Expression and role of BORIS/CTCFL in human cancer stem cells

Le cancer est défini comme la croissance incontrôlée des cellules dans le corps. Il est responsable de 20 % des décès en Europe. Plusieurs expériences montrent que les tumeurs sont issues et se développent grâce à un petit nombre de cellules, que l'on appelle cellules souches cancéreuses (CSC). Ces CSC sont également responsables de l'apparition de métastases et de la résistance aux médicaments anticancéreux. De ce fait, l'identification des gènes qui contribuent aux propriétés de ces CSC (comme la survie des tumeurs, les métastases et la résistance aux médicaments) est nécessaire pour mieux comprendre la biologie des cancers et d'améliorer la qualité des soins des patients avec un cancer. A ce jour, de nombreux marqueurs ont été proposés ainsi que de nouvelles thérapies ciblées contre les CSC. Toutefois, et malgré les énormes efforts de la recherche dans ce domaine, la quasi-totalité des marqueurs de CSC connus à ce jour sont aussi exprimés dans les cellules saines. Ce projet de recherche visait à trouver un nouveau candidat spécifique des CSC. Le gène BORIS (pour Brother of Regulator of Imprinted Sites), nommé aussi CTCFL (CTCF-like), semble avoir certaines caractéristiques de CSC et pourrait donc devenir une cible prometteuse pour le traitement du cancer. BORIS/CTCFL est une protéine nucléaire qui se lie à l'ADN, qui est exprimée dans les tissus normaux uniquement dans les cellules germinales et qui est réactivée dans un grand nombre de tumeurs. BORIS est impliqué dans la reprogrammation épigénétique au cours du développement et dans la tumorigenèse. En outre, des études récentes ont montré une association entre l'expression de BORIS et un mauvais pronostic chez des patients atteints de différents types de cancers. Nous avons développé une nouvelle technologie basée sur les Molecular Beacon pour cibler l'ARNm de BORIS et cela dans les cellules vivantes. Grâce à ce système expérimental, nous avons montré que seule une toute petite sous-population (0,02 à 5%) de cellules tumorales exprimait fortement BORIS. Les cellules exprimant BORIS ont pu être isolées et elles présentaient les caractéristiques de CSC, telles qu'une forte expression de hTERT et des gènes spécifiques des cellules souches (NANOG, SOX2 et OCT4). En outre, une expression élevée de BORIS a été mise en évidence dans des populations enrichies en CSC ('side population' et sphères). Ces résultats suggèrent que BORIS pourrait devenir un nouveau et important marqueur de CSC. Dans des études fonctionnelles sur des cellules de cancer du côlon et du sein, nous avons montré que le blocage de l'expression de BORIS altère largement la capacité de ces cellules à former des sphères, démontrant ainsi un rôle essentiel de BORIS dans l'auto- renouvellement des tumeurs. Nos expériences montrent aussi que BORIS est un facteur important qui régule l'expression de gènes jouant un rôle clé dans le développement et la progression tumorale, tels le gène hTERT et ceux impliqués dans les cellules souches, les CSC et la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). BORIS pourrait affecter la régulation de la transcription de ces gènes par des modifications épigénétiques et de manière différente en fonction du type cellulaire. En résumé, nos résultats fournissent la preuve que BORIS peut être classé comme un gène marqueur de cellules souches cancéreuse et révèlent un nouveau mécanisme dans lequel BORIS jouerait un rôle important dans la carcinogénèse. Cette étude ouvre de nouvelles voies pour mieux comprendre la biologie de la progression tumorale et offre la possibilité de développement de nouvelles thérapies anti-tumorales et anti-CSC avec BORIS comme molécule cible. - Cancer is defined as the uncontrolled growth of cells in the body. It causes 20% of deaths in the European region. Current evidences suggest that tumors originate and are maintained thanks to a small subset of cells, named cancer stems cells (CSCs). These CSCs are also responsible for the appearance of metastasis and therapeutic resistance. Consequently, the identification of genes that contribute to the CSC properties (tumor survival, metastasis and therapeutic resistance) is necessary to better understand the biology of malignant diseases and to improve care management. To date, numerous markers have been proposed to use as new CSC- targeted therapies. Despite the enormous efforts in research, almost all of the known CSCs markers are also expressed in normal cells. This project aimed to find a new CSC-specific candidate. BORIS (Brother of Regulator of Imprinted Sites) or CTCFL (CTCF-like) is a DNA binding protein involves in epigenetic reprogramming in normal development and in tumorigenesis. Recent studies have shown an association of BORIS expression with a poor prognosis in different types of cancer patients. Therefore, BORIS seems to have the same characteristics of CSCs markers and it could be a promising target for cancer therapy. BORIS is normally expressed only in germinal cells and it is re-expressed in a wide variety of tumors. We developed a new molecular beacon-based technology to target BORIS mRNA expressing cells. Using this system, we showed that the BORIS expressing cells are only a small subpopulation (0.02-5%) of tumor cells. The isolated BORIS expressing cells exhibited the characteristics of CSCs, with high expression of hTERT and stem cell genes (NANOG, SOX2 and OCT4). Furthermore, high BORIS expression was observed in the CSC-enriched populations (side population and spheres). These results suggest that BORIS might be a novel and powerful CSCs marker. In functional studies, we observed that BORIS knockdown significantly impairs the capacity to form spheres in colon and breast cancer cells, thus demonstrating a critical role of BORIS in the self-renewal of tumors. The results showed in the functional analysis indicate that BORIS is an important factor that regulates the expression of key-target genes for tumor development and progression, such as hTERT, stem cells, CSCs markers and EMT (epithelial mesenchymal transition)-related marker genes. BORIS could affect the transcriptional regulation of these genes by epigenetic modification and in a cell type dependent manner. In summary, our results support the evidence that BORIS can be classified as a cancer stem cell marker gene and reveal a novel mechanism in which BORIS would play a critical role in tumorigenesis. This study opens new prospective to understand the biology of tumor development and provides opportunities for potential anti-tumor drugs.

Une approche causale des comportements d'achat et post-achat de produits écolabellisés

RESUMÉ Objectifs de la recherche: Depuis quelques années, l'utilisation de l'écologie dans le marketing a connu un essor considérable, aussi bien dans le monde académique que dans la pratique. De nos jours, la notion de label suscite un vif intérêt auprès des entreprises désireuses de promouvoir des produits "verts". Le principe de l'écolabellisation consiste à fournir aux consommateurs, en plus du prix, un nouvel élément de comparaison des produits. Les écolabels sont considérés comme l'un des meilleurs outils pour informer le consommateur, d'une manière claire et compréhensible, de l'impact du produit sur l'environnement. Nous nous intéressons, dans le cadre de notre travail, à l'étude du comportement d'achat des produits écolabellisés. En dépit de leur popularité croissante, les études académiques portant sur les labels écologiques sont relativement rares et de nombreuses problématiques demeurent en suspens. L'étude du comportement d'achat - au sens large - mérite notamment d'être approfondie. Notre recherche a plusieurs volets. Premièrement, nous étudions l'impact des valeurs, de l'implication vis-à-vis de l'écologie, du scepticisme, de la compréhension du label et de la connaissance de l'écologie sur le comportement d'achat de produits écolabellisés. Ensuite, nous testons la cohérence entre comportements écologiques en introduisant un comportement post- achat (le triage des déchets ménagers). Théories sous-jacentes: Notre étude repose sur différents apports académiques relatifs au comportement du consommateur "vert" mais également sur des concepts issus de la psychologie et de la sociologie. Nous présentons d'abord la littérature portant sur la caractérisation du consommateur "vert" (Webster, 1975; Arbuthnot, 1977; Van Liere et Dunlap, 1981; Balderjahn, 1988; Antil, 1984; Grunert et Juhl, 1995; Roberts, 1996). Nous abordons ensuite les études portant sur les valeurs (Schwartz, 1992; 1994), l'implication (Zaichkowsy, 1994), le scepticisme (Gray-Lee, Scammon et Mayer, 1994; Mohr et al., 1998), la compréhension des écolabels (van Dam et Reuvekamp, 1995; Thogersen, 2000) et la connaissance de l'écologie (Maloney et al., 1973, 1975; Arbuthnot, 1977; Pickett et al., 1993). Ces variables nous semblent être les plus à même d'influencer le comportement d'achat de produits écolabellisés. Enfin, sur la base des travaux de Valette-Florence et Roehrich (1993), nous développons un modèle de causalité, centré sur la relation entre les valeurs, l'implication et le comportement. Hypothèses de recherche et opérationnalisation des variables: Nous développons 16 hypothèses de recherche dont 12 portent sur les rapports de causalité entre construits. Par ailleurs, pour mieux comprendre la personnalité du consommateur de produits écolabellisés, nous distinguons les variables reflétant un intérêt collectif (altruisme) de celles reflétant un intérêt individuel (égocentrisme). La mesure des différents construits reposent sur la liste de Schwartz (1992, 1994) pour les valeurs, l'échelle d'implication de Zaichkowsy (1994) pour la publicité, l'échelle développée par Mohs et al. (1998) pour mesurer le scepticisme et une liste de questions portant sur l'écologie (Diekmann, 1996) pour tester le niveau de connaissance. Les comportements d'achat et post-achat sont mesurés respectivement à l'aide de questions relatives à la fréquence d'achat de produits écolabellisés et du triage des déchets ménagers. Collecte des données: Le recueil des données s'effectue par sondage, en ayant recours à des questionnaires auto-administrés. L'échantillon comprend de 368 étudiants provenant de diverses facultés de sciences humaines de Suisse Romande. Analyse des données et interprétation des résultats: Notre étude porte sur le comportement d'achat de trois labels écologiques et sur le triage de 7 déchets ménagers. Les différentes analyses montrent que certaines valeurs ont un impact sur l'implication et que l'implication a une influence positive sur le comportement d'achat et post-achat. Par ailleurs, nous montrons que l'implication sert de variable médiatrice entre les valeurs et le comportement. De plus, la compréhension de l'écolabel influence de manière positive l'achat de produits écolabellisés, la connaissance de l'écologie a une influence positive sur le comportement post-achat et le scepticisme vis-à-vis de l'utilité du triage des déchets ménagers influence négativement le comportement de triage. Implications managériales: Les résultats obtenus suggèrent qu'outre la valeur "protection de l'environnement", d'autres valeurs comme "la stimulation" ou encore "l'accomplissement" influencent de manière significative l'implication vis-à-vis de l'écologie qui à son tour influence l'achat de produits écolabellisés. Le manager doit donc tenir compte du fait que le consommateur est impliqué dans l'écologie. Ensuite, la compréhension du label joue un rôle prépondérant dans l'achat. De plus, le consommateur ne semble pas être sceptique par rapport aux informations fournies par les écolabels et le niveau de connaissance de l'écologie n'affecte pas son comportement. Enfin, le consommateur semble agir de manière cohérente en achetant différents produits écolabellisés. Apports, limites et voies de recherche: Notre étude contribue à l'enrichissement de la recherche sur le comportement du consommateur dans un contexte écologique à plusieurs égards, notamment par l'étude de la relation entre les valeurs, l'implication et le comportement. Néanmoins, la portée de notre recherche est naturellement restreinte en raison du nombre limité de cas étudiés, soit 3 labels écologiques relativement peu connus de notre échantillon. Il serait utile de répéter l'étude en utilisant des labels plus populaires. Par ailleurs, nous avons eu recours à des échelles développées dans des contextes quelque peu différents. En particulier, une échelle d'implication devrait être développée spécifiquement pour le contexte écologique.

