The role of Notch receptors in T helper differentiation

After encountering antigens, naïve CD4+ Τ cells can differentiate into various effector Τ helper (Th) cell subsets, including CD4+ Thi, Th2, Thi7, regulatory Τ cells and the recently described follicular Τ helper cells (TFH cells). To date, most of the studies used either gain-of-function approaches that do not reflect the physiological Notch signaling intensity or loss-of-function models that block the entire Notch pathway. The contribution of single Notch receptors during Th differentiation occurring upon infection has not been investigated yet. In the present thesis, we wanted to assess the individual role of Notchi and Notch2 in Th differentiation, by using mice with Τ cell-specific deletion of Notchi, Notch2 or both (NiN2/iCD4Cre) in different models of infection/immunization.¦In the first part, we characterized the role of Notchi and Notch2 in Thi differentiation. We used experimental infection with the protozoan parasite Leishmania major, known to induce a protective Thi immune response in mice on the C57BL/6 background. Mice deficient for both Notchi and Notch2 developed unhealing lesions and were unable to control the parasite burden in their footpad. A profound defect in IFNy secretion by CD4+ Τ cells was shown to be responsible for the susceptibility of these mice. Although CD4+ Τ cells did not secrete IFNy following L. major infection, they exhibited higher IFNymRNA expression as well as higher frequency of CD4+IFNy+Τ cells in dLN. Altogether, these data indicate that Notch is dispensable for the differentiation of Thi cells expressing IFNy but controls, directly or not, the secretion of IFNy, allowing the development of a fully functional Thi immune response.¦In the second part of this thesis, we determined whether Notch is involved in differentiation of follicular Τ helper (TFH) cells. Using different models of immunization (NP-CGG, Schistosoma mansoni eggs) or infection (Leishmania mexicana), we showed that NiN2ACD4Cre mice were unable to generate TFH cells, displayed impaired germinal center (GC) formation as well as a profound defect in high affinity specific-antibodies secretion. We demonstrated an essential and previously unknown role of Notch in TFH cell development, the consequent GC formation and high affinity antibodies secretion, although the mechanisms by which Notch affects TFH development remain to be clearly demonstrated.¦-¦Lors d'une réponse immune, les lymphocytes Τ CD4+ se différencient en différentes sous- populations de lymphocytes Τ auxiliaires (T helper ou Th en anglais) incluant les populations de cellules Thi, Th2, Thn.7, Τ régulatrices ou Τ folliculaires. De nombreuses études ont montré un rôle de la voie de signalisation Notch dans la différentiation des lymphocytes Τ auxiliaires, bien que les résultats soient controversés. A ce jour, la majorité de ces études sont basées sur des modèles de gain de fonction qui ne reflètent pas le niveau physiologique du signal ou des modèles de perte de fonction pour lesquels toute la voie de signalisation est bloquée. De ce fait, nous avons voulu établir le rôle individuel de Notchi et Notch2 dans la réponse immune de type Thi et dans la différentiation des lymphocytes Τ auxiliaires folliculaires avec l'aide de souris déficientes pour Notchi, Notch2 ou les 2 (NiN2ACD4Cre) à la surface de leurs cellules T.¦Dans la première partie de cette thèse, nous avons analysé le rôle de Notch dans la différentiation de type Thi suite à infection avec le parasite Leishmania major, connu pour induire une forte réponse Thi dans des souris de souche C57BL/6. Les souris déficientes pour Notchi et Notch2 développent une importante lésion et sont incapables de contrôler la prolifération du parasite au site d'infection. Le profond défaut de la sécrétion d'IFNy par les cellules Τ des ganglions drainants est probablement responsable de la susceptibilité de ces souris à L. major. Bien que les cellules Τ ne sécrètent pas d'IFNy, nous avons observé des niveaux plus importants d'expression au niveau de l'ARN messager, et une proportion plus élevée de cellules positives pour CD4 et IFNy. Ces résultats indiquent que Notch est nécessaire pour la sécrétion d'IFNy mais pas pour la différentiation de cellules compétentes pour l'IFNy.