaemias. In this study, we describe three murine mAbs directed against the CD5, CD71 and HLA-DR antigens expressed on chronic lymphocytic leukaemia cells (CLL). In vitro, radiolabeled purified mAbs showed good specific binding on live target cells. Anti-CD71 mAb inhibited proliferation of most cell lines with an accumulation of responding cells in early S-phase of the cell cycle, but without induction of apoptosis. Anti-HLA-DR mAb showed proliferation inhibition of leukaemia JOK1-5.3 and lymphoid Daudi cells, associated with cell aggregation, but again no specific sign of apoptosis was observed. Anti-CD5 mAb did not show any growth inhibitory effect in vitro. In vivo, in a model of SCID mice grafted i.p. with JOK1-5.3 cells, injection of individual mAbs induced significant prolongation of median survival, up to complete inhibition of tumour growth in some mice. Antibody combination of anti-CD5 with anti-HLA-DR or anti-CD71, evaluated in an early treatment, completely inhibited tumour growth in most mice, with a significant efficacy enhancement as compared to mAb used as single agents. Previous reports described the improved efficacy of mAb therapy when combined with cytokines such as IL-2. Relying further on the improved efficacy of IL-2 when administered as an immune complex with anti-IL-2 mAb, we evaluated the anti-tumour effect of the IL-2/anti-IL-2 complex alone or combined with rituximab in subcutaneous (BL60.2, Daudi, Ramos) or i.p. (JOK1-5.3) tumour models in SCID mice. The IL-2/anti-IL-2 complex demonstrated an anti-tumour effect in BL60.2 and Daudi grafted SCID mice. Combination of IL-2/anti-IL-2 treatment with rituximab showed increased efficacy as compared to rituximab alone in BL60.2 grafted mice. However, no difference was observed with IL-2/anti-IL-2 complex alone in these experiments. Finally, we evaluated the feasibility of producing bispecific antibodies (bsAbs) using a trifunctional coupling agent, called TMEA. In preliminary experiments coupling rituximab with herceptine Fab' fragments we obtained the formation of dimers (~100kDa) and trimers (~150kDa) as observed on SDS-Page gel. This method allowed us to produce bsAb with one Fab' fragments of one specificity and one or two Fab' fragments of the second specificity. An anti-CD5/anti-CD20 bsAb was shown to bind targeted antigen either independently or simultaneously. In conclusion, these data show that the three mAbs were all able to induce significant growth inhibition of the JOK1-5.3 cell line in vivo, and efficacy was enhanced when used in combination. IL2/anti-IL-2 complex displayed anti-tumour efficacy in vivo. Further evaluation is necessary to define the most favourable combination to improve mAb therapy. BsAb were produced using the tri-functional agent allowing antibody fragments with relatively good binding. The poor yield obtained with such chemical couplings limited the use of these constructs in preclinical experiments.

The role of proteolytic processing and the stable signal peptide in expression of the Old World arenavirus envelope glycoprotein ectodomain.

Maturation of the arenavirus GP precursor (GPC) involves proteolytic processing by cellular signal peptidase and the proprotein convertase subtilisin kexin isozyme 1 (SKI-1)/site 1 protease (S1P), yielding a tripartite complex comprised of a stable signal peptide (SSP), the receptor-binding GP1, and the fusion-active transmembrane GP2. Here we investigated the roles of SKI-1/S1P processing and SSP in the biosynthesis of the recombinant GP ectodomains of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and Lassa virus (LASV). When expressed in mammalian cells, the LCMV and LASV GP ectodomains underwent processing by SKI-1/S1P, followed by dissociation of GP1 from GP2. The GP2 ectodomain spontaneously formed trimers as revealed by chemical cross-linking. The endogenous SSP, known to be crucial for maturation and transport of full-length arenavirus GPC was dispensable for processing and secretion of the soluble GP ectodomain, suggesting a specific role of SSP in the stable prefusion conformation and transport of full-length GPC.