Sex and clock to discover new PPARα functions

Summary : PPARα is a ligand-activated transcription factor that is a member of the nuclear receptor superfamily. In rodents, PPARα is highly expressed in liver, especially in parenchymal cells, where it has an impact on several hepatic functions such as nutrient metabolism, inflammation and metabolic stress. Ligands for PPARα comprise long chain unsaturated fatty acids, eicosanoids and lipid lowering fibrate drugs. In liver, many metabolic processes are orchestrated by the hepatic circadian clock. The aim of the hepatic clock is to synchronize cellular pathways allowing animals to adapt their metabolism to predictable daily changes in the environment. Indeed, similar to PPARα, the hepatic clock influences nutrient metabolism and detoxification through circadian output regulators :the PAR-domain basic leucine zipper proteins called PAR blip proteins. In this report, we showed that through a positive feedback loop mechanism, PAR. blip, proteins participate to the availability of PPARα endogenous ligands that contribute to the circadian expression and functions of PPARα. Interestingly, we also discovered some unexpected hepatic sexual dimorphic functions of PPARα. These functions are determined b PPARα sumoylation, interaction with DNA methylation mechanism and with unexpected proteins with gender specificity. The connection between circadian clock and hepatic sexual dimorphism opens new perspectives regarding the chronobiology of PPARα activity and the beneficial effects of PPARα agonist in the treatment of diseases related to steroid hormones metabolism characterized by inflammation and hepatotoxicity. Résumé : PPARα est un facteur de transcription activé par un ligand, membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Chez les rongeurs, PPARα est fortement exprimé dans le foie, spécialement dans les cellules du parenchyme dans lesquelles il joue un role important dans les fonctions hépatiques tels que le métabolisme des nutriments, l'inflammation et les stress métaboliques. Les ligands pour PPARα comprennent les acides gras à longues chaînes, les eicosanoides et les médicaments hypolipidémiques (fibrates). Dans le foie, beaucoup de processus métaboliques sont orchestrés par l'horloge circadienne hépatique. Le but de cette horloge est de synchroniser les voies métaboliqués permettant aux animaux d'adapter leurs métabolismes aux changements journaliers. Ainsi, l'horloge hépatique influence le métabolisme des nutriments tels que l'utilisation des lipides à travers certains régulateurs circadians appelés facteurs de transcription PAR bZips. Dans ce mémoire, nous avons montré qu'à travers une boucle de régulation, les protéines PAR bZip contrôlent la production des ligands endogènes à PPARα, jouant un rôle dans l'expression circadienne et les fonctions de PPARα. Nous avons également découvert des aspects méconnus des fonctions liées au dimorphisme sexuel de PPARα. Nous avons montré que PPARα est différemment sumoylisé entre les sexes et interagit avec la méthylation de l'ADN ainsi qu'avec des protéines insoupçonnées comme partenaires de PPARα. De part leur lien avec l'horloge circadienne et le dimorphisme sexuel, nos découvertes ouvrent de nouvelles perspectives concernant la chronobiologie de l'activité de PPARα et les effets bénéfiques des ses activateurs dans le traitement des maladies liées au métabolisme des hormones stéroides.