¦Dans un second temps, nous avons voulu déterminer si Notch est impliqué dans la différentiation des cellules Τ folliculaires. En utilisant divers modèles d'immunisation (avec NP-CGG ou des oeufs de Schistosoma mansoni) ou d'infection (avec L. mexicana), nous avons montré que les souris NlN2ACD4Cre sont incapables de générer des cellules Τ folliculaires. En conséquence, la formation des centres germinatifs et la sécrétion d'anticorps de haute affinité sont profondément affectés. Nous avons démontré dans cette seconde partie un rôle crucial et inconnu à ce jour de Notch dans la différentiation des cellules Τ et en conséquence dans la formation des centres germinatifs et la sécrétion des anticorps de haute affinité, bien que les mécanismes par lesquels Notch contrôle cette différentiation restent à identifier.¦-¦Lors d'une réponse immune, les lymphocytes Τ CD// se différencient en différentes sous- populations de lymphocytes Τ auxiliaires de types Thi, Th2, Thi7, régulatrices ou folliculaires, définies selon la sécrétion de cytokines spécifiques. Le rôle de ces sous-populations dans le contrôle de diverses infections ou leur association avec de nombreuses maladies rend la compréhension des mécanismes de différentiation de ces cellules particulièrement importante. De nombreux facteurs sont impliqués dans ce processus, tels que la présence de diverses cytokines dans l'environnement, la nature de l'antigène ou encore la force de la stimulation. Par ailleurs, de nombreuses études ont montré un rôle de la voie de signalisation Notch dans la différentiation des lymphocytes T, bien que les résultats soient controversés. Dans cette thèse, nous avons voulu évaluer le rôle individuel des récepteurs Notch dans la différentiation des cellules Τ auxiliaires de type Thi et folliculaires à l'aide de souris dont les récepteurs Notch sont spécifiquement absents à la surface des lymphocytes T.¦Dans la première partie, nous avons utilisé le modèle d'infection au parasite Leishmania major, connu pour induire une forte réponse protectrice de type Thi dans la majorité des souches de souris. Suite à l'infection, les souris déficientes pour les récepteurs Notch sont incapables de contrôler la prolifération du parasite et développent une importante lésion au site d'infection. Cette susceptibilité est due à l'incapacité des cellules Τ auxiliaires à sécréter une cytokine spécifique des cellules de type Thi et nécessaire à l'éradication du parasite, l'IFNy. Ces résultats indiquent que les récepteurs Notch sont indispensables au développement d'une réponse Thi fonctionnelle, permettant la guérison suite à l'infection avec L. major.¦Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons voulu déterminer si Notch est impliqué dans la différentiation des lymphocytes Τ folliculaires. Ces cellules ont la particularité d'aider les lymphocytes Β à former des centres germinatifs au sein desquels les lymphocytes Β prolifèrent et sécrètent des anticorps, un processus nécessaire à la protection contre les pathogènes. Actuellement, l'efficacité de la majorité des vaccins repose sur la sécrétion d'anticorps par les lymphocytes B, aidés par les cellules Τ folliculaires. En raison du rôle important de ces cellules dans l'éradication des pathogènes et lors d'un processus de vaccination, il est important de connaître les facteurs et les mécanismes permettant la différentiation de ces cellules. Dans cette étude, nous montrons que la formation des cellules Τ folliculaires dépend de la voie de signalisation Notch, impliquant un rôle essentiel de cette molécule dans l'induction de la sécrétion d'anticorps par les lymphocytes B.