Architectural and Functional Similarities between Trimeric ATP-Gated P2X Receptors and Acid-Sensing Ion Channels

ATP-gated P2X receptors and acid-sensing ion channels are two distinct ligand-gated ion channels that assemble into trimers. They are involved in many important physiological functions such as pain sensation and are recognized as important therapeutic targets. They have unrelated primary structures and respond to different ligands (ATP and protons) and are thus considered as two different ion channels. As a consequence, comparisons of the biophysical properties and underlying mechanisms have only been rarely made between these two channels. However, the recent determination of their molecular structures by X-ray crystallography has revealed unexpected parallels in the architecture of the two pores, providing a basis for possible functional analogies. In this review, we analyze the structural and functional similarities that are shared by these trimeric ion channels, and we outline key unanswered questions that, if addressed experimentally, may help us to elucidate how two unrelated ion channels have adopted a similar fold of the pore.

Mutation of the BAFF furin cleavage site impairs B-cell homeostasis and antibody responses.

B-cell-activating factor of the TNF family (BAFF)/BLyS contributes to B-cell homeostasis and function in the periphery. BAFF is expressed as a membrane-bound protein or released by proteolytic cleavage, but the functional importance of this processing event is poorly understood. Mice expressing BAFF with a mutated furin consensus cleavage site, i.e. furin-mutant BAFF (fmBAFF), were not different from BAFF-deficient mice with regard to their B-cell populations and responses to immunization. It is however noteworthy that an alternative processing event releases some soluble BAFF in fmBAFF mice. Mild overexpression (∼ 5-fold) of fmBAFF alone generated intermediate levels of B cells without improving humoral responses to immunization. Processed BAFF was however important for B-cell homeostasis, as peripheral B-cell populations and antibody responses were readily restored by administration of soluble BAFF trimers in BAFF-deficient mice. However, the rescue of CD23 expression in B cells of BAFF-deficient mice required both soluble BAFF trimers and fmBAFF, or a polymeric form of soluble BAFF (BAFF 60-mer). These results point to a predominant role of processed BAFF for B-cell homeostasis and function, and indicate possible accessory roles for membrane-bound BAFF.

Formation of virus-like clusters is an intrinsic property of the tumor necrosis factor family member BAFF (B cell activating factor).

The oligomeric state of BAFF (B cell activing factor), a tumor necrosis factor (TNF) family cytokine that plays a critical role in B cell development and survival, has been the subject of recent debate. Myc-tagged BAFF starting at residue Gln136 was previously reported to crystallize as trimers at pH 4.5, whereas a histidine-tagged construct of BAFF, starting at residue Ala134, formed a virus-like cluster containing 60 monomers when crystallized at pH 9.0. The formation of the BAFF 60-mer was pH dependent, requiring pH >or= 7.0. More recently, 60-mer formation was suggested to be artificially induced by the histidine tag, and it was proposed that BAFF, like all other TNF family members, is trimeric. We report here that a construct of BAFF with no amino-terminal tag (Ala134-BAFF) can form a 60-mer in solution. Using size exclusion chromatography and static light scattering to monitor trimer to 60-mer ratios in BAFF preparations, we find that 60-mer formation is pH-dependent and requires histidine 218 within the DE loop of BAFF. Biacore measurements established that the affinity of Ala134-BAFF for the BAFF receptor BAFFR/BR3 is similar to that of myc-Gln136-BAFF, which is exclusively trimeric in solution. However, Ala134-BAFF is more efficacious than myc-Gln136-BAFF in inducing B cell proliferation in vitro. We additionally show that BAFF that is processed and secreted by 293T cells transfected with full-length BAFF, or by a histiocytic lymphoma cell line (U937) that expresses BAFF endogenously, forms a pH-dependent 60-mer in solution. Our results indicate that the formation of the 60-mer in solution by the BAFF extracellular domain is an intrinsic property of the protein, and therefore that this more active form of BAFF may be physiologically relevant.