Characterization of N-cadherin association to lipid rafts in melanoma

RESUME La peau est un organe complex composé de deux parties distinctes: l'épiderme et le derme, séparé par une membrane basale. Dans la couche basale de l'épiderme, les melanocytes synthétisent la mélanine dans des mélanosomes. Les mélanosomes sont ensuite transportés des mélanocytes vers les kératinocytes, protégeant ainsi la peau des dégâts dus aux radiations U.V. La E-cadhérine assure l'adhésion entre les mélanocytes et les kératinocytes. Au cours de la transformation du mélanocyte en cellule malignes, les mélanocytes perdent l'expression de la E-cadhérine et, simultanément, se mettent à exprimer la N-cadhérine, ce phénomène est nommé « cadherin switch ». La perte de l'expression de la E-cadhérine permet au mélanocytes d'échapper au contrôle des kératinocytes, tandis que l'expression de la N-cadhérine promeut l'invasion métastasique des cellules de mélanome. Préalablement, nous avons trouvé qu'une fraction de la N-cadhérine était localisée les microdomaines membranaires spécialisés, enrichi en cholestérol et en glycosphingolipides, appelés « lipid rafts ». Une des particularité des « lipid rafts » est qu'ils sont riches en molécules permettant la transmission de signaux d'activation. De plus, des travaux récents rapportent qu'un sous-type de « lipid rafts » appelé caveolae pourrai contribuer à la progression tumorale. S'appuyant sur le rôle prépondérant de la N-cadhérine dans la progression du mélanome ainsi que sur sa présence dans les « lipid rafts », nous avons émis l'hypothèse que l'association de la N-cadhérine avec les « lipid rafts » pourrai contribuer à la progression du mélanome. Le but de ce projet à été de caractériser l'association de la Ncadhérine avec les « lipid rafts » au cours de la progression du mélanome. Au moyen de lignées cellulaires humaines, dérivées de mélanomes à différents stades de progression, nous avons trouvé que (1) la N-cadhérine est partiellement associée aux «lipid rafts » dans six lignées dérivées de mélanome en phase avancée de progression et dans des tumeurs expérimentales, mais pas dans deux lignées dérivées de mélanome à un stade plus précoce ; (2) l'association de la N-cadhérine dans les « lipid rafts » ne dépent pas de son niveau d'expression ; (3) la E-cadhérine n'est pas présente dans les « lipid rafts »d'une lignée de cellule de mélanome ayant conservé l'expression de la E-cadhérine ; (4) la localisation de la N-cadhérine dans les « lipid rafts »n'est pas modulée par les facteurs de croissance bFGF, IGF-I, et HRG1-β1, ni par des voies de signalisation impliquant MEK, PKA, les kinases de la famille Src, et PI3K ; (5) l'association de la N-cadhérine avec les « lipid rafts » n'est pas requise pour la stabilisation des jonctions adhérentes et n'est pas perturbée par la destruction de ces dernières ; (6) la N-cadhérine dans les « lipid rafts » forme un complexe avec β-caténine, p 120ctn et α-caténine. En conclusion, cette étude originale montre pour la première fois que dans des cellules de mélanome agressifs, une fraction de la N-cadhérine est localisée dans les « lipid rafts » en association avec β-caténine, p 120ctn et α-caténine. Comme la présence de la N-cadhérine dans les « lipid rafts » ne contribue pas à la formation de jonction adhérentes, cette étude suggère une nouvelle fonction pour la N-cadhérine dans les « lipid rafts ». SUMMARY Human skin is a complex organ composed of two layers separated by a basement membrane: the epidermis and the dermis. In the basal layer of the epidermis, the melanin-producing cells of the skin, the melanocytes deliver melanin-containing melanosomes to keratinocytes, thereby protecting the epidermis and the dermis from the deleterious effects of ultraviolet light. Melanocytes physically interact with keratinocytes through E-cadherin-mediated adhesion. During malignant transformation into melanoma cells, melanocytes lose E-cadherin expression and concomitantly gain expression of N-cadherin, a phenomenon referred to as "cadherin switch". Loss of E-cadherin allows melanocytes to escape the regulatory effects of neighbouring keratinocytes, while gain of N-cadherin expression promotes migration, invasion and metastatic abilities of melanoma cells. In preliminary experiments, we found that a fraction of N-cadherin localized to specialized membrane microdomains enriched in cholesterol- and glycosphingolipid, called lipid rafts. One particular feature of lipid rafts is that they are rich in signalling molecules and they possibly modulate transmembrane signalling events. Moreover, recent reports suggested that a specialized type of rafts called caveolae might contribute to tumor progression. Based on the documented role of N-cadherin in melanoma progression and its presence in lipid rafts of melanoma cells, we raised the hypothesis that the association of N-cadherin with lipid rafts might be relevant to melanoma progression. The aim of this project was to characterize N-cadherin associated to lipid rafts during melanoma progression. Using human melanoma cell lines derived from melanoma at different stages of progression, we found that (1) N-cadherin is partly associated to lipid rafts in six cell lines derived from melanomas at late stages of progression and in experimental tumors, but not in two melanoma cell lines derived from early stages; (2) N-cadherin targeting to lipid rafts does not depend on its expression level; (3) E-cadherin is not localized in lipid rafts of a melanoma cell line that retained E-cadherin expression; (4) N-cadherin localization to lipid rafts is not modulated by the growth factors bFGF, IGF-I, and HRG1-β1, nor by MEK-, PKA-, Src family kinases-, and PI3K-mediated signalling events; (5) the association of N-cadherin with lipid rafts is not required for adherens junctions stability nor it is perturbed by adherens junctions disruption; (6) N-cadherin in lipid rafts is in complex with β-catenin, p 120ctm and α-catenin. In conclusion, this study provides original evidence that in aggressive melanoma cells a pool of N-cadherin is localized in lipid rafts in association with β-catenin, p 120 and α-catenin. The presence of N-cadherin in lipid rafts independently of its involvement in adherens junctions formation, suggests a possible new role for N-cadherin recruited to lipid rafts. Further studies investigating the biological meaning of this localization promise to uncover new properties of this molecule.

Hypolipidemic therapeutics and muscle metabolism

Summary : Lipid metabolism disorders, leading to obesity and cardiovascular diseases, are a major public health issue worldwide. These diseases have been treated by drugs and surgery, leading to tremendous costs and secondary morbidity. The aim of this thesis work is to investigate the mechanisms of actions of a new, micronutrition-based, approach to prevent obesity and cardiovascular diseases. This specific combination of micronutrients, Lipistase, incorporated into any dietary ail can be used in the daily food. Micronutrients are substances used by the living organism in small quantities to maintain physiological homeostasis. However, the human body is not able to produce them and has to obtain them from dietary sources. The combination of micronutrients investigated here, is composed of 26 compounds including trace elements, vitamins, minerals, ails and plant extracts, known to have individually a beneficial effect on lipid metabolism regulation. These specific micronutrients are used for the first time in a combinatorial mode targeting several metabolic pathways for better homeostasis control as opposed to a single target treatment, either chemical or natural. Short and long term studies, in different mouse strains, showed a significant decrease in plasma triglycerides, body weight gain and body fat mass in animals that were fed with a standard diet containing Lipistase. Additionally, a greatly reduced fat accumulation was observed in adipose tissue and liver of Lipistase-treated animals, while lipid and glucose utilization by skeletal muscle was enhanced. Moreover, the size of atherosclerotic plaques was significantly reduced in mice whose masher was treated during pregnancy and suckling, without showing any adverse effect. Finally, Lipistase has been shown to increase longevity by 20%. The control mice that did not receive Lipistase in their diet did not show all these beneficial effects. These micronutrients are used at the lowest dosage ever reported for treating Lipid disorders, resulting in far much lower costs as well as probably a higher safety. This is the first approach being very suitable for an effective large scale prevention policy for obesity and cardiovascular diseases, like iodine in dietary salt has been for goiter. Résumé : Les dysrégulations du métabolisme des lipids, à l'origine d'obésité et de maladies cardiovasculaires, sont un problème de santé publique majeur et mondial. Ces maladies impliquent des traitements médicamenteux et chirurgicaux dont le coût la morbidité secondaire sont très important. Le but de ce travail de thèse est d'étudier les mécanismes d'action d'une nouvelle approche préventive, basée sur la micronutrition. Cette combinaison spécifique de micronutriments, Lipistase, peut être incorporée dans n'importe quelle huile alimentaire et utilisée dans l'alimentation quotidienne. Les micronutrirnents sont des substances essentielles, à très faibles doses, pour le maintien de l'homéostasie physiologique des organismes vivants. Cependant, étant incapable de les synthétiser, le corps humain est dépendant en cela de l'apport alimentaire. La combinaison de micronutriments que nous avons étudié contient 26 composants, incluant des extraits de plantes, des huiles, des vitamines, des métaux et des minéraux, tous connus pour avoir individuellement des effets bénéfiques sur la régulation du métabolisme des lipides. Ces micronutriments spécifiques sont utilisés pour la première fois en mode combinatoire, ciblant ainsi plusieurs voies métaboliques pour un meilleur control de l'homéostasie, par opposition monothérapies chimiques ou naturelles. Des expériences de court et long terme, avec divers modèles de souris, ont montré une diminution significative des taux de triglycérides plasmatiques, de la prise de poids et de la masse graisseuse corporelle chez les animaux qui ont reçu Lipistase dans la nourriture standard. Une accumulation significativement moins importante des graisses a été observée dans le tissu adipeux et hépatique des souris traitées, alors que l'utilisation des lipides et glucose a été favorisée dans le muscle. En outre, la taille des plaques d'athérosclérose aété significativement réduite chez les souris dont la mère a été traitée pendant la grossesse et l'allaitement, sans montrer aucun effet indésirable. Enfin, les souris traitées par Lipistase ont vécu 20% plus longtèmps. Les souris contrôles qui n'ont pas reçu Lipistase dans la nourriture n'ont montré aucun de ces effets bénéfiques. Ces micronutriments sont utilisés au dosage le plus faible jamais rapporté pour le traitement des maladies du métabolisme lipidique, permettant ainsi un coût plus faible et surtout une meilleure sécurité. C'est une approche adéquate pour une politique de prévention de santé publique à large échelle de l'obésité et des maladies cardiovasculaires. C'est en cela et sous bien d'autres aspects, une première dans la prise en charge des maladies du métabolisme lipidique et pourrait même être pour ces dernières ce que l'iode du sel de cuisine a été pour le goitre.