CD28-negative cytolytic effector T cells frequently express NK receptors and are present at variable proportions in circulating lymphocytes from healthy donors and melanoma patients.

In humans, NK receptors are expressed by natural killer cells and some T cells, the latter of which are preferentially alphabetaTCR+ CD8+ cytolytic T lymphocytes (CTL). In this study we analyzed the expression of nine NK receptors (p58.1, p58.2, p70, p140, ILT2, NKRP1A, ZIN176, CD94 and CD94/NKG2A) in PBL from both healthy donors and melanoma patients. The percentages of NK receptor-positive T cells (NKT cells) varied strongly, and this variation was more important between individual patients than between individual healthy donors. In all the individuals, the NKT cells were preferentially CD28-, and a significant correlation was found between the percentage of CD28- T cells and the percentage of NK receptor+ T cells. Based on these data and the known activated phenotype of CD28- T cells, we propose that the CD28- CD8+ T cell pool represents or contains the currently active CTL population, and that the frequent expression of NK receptors reflects regulatory mechanisms modulating the extent of CTL effector function. Preliminary results indicate that some tumor antigen-specific T cells may indeed be CD28- and express NK receptors in vivo.

Prostaglandin E(2) promotes colorectal adenoma growth via transactivation of the nuclear peroxisome proliferator-activated receptor delta.

Cyclooxygenase-derived prostaglandin E(2) (PGE(2)) is the predominant prostanoid found in most colorectal cancers (CRC) and is known to promote colon carcinoma growth and invasion. However, the key downstream signaling pathways necessary for PGE(2)-induced intestinal carcinogenesis are unclear. Here we report that PGE(2) indirectly transactivates PPARdelta through PI3K/Akt signaling, which promotes cell survival and intestinal adenoma formation. We also found that PGE(2) treatment of Apc(min) mice dramatically increased intestinal adenoma burden, which was negated in Apc(min) mice lacking PPARdelta. We demonstrate that PPARdelta is a focal point of crosstalk between the prostaglandin and Wnt signaling pathways which results in a shift from cell death to cell survival, leading to increased tumor growth.

In pancreatic carcinoma, dual EGFR/HER2 targeting with cetuximab/trastuzumab is more effective than treatment with trastuzumab/erlotinib or lapatinib alone: implication of receptors' down-regulation and dimers' disruption.

We previously demonstrated the synergistic therapeutic effect of the cetuximab (anti-epidermal growth factor receptor [EGFR] monoclonal antibody, mAb)-trastuzumab (anti-HER2 mAb) combination (2mAbs therapy) in HER2(low) human pancreatic carcinoma xenografts. Here, we compared the 2mAbs therapy, the erlotinib (EGFR tyrosine kinase inhibitor [TKI])-trastuzumab combination and lapatinib alone (dual HER2/EGFR TKI) and explored their possible mechanisms of action. The effects on tumor growth and animal survival of the three therapies were assessed in nude mice xenografted with the human pancreatic carcinoma cell lines Capan-1 and BxPC-3. After therapy, EGFR and HER2 expression and AKT phosphorylation in tumor cells were analyzed by Western blot analysis. EGFR/HER2 heterodimerization was quantified in BxPC-3 cells by time-resolved FRET. In K-ras-mutated Capan-1 xenografts, the 2mAbs therapy gave significantly higher inhibition of tumor growth than the erlotinib/trastuzumab combination, whereas in BxPC-3 (wild-type K-ras) xenografts, the erlotinib/trastuzumab combination showed similar growth inhibition but fewer tumor-free mice. Lapatinib showed no antitumor effect in both types of xenografts. The efficacy of the 2mAbs therapy was partly Fc-independent because F(ab')(2) fragments of the two mAbs significantly inhibited BxPC-3 growth, although with a time-limited therapeutic effect. The 2mAbs therapy was associated with a reduction of EGFR and HER2 expression and AKT phosphorylation. BxPC-3 cells preincubated with the two mAbs showed 50% less EGFR/HER2 heterodimers than controls. In pancreatic carcinoma xenografts, the 2mAbs therapy is more effective than treatments involving dual EGFR/HER2 TKIs. The mechanism of action may involve decreased AKT phosphorylation and/or disruption of EGFR/HER2 heterodimerization.

Gene transfer of a soluble IL-1 type 2 receptor-Ig fusion protein improves cardiac allograft survival in rats.

OBJECTIVE: Interleukin-1 (IL-1) mediates ischemia-reperfusion injury and graft inflammation after heart transplantation. IL-1 affects target cells through two distinct types of transmembrane receptors, type-1 receptor (IL-1R1), which transduces the signal, and the non-signaling type-2 receptor (IL-1R2), which acts as a ligand sink that subtracts IL-1beta from IL-1R1. We analyzed the efficacy of adenovirus (Ad)-mediated gene transfer of a soluble IL-1R2-Ig fusion protein in delaying cardiac allograft rejection and the mechanisms underlying the protective effect. METHODS: IL-1 inhibition by IL-1R2-Ig was tested using an in vitro functional assay whereby endothelial cells preincubated with AdIL-1R2-Ig or control virus were stimulated with recombinant IL-1beta or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), and urokinase-type plasminogen activator (u-PA) induction was measured by zymography. AdIL-1R2-Ig was delivered to F344 rat donor hearts ex vivo, which were placed in the abdominal position in LEW hosts. Intragraft inflammatory cell infiltrates and proinflammatory cytokine expression were analyzed by immunohistochemistry and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively. RESULTS: IL-1R2-Ig specifically inhibited IL-1beta-induced u-PA responses in vitro. IL-1R2-Ig gene transfer reduced intragraft monocytes/macrophages and CD4(+) cell infiltrates (p<0.05), TNF-alpha and transforming growth factor-beta (TGF-beta) expression (p<0.05), and prolonged graft survival (15.6+/-5.7 vs 10.3+/-2.5 days with control vector and 10.1+/-2.1 days with buffer alone; p<0.01). AdIL-1R2-Ig combined with a subtherapeutic regimen of cyclosporin A (CsA) was superior to CsA alone (19.4+/-3.0 vs 15.9+/-1.8 days; p<0.05). CONCLUSIONS: Soluble IL-1 type-2 receptor gene transfer attenuates cardiac allograft rejection in a rat model. IL-1 inhibition may be useful as an adjuvant therapy in heart transplantation.

The adaptor complex 2 directly interacts with the alpha 1b-adrenergic receptor and plays a role in receptor endocytosis.

Using the yeast two-hybrid system, we identified the mu 2 subunit of the clathrin adaptor complex 2 as a protein interacting with the C-tail of the alpha 1b-adrenergic receptor (AR). Direct association between the alpha 1b-AR and mu 2 was demonstrated using a solid phase overlay assay. The alpha 1b-AR/mu 2 interaction occurred inside the cells, as shown by the finding that the transfected alpha 1b-AR and the endogenous mu 2 could be coimmunoprecipitated from HEK-293 cell extracts. Mutational analysis of the alpha 1b-AR revealed that the binding site for mu 2 does not involve canonical YXX Phi or dileucine motifs but a stretch of eight arginines on the receptor C-tail. The binding domain of mu 2 for the receptor C-tail involves both its N terminus and the subdomain B of its C-terminal portion. The alpha 1b-AR specifically interacted with mu 2, but not with the mu 1, mu 3, or mu 4 subunits belonging to other AP complexes. The deletion of the mu 2 binding site in the C-tail markedly decreased agonist-induced receptor internalization as demonstrated by confocal microscopy as well as by the results of a surface receptor biotinylation assay. The direct association of the adaptor complex 2 with a G protein-coupled receptor has not been reported so far and might represent a common mechanism underlying clathrin-mediated receptor endocytosis.

In vivo nuclear translocation of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors in rat kidney: differential effect of corticosteroids along the distal tubule.