Study of the proteolytic activity of the paracaspase MALT1 in T cell activation

Summary : Several signalling cascades are initiated through the triggering of the T cell receptor (TCR) by an antigenic peptide expressed at the surface of an antigen presenting cell. These pathways lead to morphological changes controlling T cell adhesiveness and migration to the site of infection, and to the activation of transcription factors that regulate key genes for the proper development of the immune response. Amongst them, the nuclear factor xB (NF-κB) is the subject of intense research since more than twenty years because deregulated NF-κB signalling in lymphocytes can lead to immunodeficiency, autoimmunity or lymphomas. Therefore, the understanding of the molecular mechanisms regulating NF-κB activation is important for the development of new therapeutics aimed at treating various diseases. In T lymphocytes, a complex composed of CARMAI, BCL10 and MALT1 relays signals from TCR proximal events to NF-κB activation. Gene translocations of the BCL10 or MALTI genes or oncogenic mutations affecting CARNA 1 result in constitutive NF-κB activation and are related to the development of certain forms of lymphomas. MALT1 contains acaspase-like domain, but it is unknown whether this domain is proteolytically active. In this study, we found that MALT1 has arginine-directed proteolytic activity. We showed that the proteolytic activity of MALT 1 is key to TCR-induced NF-κB activation and production of interleukin 2. We identified BCL 10 as a MALT 1 substrate, and we showed that its cleavage regulates T cell adhesion to the extracellular matrix protein fibronectin. Furthermore, we identified caspase 10 as another substrate of MALT1. caspase 10 is a close homologue of caspase 8 and is known to be involved in the induction of apoptosis upon Fast or TRAIL stimulation. We showed that caspase 10 is important for TCR-induced NF-κB activation and interleukin 2 production, identifying for the first time a non apoptotic function for caspase 10. These data provide evidence for previously uncharacterized roles of MALT 1 and BCL 10 in the regulation of T cell adhesion and of caspase 10 in the activation of lymphocytes, and allow a better understanding of the molecular mechanisms of T lymphocyte activation. Since the proteolytic activity of MALT1 is essential to T cell activation, it suggests that the targeting of this activity may be relevant for the development of immunomodulatory or anticancer drugs. Résumé : De nombreuses voies de signalisation sont initiées via la stimulation des récepteurs des cellules T (TCR) par un peptide antigénique exprimé à la surface d'une cellule présentatrice d'antigènes. Ces cascades de signalisation produisent des changements morphologiques qui contrôlent l'adhésion des cellules T et leur migration vers le site d'infection. Elles contrôlent également l'activation de facteurs de transcription qui régulent la transcription de gènes importants pour la réponse immunitaire. Parmi ces derniers, le facteur nucléaire KB (NF-κB) joue un rôle essentiel, puisqu'une régulation aberrante de son activité dans les lymphocytes peut causer des immunodéficiences, des maladies autoimmunes ou des lymphomes. C'est pour cela que la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent l'activation de NF-κB est donc importante pour le développement de nouvelles thérapies. Un complexe contenant les protéines CAIZMAI, BCL10 et MALT1 transmet, dans les lymphocytes T, le signal du TCR vers l'activation de NF-κB. Des translocations des gènes qui codent pour BCL10 et MALTI et des mutations affectant la fonction de CARNAI ont été liées au développement de certaines formes de lymphomes. MALTI contient un domaine qui ressemble au domaine catalytique présent dans les caspases, mais il n'est pas connu si ce domaine a une activité protéolytique. Dans cette étude, nous avons découvert que MALTI est une protéase qui a une spécificité pour les acides aminés basiques comme l'arginine. Nous montrons que l'activité protéolytique de MALTI est importante pour l'activation de NF-κB et la production d'interleukine 2 après stimulation du TCR. Nous avons observé que BCL10 est clivé par MALTI pendant l'activation des lymphocytes T, et que ce clivage est impliqué dans la régulation de l'adhésion des lymphocytes T à la fibronectin, une protéine de la matrice extracellulaire. De plus, nous avons identifié que la caspase 10, qui a une grande homologie avec la caspase 8 et qui jusqu'à maintenant est connue pour son rôle dans l'induction de la mort cellulaire en réponse à une stimulation par Fast ou par TRAIL, est également un substrat de MALT 1. En montrant que la caspase 10 est nécessaire à l' activation de NF-icB et à la production de l'interleukine 2 après stimulation du TCR, nous décrivons pour la première fois une fonction non apoptotique de la caspase 10. Ces résultats décrivent de nouveaux rôles pour MALT1 et BCL10 dans le contrôle de l'adhésion des lymphocytes T et de la caspase 10 pour l'activation des lymphocytes T. Puisque l'activité protéolytique de MALT1 est essentielle pour l'activation des lymphocytes T, nous suggérons que cibler cette activité protéolytique de MALT 1 pourrait amener de nouvelles possibilités de traitement de maladies où une activation aberrante des lymphocytes est impliquée.

Modulation of the airway allergic response : characterization of the cellular and molecular mechanisms

ABSTRACT Allergic asthma is a major complication of atopy. Its severity correlates with the presence of activated T lymphocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Mechanisms that protect against asthma are poorly understood. Based on oral models of mucosal tolerance induction, models using the nasal route showed that uptake of important amounts of antigen can induce tolerance and reverse the allergic phenotype. 1L-10 producing regulatory T cells were proposed as key players in tolerance induction, but other players, e.g. dendritic cells (DC), B cells and epithelial cells may have to be taken into consideration. The objective of the present study is to characterize the effects of a therapeutic intranasal treatment (INT) in a murine model of asthma and to determine, in this model, the cellular and molecular mechanisms leading to protection against asthma. First, we established an asthma model by sensitizing the BALB/c mouse to ovalbumin (OVA) by two intraperitoneal injections of alum-adsorbed OVA and three inhalations of aerosolized OVA. Then OVA was applied to the nasal mucosa of OVA- sensitized mice. Mice were later re-exposed to OVA aerosols to assess the protection induced by OVA INT. OVA sensitization induced strong eosinophil recruitment, OVA-specific T cell proliferation and IgE production. Three intranasal treatments at 24-hour intervals with 1.5 mg OVA drastically reduced inflammatory cell recruitment into the BALF and inhibited OVA-specific IgE production upon allergen re-exposure. T cell proliferation in ex vivo bronchial lymph node (BLN) cells was inhibited, as well as TH2 cytokine production. Protection against OVA-induced bronchial inflammation was effective for an extended period of time and treated mice resisted a second re-exposure. Transfer of CD4+ cells from BLN and lungs of OVA-treated mice protected asthmatic recipient mice from subsequent aerosol challenge indicating an involvement of CD4+ T regulatory cells in this protection. RESUME L'asthme allergique est une manifestation clinique majeure de l'atopie. La sévérité de l'asthme est liée à la présence de lymphocytes T activés ainsi que d'éosinophiles dans le lavage broncho-alvéolaire (LBA). Les mécanismes permettant de se prémunir contre l'asthme sont mal connus. Basés sur des modèles muqueux d'induction de tolérance par la voie orale, des modèles utilisant la voie nasale ont montré que d'importantes quantités d'antigène peuvent induire une tolérance et ainsi reverser le phénotype allergique. Des cellules régulatrices produisant de l'IL-10 pourraient jouer un rôle clé dans l'induction de la tolérance mais d'autres acteurs tels que les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules épithéliales doivent aussi être prises en compte. L'objectif de la présente étude est de caractériser les effets d'un traitement intranasal thérapeutique dans un modèle murin d'asthme et de déterminer dans ce modèle les mécanismes cellulaires et moléculaires conférant une protection contre l'asthme. En premier lieu, un modèle d'asthme allergique a été établi en sensibilisant des souris BALB/c à l'ovalbumine (OVA) par deux injections intraperitonéales d'OVA adsorbé sur de l'alum et trois séances d'OVA en aérosol. Dans un second temps, de l'OVA a été administrée sur la muqueuse nasale des souris sensibilisées à l'OVA. Les souris furent ensuite challengées par des aérosols d'OVA afin d'évaluer la protection conférée par le traitement intranasal à l'OVA. La sensibilisation à l'OVA a induit un fort recrutement d'éosinophiles, une réponse proliférative des cellules T à l'OVA ainsi qu'une production d'lgE spécifiques. Trois traitements intranasaux à 24 heures d'intervalle avec 1.5 mg d'OVA ont permis de réduire drastiquement le recrutement des cellules inflammatoires dans le LBA ainsi que d'inhiber la production d'lgE spécifiques à l'OVA produits lors d'une ré-exposition à l'OVA. La prolifération en réponse à l'OVA de cellules extraites ex vivo de ganglions bronchiques a, elle aussi, été inhibée de même que la production de cytokines TH2. La protection contre l'inflammation provoquée par l'aérosol est efficace pour une longue période et les souris traitées résistent à une seconde ré- exposition. Le transfert de cellules CD4+ issues de ganglions bronchiques et de poumons de souris traitées à l'OVA protège les souris asthmatiques receveuses contre les effets inflammatoires d'un aérosol, indiquant que des cellules T CD4+ régulatrices pourraient être impliquées dans cette protection. RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC L'asthme est une affection des voies respiratoires qui se caractérise par une contraction de la musculature des voies aériennes, une production de mucus et d'anticorps de l'allergie (IgE). On parle d'asthme allergique lorsque les facteurs déclenchant l'asthme sont des allergènes inhalés tels que acariens, pollens ou poils d'animaux. Le système immunitaire des patients asthmatiques a un défaut de programmation qui le rend réactif à des substances qui sont normalement inoffensives. Le traitement actuel de l'asthme repose sur le soulagement des symptômes grâce à des produits à base de stéroïdes. Les techniques permettant de reprogrammer le système immunitaire (immunothérapie) ne sont pas efficaces pour tous les antigènes et prennent beaucoup de temps. En conséquence, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant une telle reprogrammation afin d'en améliorer le rendement et l'efficacité. Dans ce but, des modèles d'immunothérapie ont été mis au point chez la souris. Ils permettent une plus grande liberté d'investigation. Dans cette étude, un modèle d'asthme allergique dans la souris a été établi par une sensibilisation à un antigène particulier : l'ovalbumine (OVA). Ce modèle présente les caractéristiques principales de l'asthme humain : recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons, augmentation de la production d'anticorps et de la résistance des bronches aux flux respiratoires. Cette souris asthmatique a ensuite été traitée par application nasale d'OVA. Comparées aux souris non traitées, les souris traitées à l'OVA ont moins de cellules inflammatoires dans leurs poumons et produisent moins d'anticorps IgE. D'autres marqueurs inflammatoires sont aussi fortement diminués. Des cellules de poumons ou de ganglions bronchiques prélevées sur des souris traitées injectées dans des souris asthmatiques améliorent les symptômes de l'asthme. Ces cellules pourraient donc avoir un rôle régulateur dans l'asthme. Les caractériser et les étudier afin d'être capable de les générer est crucial pour les futures thérapies de l'asthme.

Développement d'une puce à ADN métabolique et application à l'étude d'un modèle murin d'obésité et de diabète de type II

Résumé tout public : Le développement du diabète de type II et de l'obésité est causé par l'interaction entre des gènes de susceptibilité et des facteurs environnementaux, en particulier une alimentation riche en calories et une activité physique insuffisante. Afín d'évaluer le rôle de l'alimentation en absence d'hétérogénéité génétique, nous avons nourri une lignée de souris génétiquement pure avec un régime extrêmement gras. Ce régime a conduit à l'établissement de différents phénotypes parmi ces souris, soit : un diabète et une obésité (ObD), un diabète mais pas d'obésité (LD) ou ni un diabète, ni une obésité (LnD). Nous avons fait l'hypothèse que ces adaptations différentes au stress nutritionnel induit par le régime gras étaient dues à l'établissement de programmes génétiques différents dans les principaux organes impliqués dans le maintien de l'équilibre énergétique. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons développé une puce à ADN contenant approximativement 700 gènes du métabolisme. Cette puce à ADN, en rendant possible la mesure simultanée de l'expression de nombreux gènes, nous a permis d'établir les profils d'expression des gènes caractéristiques de chaque groupe de souris nourries avec le régime gras, dans le foie et le muscle squelettique. Les données que nous avons obtenues à partir de ces profils d'expression ont montré que des changements d'expression marqués se produisaient dans le foie et le muscle entre les différents groupes de souris nourries avec le régime gras. Dans l'ensemble, ces changements suggèrent que l'établissement du diabète de type II et de l'obésité induits par un régime gras est associé à une synthèse accrue de lipides par le foie et à un flux augmenté de lipides du foie jusqu'à la périphérie (muscles squelettiques). Dans un deuxième temps, ces profils d'expression des gènes ont été utilisés pour sélectionner un sous-ensemble de gènes suffisamment discriminants pour pouvoir distinguer entre les différents phénotypes. Ce sous-ensemble de gènes nous a permis de construire un classificateur phénotypique capable de prédire avec une précision relativement élevée le phénotype des souris. Dans le futur, de tels « prédicteurs » basés sur l'expression des gènes pourraient servir d'outils pour le diagnostic de pathologies liées au métabolisme. Summary: Aetiology of obesity and type II diabetes is multifactorial, involving both genetic and environmental factors, such as calory-rich diets or lack of exercice. Genetically homogenous C57BL/6J mice fed a high fat diet (HFD) up to nine months develop differential adaptation, becoming either obese and diabetic (ObD) or remaining lean in the presence (LD) or absence (LnD) of diabetes development. Each phenotype is associated with diverse metabolic alterations, which may result from diverse molecular adaptations of key organs involved in the control of energy homeostasis. In this study, we evaluated if specific patterns of gene expression could be associated with each different phenotype of HFD mice in the liver and the skeletal muscles. To perform this, we constructed a metabolic cDNA microarray containing approximately 700 cDNA representing genes involved in the main metabolic pathways of energy homeostasis. Our data indicate that the development of diet-induced obesity and type II diabetes is linked to some defects in lipid metabolism, involving a preserved hepatic lipogenesis and increased levels of very low density lipoproteins (VLDL). In skeletal muscles, an increase in fatty acids uptake, as suggested by the increased expression of lipoprotein lipase, would contribute to the increased level of insulin resistance observed in the ObD mice. Conversely, both groups of lean mice showed a reduced expression in lipogenic genes, particularly stearoyl-CoA desaturase 1 (Scd-1), a gene linked to sensitivity to diet-induced obesity. Secondly, we identified a subset of genes from expression profiles that classified with relative accuracy the different groups of mice. Such classifiers may be used in the future as diagnostic tools of each metabolic state in each tissue. Résumé Développement d'une puce à ADN métabolique et application à l'étude d'un modèle murin d'obésité et de diabète de type II L'étiologie de l'obésité et du diabète de type II est multifactorielle, impliquant à la fois des facteurs génétiques et environnementaux, tels que des régimes riches en calories ou un manque d'exercice physique. Des souris génétiquement homogènes C57BL/6J nourries avec un régime extrêmement gras (HFD) pendant 9 mois développent une adaptation métabolique différentielle, soit en devenant obèses et diabétiques (ObD), soit en restant minces en présence (LD) ou en absence (LnD) d'un diabète. Chaque phénotype est associé à diverses altérations métaboliques, qui pourraient résulter de diverses adaptations moléculaires des organes impliqués dans le contrôle de l'homéostasie énergétique. Dans cette étude, nous avons évalué si des profils d'expression des gènes dans le foie et le muscle squelettique pouvaient être associés à chacun des phénotypes de souris HFD. Dans ce but, nous avons développé une puce à ADN métabolique contenant approximativement 700 ADNc représentant des gènes impliqués dans les différentes voies métaboliques de l'homéostasie énergétique. Nos données indiquent que le développement de l'obésité et du diabète de type II induit par un régime gras est associé à certains défauts du métabolisme lipidique, impliquant une lipogenèse hépatique préservée et des niveaux de lipoprotéines de très faible densité (VLDL) augmentés. Au niveau du muscle squelettique, une augmentation du captage des acides gras, suggéré par l'expression augmentée de la lipoprotéine lipase, contribuerait à expliquer la résistance à l'insuline plus marquée observée chez les souris ObD. Au contraire, les souris minces ont montré une réduction marquée de l'expression des gènes lipogéniques, en particulier de la stéaroyl-CoA désaturase 1 (scd-1), un gène associé à la sensibilité au développement de l'obésité par un régime gras. Dans un deuxième temps, nous avons identifié un sous-ensemble de gènes à partir des profils d'expression, qui permettent de classifier avec une précision relativement élevée les différents groupes de souris. De tels classificateurs pourraient être utilisés dans le futur comme outils pour le diagnostic de l'état métabolique d'un tissu donné.