Aldosterone and corticosterone bind to mineralocorticoid (MR) and glucocorticoid receptors (GR), which, upon ligand binding, are thought to translocate to the cell nucleus to act as transcription factors. Mineralocorticoid selectivity is achieved by the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11β-HSD2) that inactivates 11β-hydroxy glucocorticoids. High expression levels of 11β-HSD2 characterize the aldosterone-sensitive distal nephron (ASDN), which comprises the segment-specific cells of late distal convoluted tubule (DCT2), connecting tubule (CNT), and collecting duct (CD). We used MR- and GR-specific antibodies to study localization and regulation of MR and GR in kidneys of rats with altered plasma aldosterone and corticosterone levels. In control rats, MR and GR were found in cell nuclei of thick ascending limb (TAL), DCT, CNT, CD cells, and intercalated cells (IC). GR was also abundant in cell nuclei and the subapical compartment of proximal tubule (PT) cells. Dietary NaCl loading, which lowers plasma aldosterone, caused a selective removal of GR from cell nuclei of 11β-HSD2-positive ASDN. The nuclear localization of MR was unaffected. Adrenalectomy (ADX) resulted in removal of MR and GR from the cell nuclei of all epithelial cells. Aldosterone replacement rapidly relocated the receptors in the cell nuclei. In ASDN cells, low-dose corticosterone replacement caused nuclear localization of MR, but not of GR. The GR was redistributed to the nucleus only in PT, TAL, early DCT, and IC that express no or very little 11β-HSD2. In ASDN cells, nuclear GR localization was only achieved when corticosterone was replaced at high doses. Thus ligand-induced nuclear translocation of MR and GR are part of MR and GR regulation in the kidney and show remarkable segment- and cell type-specific characteristics. Differential regulation of MR and GR may alter the level of heterodimerization of the receptors and hence may contribute to the complexity of corticosteroid effects on ASDN function.

Characterization of Tollip in the Interleulkin-1 Receptor/Toll Like Receptors signaling pathways

SUMMARY IL-1R and TLRs are key players in innate immunity and inflammation. Tollip was identified as a component of IL-1RI, TLR2 and TLR4 signaling complexes that activate NF-κB and MAP kinase pathways. Tollip was previously shown as a negative regulator of NF-κB and MAP Kinase activation. We have characterized the role of Tollip in IL-R/TLRs induced signaling by the analysis of the Tollip deficient mice. We showed that NF-κB and MAPK (p38, JNK, or ERK1/2) signaling appeared normal in Tollip deficient cells following stimulation with IL-1β, lipopolysaccharide (LPS), and other TLR ligands. Also IL-1β and TLRs ligands induced activation of immune cells was indistinguishable from wild-type cells. Strikingly, in Tollip deficient mice the production of the inflammatory cytokines, IL-6 or TNF-α was significantly reduced relative to control mice after treatment with physiological doses of IL-1β or LPS, whereas no difference was observed at high doses of stimulation with LPS or in LPS induced septic shock. Therefore, Tollip could be critical for regulation of optimal responses to IL-1β and LPS, in addition to its role as negative regulator of the signaling. We also studied the role of Tollip as an endocytic adaptor for IL-1R endocytosis. We could show that Il-1R is ubiquitinated after IL-1β stimulation, and that Tollip's CUE domain binds IL-1RI in an ubiquitin-dependent manner. We followed IL-1R internalization and Tollip localization by confocal microscopy. Consistent with a role for Tollip in sorting of ubiquitinated IL-1RI, a significant amount of Tollip was also localized at the late endosomal compartment. We could show that Tollip is required for efficient lysosomal targeting of ubiquitinated IL-1R1, In the absence of Tollip or in Tollip deficient cells reconstituted with a Tollip mutant (defective in ubiquitin binding) IL-1RI accumulates in enlarged late endosomes. In addition, Tollip was shown to interact with, another endocytic adapter, Toml, and both interact with IL-1RI. In conclusion, we showed that Tollip is required for IL-1β and LPS signaling for cytokine production. In addition we showed and that Tollip has a role as an endocytic adapter, necessary for efficient trafficking and lysosomal degradation of IL-1RI. Resumé Le récepteur à l'interleukine-1 (IL-1R) et les récepteurs "Toll-like" (TLRs) sont des acteurs cruciaux de la réponse immunitaire innée et de l'inflammation. La proteine Tollip a été identifiée comme étant un élément des complexes de signalisation, induits par les récepteurs IL-1RI, TLR-2 et TLR-4, qui mènent à l'activation de la voie des MAP kinases et de NF-κB. Dans de précédentes études, il a été montré que Tollip pouvait inhiber ces deux voies de signalisation. Nous avons voulu caractériser plus précisément le rôle de Tollip dans l'activation des voies de signalisation mitées par IL-1R/TLRs en utilisant une lignée murine déficiente pour la protéine Tollip. Ainsi, en absence de Tollip, les cascades d'activation de NF-κB et MAPK (p38, JNK, or ERK1/2) ne semblent pas affectées après stimulation avec IL-1β, lipopolysaccharide (LPS) ou d' autres ligands des TLR. La réponse des cellules du système immunitaire induite par la stimulation avec IL-1β et les ligands des TLR est également comparable entre les souris sauvages et les souris deficientes pour Tollip. Par contre, dans cette lignée murine, la production de cytokines proinflammatoires IL-6 et TNFα induite par la stimulation à dose physiologique de IL-1β or LPS, est réduite. Cependant, lors de stimulation à plus hautes doses de LPS ou pendant un choc septique induit par de LPS, cette réduction n'est pas observée. Ces résultats montrent que Tollip pourrait avoir un rôle déterminant dans l'activation optimale en réponse à l' IL-1β et au LPS qui s'ajoute à sa fonction inhibitrice des mêmes voies de signalisation. Nous avons aussi étudié le rôle de Tollip comme molécule adaptatatrice du mécanisme endocytique d'internalisation de l' IL-1RI. Ainsi, l' IL-1R est ubiquitiné après stimulation par l' IL-1β , permettant à Tollip de se lier au récepteur. Cette interaction est réalisée entre le domaine CUE de Tollip et l'IL-1R via l'ubiquitine. L'internalisation et la localisation intracellulaire de l'IL-1RI et de Tollip ont été observés par microscopie confocale. En accord avec le rôle de Tollip dans le triage et la recirculation des IL-1R ubiquitiné, une quantité importante de Tollip été détectée dans l' endosome tardif. Nous avons pu démontrer que Tollip était nécessaire pour diriger efficacement ubiquitiné vers les lysosomes. Dans des cellules déficientes pour Tollip, ou reconstituées avec un mutant de Tollip (MF/AA) incapable de lier l'ubiquitine, IL-1RI s'accumule dans des vesicules anormales de l'endosome tardif. Dans ce travail, nous avons pu confirmer et préciser la fonction de la protéine Tollip dans l' activation de la production de cytokines induites par l' IL-1p and le LPS lors de l'inflammation et découvrir son rôle d'adaptateur dans l' internalisation et l'endocytose de l' IL-1RI.

Targeted inactivation of hypocretin receptors in dopaminergic and noradrenergic systems alters brain activity in wakefulness