Role of myosin V in actin cable organization in fission yeast

Functional specialization is tightly linked to the ability of eukaryotic cells to acquire a particular shape. Cell morphogenesis, in turn, relies on the capacity to establish and maintain cell "polarity", which is achieved by orienting the trafficking of signaling molecules and organelles towards specific cellular locations and/or membrane domains. The "oriented" transport is based upon cytoskeletal polymers, microtubules and actin filaments, which serve as tracks for molecular motors. These latter generate motion that is translated either into pulling forces or directed transport. Fission yeast, a rod-like unicellular eukaryote, shapes itself by restricting growth at cell tips through the concerted activity of microtubules and actin cables. Microtubules, which assemble into 2-6 bundles and run parallel to the long axis of the cell, serve to orient growth to the tips. Growth is supported by the actin cytoskeleton, which provides tracks, the cables, for motor-based transport of secretory vesicles. The molecular motors, which bind cargos and deliver them to the tips along cables, are also known as type V myosins (hereafter indicated as myosin V). How the bundles of parallel actin filaments, i.e. the cables, extend from the tips through the cell and whether they serve any other purpose, besides providing tracks, is poorly understood. It is also unclear how the crosstalk between the two cytoskeletal systems is achieved. These are the basic questions I addressed during my PhD. The first part of the thesis work (Chapter two) suggests that the sole function of actin cables in polarized growth is to serve as tracks for motors. The data indicate that cells may have evolved two cytoskeletal systems to provide robustness to the polarization process but in principle a unique cytoskeleton might have been able to direct and support polarized growth. How actin cables are organized within the cell to optimize cargo transport is addressed later on (Chapter three). The major finding, based on the actin cable defect of cells lacking myosin Vs, is that actin filaments self-organize through the activity of the transport motors. In fact, by delivering cargos to cell tips and exerting physical pulling forces on actin filaments, Myosin Vs contribute not only to polarize cargo transport but also actin tracks. Among the cargos transported by Myosin V, which may be relevant to its function in organizing cables, there is likely the endoplasmic reticulum (ER). Actin cables, which run parallel to cortical ER, may serve as tracks for Myosin V. Myosin V-driven displacement, in turn, may account for the dynamic expansion and organization of ER during polarized growth as suggested in Chapter four. The last part of the work (Chapter five) highlights the existence of a crosstalk between actin and microtubules. In absence of myosin V, indeed, microtubules contribute to actin cable organization, likely playing a scaffolding/tethering function. Whether or not the kinesin 1, Klp3, plays any role in such process has to be demonstrated. In conclusion the work proposes a novel role for myosin Vs in actin organization, besides its transport function, and provides molecular tools to further dissect the role of this type of myosin in fission yeast. - La spécialisation fonctionnelle est étroitement connectée à la capacité des cellules eucaryotes d'acquérir une forme particulière. La morphogenèse cellulaire à son tour, est basée sur la capacité d'établir et de maintenir la polarité cellulaire, polarité réalisée en orientant le trafic des molécules signales et des organelles vers des zones cellulaires spécifiques. Ce transport directionnel dépend des polymères du cytosquelette, microtubules et microfilaments, qui servent comme des voies pour les moteurs moléculaires. Ces derniers engendrent du mouvement, traduit soit en force de traction soit en transport directionnel. La levure fissipare, un eucaryote unicellulaire en forme de bâtonnet, acquière sa forme en limitant sa croissance aux extrémités par l'action concertée des microtubules et de l'actine. Les microtubules, qui s'assemblent de façon antiparallèle et parcourent la cellule parallèlement à l'axe longitudinal, servent à orienter la croissance aux extrémités. Cette croissance est permise par le cytosquelette d'actine, fournissant des voies, les câbles, pour le transport actif des vésicules de sécrétion. Les moteurs moléculaires, responsables de ce transport actif sont aussi appelés myosines de type V (par la suite appelés myosines V). La manière dont ces câbles s'étendent depuis l'extrémité jusqu'à l'intérieur de la cellule est peu connue. De plus, on ignore également si ces câbles présentent une fonction autre que le transport. L'interaction entre les deux cytosquelettes est également obscure. Ce sont ces questions de base auxquelles j'ai tenté de répondre lors de ma thèse. La première partie de cette thèse (chapitre II) suggère que les câbles d'actine, pendant la croissance polarisée, fonctionnent uniquement comme des voies pour les moteurs moléculaires. Les données indiqueraient que les cellules ont fait évoluer deux systèmes de cytosquelette pour assurer plus de robustesse au processus de polarisation, bien que, comme nous le verrons, un système unique est suffisant. Au chapitre III, nous verrons comment les câbles d'actine sont organisés à l'intérieur de la cellule afin d'optimiser le transport des cargo. La découverte majeure, réalisée en observant des cellules dont la myosine V fait défaut, est que ces filaments d'actine s'auto organisent grâce au passage des moteurs moléculaires le long de ces voies. En réalité, en délivrant les cargos aux extrémités de la cellule et en exerçant des forces de traction sur les câbles, les myosines V contribuent non seulement à polariser le transport mais également à polariser les voies elles mêmes. Nous verrons également au chapitre IV, que parmi les cargos importants pour l'organisation des câbles, il y aurait le réticulum endoplasmique (RE). En effet, les câbles d'actine, qui s'étalent parallèlement au RE cortical, pourraient servir comme voie pour la myosine V. Cette dernière en retour pourrait être responsable de l'expansion dynamique et de l'organisation du RE pendant la croissance polarisée.

Long-term cerebral plasticity-related gene expression : a study of the respective role of CBP and CRTC1 in CREB transcriptional activation

1.1 AbstractThe treatment of memory disorders and cognitive deficits in various forms of mental retardation may greatly benefit from a better understanding of the molecular and cellular mechanisms of memory formation. Different forms of memory have distinct molecular requirements.Short-term memory (STM) is thought to be mediated by covalent modifications of existing synaptic molecules, such as phosphorylation or dephosphorylation of enzymes, receptors or ion channels. In contrast, long-term memoiy (LTM) is thought to be mediated by growth of new synapses and restructuring of existing synapses. There is extensive evidence that changes in gene expression and de novo protein synthesis are key processes for LTM formation. In this context, the transcription factor CREB (cAMP-response element-binding protein) was shown to be crucial. Activation of CREB requires phosphorylation of a serine residue (Ser-133), and the subsequent recruitment of a coactivator called CREB-binding protein (CBP). Moreover, we have recently shown that another coactivator called CREB Regulated Transcription Coactivator 1 (CRTC1) functions as a calcium- and cAMP-sensitive coincidence detector in neurons, and is involved in hippocampal long-term synaptic plasticity. Given the importance of cAMP and calcium signaling for plasticity-related gene expression in neurons and in astrocytes, we sought to determine the respective involvement of the CREB coactivators CBP and CRTC1 in CREB-mediated transcription.We developed various strategies to selectively interfere with these CREB coactivators in mouse primary neurons and in astrocytes in vitro. However, despite several pieces of evidence implicating CBP and/or CRTC1 in the regulation of neuronal plasticity genes, we could not clearly determine the respective requirement of these coactivators for the activation of these genes. Nevertheless, we showed that calcineurin activity, which is important for CRTC1 nuclear translocation, is necessary for the expression of some CREB-regulated plasticity genes. We associated this phenomena to physiopathological conditions observed in Down's syndrome. In addition, we demonstrated that in astrocytes, noradrenaline stimulates CREB-target gene expression through β-adrenergic receptor activation, intracellular cAMP pathway activation, and CRTC-induced CREB transactivation.Defining the respective role of CREB and its coactivators CBP and CRTC1 in neuronal and astrocytic cultures in vitro sets the stage for future in vivo studies and for the possible development of new therapeutic strategies to improve the treatment of memoiy and cognitive disorders.1.2 RésuméUne meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la formation de la mémoire pourrait grandement améliorer le traitement des troubles de la mémoire ainsi que des déficits cognitifs observés dans différentes formes de pathologies psychiatriques telles que le retard mental. Les différentes formes de mémoire dépendent de processus moléculaires différents.La mémoire à court terme (STM) semble prendre forme suite à des modifications covalentes de molécules synaptiques préexistantes, telles que la phosphorylation ou la déphosphorylation d'enzymes, de récepteurs ou de canaux ioniques. En revanche, la mémoire à long terme (LTM) semble être due à la génération de nouvelles synapses et à la restructuration des synapses existantes. De nombreuses études ont permis de démontrer que les changements dans l'expression des gènes et la synthèse de protéine de novo sont des processus clés pour la formation de la LTM. Dans ce contexte, le facteur de transcription CREB (cAMP-response element-binding protein) s'est avéré être un élément crucial. L'activation de CREB nécessite la phosphorylation d'un résidu sérine (Ser-133), et le recrutement d'un coactivateur nommé CBP (CREB binding protein). En outre, nous avons récemment démontré qu'un autre coactivateur de CREB nommé CRTC1 (CREB Regulated Transcription Coactivator 1) agit comme un détecteur de coïncidence de l'AMP cyclique (AMPc) et du calcium dans les neurones et qu'il est impliqué dans la formation de la plasticité synaptique à long terme dans l'hippocampe. Etant donné l'importance des voies de l'AMPc et du calcium dans l'expression des gènes impliqués dans la plasticité cérébrale, nous voulions déterminer le rôle respectif des coactivateurs de CREB, CBP et CRTC1.Nous avons développé diverses stratégies pour interférer de façon sélective avec les coactivateurs de CREB dans les neurones et dans les astrocytes chez la souris in vitro. Nos résultats indiquent que CBP et CRTC1 sont tous deux impliqués dans la transcription dépendante de CREB induite par l'AMPc et le calcium dans les neurones. Cependant, malgré plusieurs évidences impliquant CBP et/ou CRTC1 dans l'expression de gènes de plasticité neuronale, nous n'avons pas pu déterminer clairement leur nécessité respective pour l'activation de ces gènes. Toutefois, nous avons montré que l'activité de la calcineurine, dont dépend la translocation nucléaire de CRTC1, est nécessaire à l'expression de certains de ces gènes. Nous avons pu associer ce phénomène à une condition physiopathologique observée dans le syndrome de Down. Nous avons également montré que dans les astrocytes, la noradrénaline stimule l'expression de gènes cibles de CREB par une activation des récepteurs β- adrénergiques, l'activation de la voie de l'AMPc et la transactivation de CREB par les CRTCs.Définir le rôle respectif de CREB et de ses coactivateurs CBP et CRTC1 dans les neurones et dans les astrocytes in vitro permettra d'acquérir les connaissances nécessaires à de futures études in vivo et, à plus long terme d'éventuellement développer des stratégies thérapeutiques pour améliorer les traitements des troubles cognitifs.