Since the discovery of hypocretins/orexins (Hcrt/Ox) in 1998, several narcoleptic mouse models, such as Hcrt-KO, Hcrtrl-KO, Hcrtr2-KO and double receptors KO mice, and orexin-ataxin transgenic mice were generated. The available Hcrt mouse models do not allow the dissection of the specific role of Hcrt in each target region. Dr. Anne Vassalli generated loxP-flanked alleles for each Hcrt receptor, which are manipulated by Cre recombinase to generate mouse lines with disrupted Hcrtrl or Hcrtr2 (or both) in cell type-specific manner. The role of noradrenaline (NA) and dopamine (OA) in ttie regulation of vigilance states is well documented. The purpose of this thesis is to explore the role of the Hcrt input into these two monoaminergic systems. Chronic loss of Hcrtrl in NA neurons consolidated paradoxical sleep (PS), and altered wakefulness brain activity in baseline, during the sleep deprivation (SD), and when mice were challenged by a novel environment, or exposed to nest-building material. The analysis of alterations in the sleep EEG delta power showed a consistent correlation with the changes in the preceding waking quality in these mice. Targeted inactivation of Hcrt input into DA neurons showed that Hcrtr2 inactivation present the strongest phenotype. The loss of Hcrtr2 in DA neurons caused modified brain activities in spontaneous wakefulness, during SD, and in novel environmental conditions. In addition to alteration of wakefulness quality and quantity, conditional inactivation of Hcrtr2 in DA neurons caused an increased in time spent in PS in baseline and a delayed and less complete PS recovery after SD. In the first 30 min of sleep recovery, single (i.e. for Hcrtrl or Hcrtr2) conditional knockout receptor mice had opposite changes in delta activity, including an increased power density in the fast delta range with specific inactivation of Hcrtr2, but a decreased power density in the same range with specific inactivation of Hcrtrl in DA cells. These studies demonstrate a complex impact of Hcrt receptors signaling in both NA and DA system, not only on quantity and quality of wakefulness, but also on PS amount regulation as well as on SWS delta power expression. -- Depuis la découverte des hypocrétines/orexines (Hcrt/Ox) en 1998, plusieurs modèles de souris, narcoleptiques telles que Hcrt-KO, Hcrtr2-KO et récepteurs doubles KO et les souris transgéniques orexine-ataxine ont été générés. Les modèles de souris Hcrt disponibles ne permettaient pas la dissection du rôle spécifique de l'Hcrt dans chaque noyau neuronal cible. Notre laboratoire a généré des allèles loxP pour chacun des 2 gènes codant pour les récepteurs Hcrtr, qui sont manipulés par recombinase Cre pour générer des lignées de souris avec Hcrtrl inactivé, ou Hcrtr2 inactivé, (ou les deux), spécifiquement dans un type cellulaire particulier. Le rôle de la noradrénaline (NA) et la dopamine (DA) dans la régulation des états de vigilance est bien documentée. Le but de cette thèse est d'étudier le rôle de l'afférence Hcrt dans ces deux systèmes monoaminergiques au niveau de l'activité cérébrale telle qu'elle apparaît dans l'électroencéphalogramme (EEG). Mon travail montre que la perte chronique de Hcrtrl dans les neurones NA consolide le sommeil paradoxal (PS), et l'activité cérébrale de l'éveil est modifiée en condition spontanée, au cours d'une experience de privation de sommeil (SD), et lorsque les souris sont présentées à un nouvel environnement, ou exposées à des matériaux de construction du nid. Ces modifications de l'éveil sont corrélées à des modifications de puissance de l'activité delta du sommeil lent qui le suit. L'inactivation ciblée des Hcrtrs dans les neurones DA a montré que l'inactivation Hcrtr2 conduit au phénotype le plus marqué. La perte de Hcrtr2 dans les neurones DA mène à des modification d'activité cérébrale en éveil spontané, pendant SD, ainsi que dans des conditions environnementales nouvelles. En plus de l'altération de la qualité de l'éveil et de la quantité, l'inactivation conditionnelle de Hcrtr2 dans les neurones DA a provoqué une augmentation du temps passé en sommeil paradoxal (PS) en condition de base, et une reprise retardée et moins complète du PS après SD. Dans les 30 premières minutes de la récupération de sommeil, les modèles inactivés pour un seul des récepteurs (ie pour Hcrtrl ou Hcrtr2 seulement) montrent des changements opposés en activité delta, en particulier une densité de puissance accrue dans le delta rapide avec l'inactivation spécifique de Hcrtr2, mais une densité de puissance diminuée dans cette même gamme chez les souris inactivées spécifiquement en Hcrtrl dans les neurones DA. Ces études démontrent un impact complexe de l'inactivation de la neurotransmission au niveau des récepteurs d'Hcrt dans les deux compartiments NA et DA, non seulement sur la quantité et la qualité de l'éveil, mais aussi sur la régulation de quantité de sommeil paradoxal, ainsi que sur l'expression de la puissance delta pendant le sommeil lent.