Hypoxie-ischémie cérébrale néonatale : rôle de la voie de JNK et implication de l'autophagie dans la mort neuronale

Résumé : Malgré les immenses progrès réalisés depuis plusieurs années en médecine obstétricale ainsi qu'en réanimation néonatale et en recherche expérimentale, l'asphyxie périnatale, une situation de manque d'oxygène autour du moment de la naissance, reste une cause majeure de mortalité et de morbidité neurologique à long terme chez l'enfant (retard mental, paralysie cérébrale, épilepsie, problèmes d'apprentissages) sans toutefois de traitement pharmacologique réel. La nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les complications de l'asphyxie périnatale est donc aujourd'hui encore essentielle. Le but général de ce travail est l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans des mécanismes moléculaires pathologiques induits par l'hypoxie-ischémie (HI) dans le cerveau immature. Pour cela, le modèle d'asphyxie périnatale (proche du terme) le plus reconnu chez le rongeur a été développé (modèle de Rice et Vannucci). Il consiste en la ligature permanente d'une artère carotide commune (ischémie) chez le raton de 7 jours combinée à une période d'hypoxie à 8% d'oxygène. Il permet ainsi d'étudier les lésions de type hypoxique-ischémique dans différentes régions cérébrales dont le cortex, l'hippocampe, le striatum et le thalamus. La première partie de ce travail a abordé le rôle de deux voies de MAPK, JNK et p38, après HI néonatale chez le raton à l'aide de peptides inhibiteurs. Tout d'abord, nous avons démontré que D-JNKI1, un peptide inhibiteur de la voie de JNK présentant de fortes propriétés neuroprotectrices dans des modèles d'ischémie cérébrale adulte ainsi que chez le jeune raton, peut intervenir sur différentes voies de mort dont l'activation des calpaïnes (marqueur de la nécrose précoce), l'activation de la caspase-3 (marqueur de l'apoptose) et l'expression de LC3-II (marqueur de macroautophagie). Malgré ces effets positifs le traitement au D-JNKI1 ne modifie pas l'étendue de la lésion cérébrale. L'action limitée de D-JNKI1 peut s'expliquer par une implication modérée des JNKs (faiblement activées et principalement l'isotype JNK3) après HI néonatale sévère. Au contraire, l'inhibition de la voie de nNOS/p38 par le peptide DTAT-GESV permet une augmentation de 20% du volume du tissu sain à court et long terme. Le second projet a étudié les effets de l'HI néonatale sur l'autophagie neuronale. En effet, l'autophagie est un processus catabolique essentiel au bien-être de la cellule. Le type principal d'autophagie (« macroautophagie » , que nous appellerons par la suite « autophagie ») consiste en la séquestration d'éléments à dégrader (protéines ou organelles déficients) dans un compartiment spécialisé, l'autophagosome, qui fusionne avec un lysosome pour former un autolysosome où le contenu est dégradé par les hydrolases lysosomales. Depuis peu, l'excès ou la dérégulation de l'autoptiagie a pu être impliqué dans la mort cellulaire en certaines conditions de stress. Ce travail démontre que l'HI néonatale chez le raton active fortement le flux autophagique, c'est-à-dire augmente la formation des autophagosomes et des autolysosomes, dans les neurones en souffrance. De plus, la relation entre l'autophagie et l'apoptose varie selon la région cérébrale. En effet, alors que dans le cortex les neurones en voie de mort présentent des caractéristiques mixtes apoptotiques et autophagiques, ceux du CA3 sont essentiellement autophagiques et ceux du CA1 sont principalement apoptotiques. L'induction de l'autophagie après HI néonatale semble donc participer à la mort neuronale soit par l'enclenchement de l'apoptose soit comme mécanisme de mort en soi. Afin de comprendre la relation pouvant exister entre autophagie et apoptase un troisième projet a été réalisé sur des cultures primaires de neurones corticaux exposés à un stimulus apoptotique classique, la staurosporine (STS). Nous avons démontré que l'apoptose induite par la STS était précédée et accompagnée par une forte activation du flux autophagique neuronal. L'inhibition de l'autophagie de manière pharmacologique (3-MA) ou plus spécifiquement par ARNs d'interférence dirigés contre deux protéines autophagiques importantes (Atg7 et Atg5) a permis de mettre en évidence des rôles multiples de l'autophagie dans la mort neuronale. En effet, l'autophagie prend non seulement part à une voie de mort parallèle à l'apoptose pouvant être impliquée dans l'activation des calpaïnes, mais est également partiellement responsable de l'induction des voies apoptotiques (activation de la caspase-3 et translocation nucléaire d'AIF). En conclusion, ce travail a montré que l'inhibition de JNK par D-JNKI1 n'est pas un outil neuroprotecteur efficace pour diminuer la mort neuronale provoquée par l'asphyxie périnatalé sévère, et met en lumière deux autres voies thérapeutiques beaucoup plus prometteuses, l'inhibition de nNOS/p38 ou de l'autophagie. ABSTRACT : Despite enormous progress over the last«decades in obstetrical and neonatal medicine and experimental research, perinatal asphyxia, a situation of lack of oxygen around the time of the birth, remains a major cause of mortality and long term neurological morbidity in children (mental retardation, cerebral palsy, epilepsy, learning difficulties) without any effective treatment. It is therefore essential to develop new therapeutic strategies for the complications of perinatal asphyxia. The overall aim of this work was to identify new therapeutic targets involved in pathological molecular mechanisms induced by hypoxia-ischemia (HI) in the immature brain. For this purpose, the most relevant model of perinatal asphyxia (near term) in rodents has been developed (model of Rice and Vannucci). It consists in the permanent ligation of one common carotid artery (ischemia) in the 7-day-old rat combined with a period of hypoxia at 8% oxygen. This model allows the study of the hypoxic-ischemic lesion in different brain regions including the cortex, hippocampus, striatum and thalamus. The first part of this work addressed the role of two MAPK pathways (JNK and p38) after rat neonatal HI using inhibitory peptides. First, we demonstrated that D-JNKI1, a JNK peptide inhibitor presenting strong neuroprotective properties in models of cerebral ischemia in adult and young rats, could affect different cell death mechanisms including the activation of calpain (a marker of necrosis) and caspase-3 (a marker of apoptosis), and the expression of LC3-II (a marker of macroautophagy). Despite these positive effects, D-JNKI1 did not modify the extent of brain damage. The limited action of D-JNKI1 can be explained by the fact that JNKs were only moderately involved (weakly activated and principally the JNK3 isotype) after severe neonatal HI. In contrast, inhibition of nNOS/p38 by the peptide D-TAT-GESV increased the surviving tissue volume by around 20% at short and long term. The second project investigated the effects of neonatal HI on neuronal autophagy. Indeed, autophagy is a catabolic process essential to the well-being of the cell. The principal type of autophagy ("macroautophagy", that we shall henceforth call "autophagy") involves the sequestration of elements to be degraded (deficient proteins or organelles) in a specialized compartment, the autophagosome, which fuses with a lysosome to form an autolysosome where the content is degraded by lysosomal hydrolases. Recently, an excess or deregulation of autophagy has been implicated in cell death in some stress conditions. The present study demonstrated that rat neonatal HI highly enhanced autophagic flux, i.e. increased autophagosome and autolysosome formation, in stressed neurons. Moreover, the relationship between autophagy and apoptosis varies according to the brain region. Indeed, whereas dying neurons in the cortex exhibited mixed features of apoptosis and autophagy, those in CA3 were primarily autophagíc and those in CA1 were mainly apoptotic. The induction of autophagy after neonatal HI seems to participate in neuronal death either by triggering apoptosis or as a death mechanism per se. To understand the relationships that may exist between autophagy and apoptosis, a third project has been conducted using primary cortical neuronal cultures exposed to a classical apoptotic stimulus, staurosporine (STS). We demonstrated that STS-induced apoptosis was preceded and accompanied by a strong activation of neuronal autophagic flux. Inhibition of autophagy pharmacologically (3-MA) or more specifically by RNA interference directed against two important autophagic proteins (Atg7 and AtgS) showed multiple roles of autophagy in neuronal death. Indeed, autophagy was not only involved in a death pathway parallel to apoptosis possibly involved in the activation of calpains, but was also partially responsible for the induction of apoptotic pathways (caspase-3 activation and AIF nuclear translocation). In conclusion, this study showed that JNK inhibition by D-JNKI1 is not an effective neuroprotective tool for decreasing neuronal death following severe perinatal asphyxia, but highlighted two more promising therapeutic approaches, inhibition of the nNOSlp38 pathway or of autophagy.