Fibroblast surface-associated FGF-2 promotes contact-dependent colorectal cancer cell migration and invasion through FGFR-SRC signaling and integrin αvβ5-mediated adhesion.

Carcinoma-associated fibroblasts were reported to promote colorectal cancer (CRC) invasion by secreting motility factors and extracellular matrix processing enzymes. Less is known whether fibroblasts may induce CRC cancer cell motility by contact-dependent mechanisms. To address this question we characterized the interaction between fibroblasts and SW620 and HT29 colorectal cancer cells in 2D and 3D co-culture models in vitro. Here we show that fibroblasts induce contact-dependent cancer cell elongation, motility and invasiveness independently of deposited matrix or secreted factors. These effects depend on fibroblast cell surface-associated fibroblast growth factor (FGF) -2. Inhibition of FGF-2 or FGF receptors (FGFRs) signaling abolishes these effects. FGFRs activate SRC in cancer cells and inhibition or silencing of SRC in cancer cells, but not in fibroblasts, prevents fibroblasts-mediated effects. Using an RGD-based integrin antagonist and function-blocking antibodies we demonstrate that cancer cell adhesion to fibroblasts requires integrin αvβ5. Taken together, these results demonstrate that fibroblasts induce cell-contact-dependent colorectal cancer cell migration and invasion under 2D and 3D conditions in vitro through fibroblast cell surface-associated FGF-2, FGF receptor-mediated SRC activation and αvβ5 integrin-dependent cancer cell adhesion to fibroblasts. The FGF-2-FGFRs-SRC-αvβ5 integrin loop might be explored as candidate therapeutic target to block colorectal cancer invasion.

Nanocarriers for DNA Vaccines: Co-Delivery of TLR-9 and NLR-2 Ligands Leads to Synergistic Enhancement of Proinflammatory Cytokine Release

Adjuvants enhance immunogenicity of vaccines through either targeted antigen delivery or stimulation of immune receptors. Three cationic nanoparticle formulations were evaluated for their potential as carriers for a DNA vaccine, and muramyl dipeptide (MDP) as immunostimulatory agent, to induce and increase immunogenicity of Mycobacterium tuberculosis antigen encoding plasmid DNA (pDNA). The formulations included (1) trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles, (2) a squalene-in-water nanoemulsion, and (3) a mineral oil-in-water nanoemulsion. The adjuvant effect of the pDNA-nanocomplexes was evaluated by serum antibody analysis in immunized mice. All three carriers display a strong adjuvant effect, however, only TMC nanoparticles were capable to bias immune responses towards Th1. pDNA naturally contains immunostimulatory unmethylated CpG motifs that are recognized by Toll-like receptor 9 (TLR-9). In mechanistic in vitro studies, activation of TLR-9 and the ability to enhance immunogenicity by simultaneously targeting TLR-9 and NOD-like receptor 2 (NLR-2) was determined by proinflammatory cytokine release in RAW264.7 macrophages. pDNA in combination with MDP was shown to significantly increase proinflammatory cytokine release in a synergistic manner, dependent on NLR-2 activation. In summary, novel pDNA-Ag85A loaded nanoparticle formulations, which induce antigen specific immune responses in mice were developed, taking advantage of the synergistic combinations of TLR and NLR agonists to increase the adjuvanticity of the carriers used.