Multiscale phylogeography: glacial history and autopolyploidy of Biscutella laevigata L. (Brassicaceae) in the Western Alps

Résumé Les changements climatiques du Quaternaire ont eu une influence majeure sur la distribution et l'évolution des biota septentrionaux. Les Alpes offrent un cadre spatio-temporel bien étudié pour comprendre la réactivité de la flore et le potentiel d'adaptation d'une espèce végétale face aux changements climatiques. Certaines hypothèses postulent une diversification des espèces en raison de la disparition complète de la flore des Alpes et d'un isolement important des espèces dans des refuges méridionaux durant les dernières glaciations (Tabula Rasa). Une autre hypothèse stipule le maintien de poches de résistance pour la végétation au coeur des Alpes (Nunataks). Comme de nombreuses espèces végétales présentant un grand succès écologique semblent avoir réagi aux glaciations par la multiplication de leur génome (autopolyploïdie), leur étude en milieu naturel devrait permettre de comprendre les avantages inhérents à la polyploïdie. Biscutella laevigata est un modèle emblématique de biogéographie historique, diverses études ayant montré que des populations diploïdes sont actuellement isolées dans les zones restées déglacées durant le dernier maximum glaciaire, alors que des tétraploïdes ont recolonisé l'ensemble des zones alpines mises à nu par le retrait des glaciers. Si le contexte périglaciaire semble avoir favorisé ce jeune complexe autopolyploïde, les circonstances et les avantages de cette mutation génomique ne sont pas encore clairs. Y a-t-il eu de multiples événements de polyploïdisation ? Dans quelle mesure affecte(nt)il(s) la diversité génétique et le potentiel évolutif des polyploïdes ? Les polyploïdes ont-ils une grande flexibilité génomique, favorisant une radiation adaptative, ou doivent-ils leur succès à une grande plasticité écologique ? Cette étude aborde ces questions à différentes échelles spatiales et temporelles. L'échelle régionale des Alpes occidentales permet d'aborder les facteurs distaux (aspects historiques), alors que l'échelle locale cherche à appréhender les facteurs proximaux (mécanismes évolutifs). Dans les Alpes occidentales, des populations ont été densément échantillonnées et étudiées grâce à (1) leur cytotype, (2) leur appartenance taxonomique, (3) leur habitat et (4) des marqueurs moléculaires de l'ADN chloroplastique, en vue d'établir leurs affinités évolutives. Á l'échelle locale, deux systèmes de population ont été étudiés : l'un où les populations persistent en périphérie de l'aire de distribution et l'autre au niveau du front actif de colonisation, en marge altitudinale. Les résultats à l'échelle des Alpes occidentales révèlent les sites d'intérêt (refuges glaciaires, principales barrières et voies de recolonisation) pour une espèce représentative des pelouses alpines, ainsi que pour la biodiversité régionale. Les Préalpes ont joué un rôle important dans le maintien de populations à proximité immédiate des Alpes centrales et dans l'évolution du taxon, voire de la végétation. Il est aussi démontré que l'époque glaciaire a favorisé l'autopolyploïdie polytopique et la recolonisation des Alpes occidentales par des lignées distinctes qui s'hybrident au centre des Alpes, influençant fortement leur diversité génétique et leur potentiel évolutif. L'analyse de populations locales en situations contrastées à l'aide de marqueurs AFLP montre qu'au sein d'une lignée présentant une grande expansion, la diversité génétique est façonnée par des forces évolutives différentes selon le contexte écologique et historique. Les populations persistant présentent une dispersion des gènes restreinte, engendrant une diversité génétique assez faible, mais semblent adaptées aux conditions locales de l'environnement. À l'inverse, les populations colonisant la marge altitudinale sont influencées par les effets de fondation conjugués à une importante dispersion des gènes et, si ces processus impliquent une grande diversité génétique, ils engendrent une répartition aléatoire des génotypes dans l'environnement. Les autopolyploïdes apparaissent ainsi comme capables de persister face aux changements climatiques grâce à certaines facultés d'adaptation locale et de grandes capacités à maintenir une importante diversité génétique lors de la recolonisation post-glaciaire. Summary The extreme climate changes of the Quaternary have had a major influence on species distribution and evolution. The European Alps offer a great framework to investigate flora reactivity and the adaptive potential of species under changing climate. Some hypotheses postulate diversification due to vegetation removal and important isolation in southern refugia (Tabula Rasa), while others explain phylogeographic patterns by the survival of species in favourable Nunataks within the Alps. Since numerous species have successfully reacted to past climate changes by genome multiplication (autopolyploidy), studies of such taxa in natural conditions is likely to explain the ecological success and the advantages of autopolyploidy. Early cytogeographical surveys of Biscutella laevigata have shed light on the links between autopolyploidy and glaciations by indicating that diploids are now spatially isolated in never-glaciated areas, while autotetraploids have recolonised the zones covered by glaciers- during the last glacial maximum. A periglacial context apparently favoured this young autopolyploid complex but the circumstances and the advantages of this genomic mutation remain unclear. What is the glacial history of the B. laevigata autopolyploid complex? Are there multiple events of polyploidisation? To what extent do they affect the genetic diversity and the evolutionary potential of polyploids? Is recolonisation associated with adaptive processes? How does long-term persistence affect genetic diversity? The present study addresses these questions at different spatiotemporal scales. A regional survey at the Western Alps-scale tackles distal factors (evolutionary history), while local-scale studies explore proximal factors (evolutionary mechanisms). In the Western Alps, populations have been densely sampled and studied from the (1) cytotypic, (2) morphotaxonomic, (3) habitat point of views, as well as (4) plastid DNA molecular markers, in order to infer their relationships and establish the maternal lineages phylogeography. At the local scale, populations persisting at the rear edge and populations recolonising the attitudinal margin at the leading edge have been studied by AFLPs to show how genetic diversity is shaped by different evolutionary forces across the species range. The results at the regional scale document the glacial history of a widespread species, representative of alpine meadows, in a regional area of main interest (glacial refugia, main barriers and recolonisation routes) and points out to sites of interest for regional biodiversity. The external Alps have played a major role in the maintenance of populations near the central Alps during the Last Glacial Maximum and influenced the evolution of the species, and of vegetation. Polytopic autopolyploidy in different biogeographic districts is also demonstrated. The species has had an important and rapid radiation because recolonisation took place from different refugia. The subsequent recolonisation of the Western Alps was achieved by independent lineages that are presently admixing in the central Alps. The role of the Pennic summit line is underlined as a great barrier that was permeable only through certain favourable high-altitude passes. The central Alps are thus viewed as an important crossroad where genomes with different evolutionary histories are meeting and admixing. The AFLP analysis and comparison of local populations growing in contrasted ecological and historical situations indicate that populations persisting in the external Alps present restricted gene dispersal and low genetic diversity but seem in equilibrium with their environment. On the contrary, populations colonising the attitudinal margin are mainly influenced by founder effects together with great gene dispersal and genotypes have a nearly random distribution, suggesting that recolonisation is not associated with adaptive processes. Autopolyploids that locally persist against climate changes thus seem to present adaptive ability, while those that actively recolonise the Alps are successful because of their great capacity to maintain a high genetic diversity against founder effects during recolonisation.

A CRTC1 deficient mouse line study : relevance to mood disorders

Summary Mood disorders are among the most prevalent, psychosocial^ debilitating, chronic and relapsing forms of psychiatric illnesses. Despite considerable advances in their characterization, the heterogeneous nature of susceptibility factors and patient's symptoms could account for the lack of totally effective and remissive treatment. The neurobiological hypothesis of mood disorders etiology has evolved since the monoamine and neurotrophin theories and current evidence is pointing toward their integration in a broader polygenic epistatic model resulting in defective neuroplasticity of circuitries involved in emotion processing. Consequently, the unraveling of molecular underpinning pathways involved in neuronal plasticity, commonly altered among mood disorder syndromes and symptoms, should shed light on their etiology and provide new drug target. The transcription factor CREB has been critically involved in the long-lasting forms of neuronal plasticity and in the regulation of several mood disorders susceptibility genes. In addition, altered CREB activity has been associated with mood disorders pathophysiology and pharmacotherapy. Interestingly, the newly-identified protein CREB-regulated transcription coactivator 1 (CRTC1) was shown by previous studies in the laboratory to be a neuroactivity- dependent cAMP and calcium sensor, a potent activator of CREB-dependent transcription and involved in neuroplasticity mechanisms associated with long-term synaptic potentiation. Furthermore, the major mood disorder susceptibility gene Bdnf was suggested to be transcriptional regulated by CRTC1. Therefore, we aimed to investigate a role for CRTC1 in mood disorders by generating and characterizing a Crtcl deficient mouse model at the behavioral and molecular levels. Interestingly, their comprehensive characterization revealed a behavioral profile mirroring several major symptoms comorbid in mood disorders, including altered social interactions, aggressive behaviors, obesity, psychomotor retardation, increased emotional response to stress, decreased sexual drive and depression-like behaviors. To investigate the molecular mechanisms underlying these pathological behaviors and the implication of CRTC1 in the regulation of CREB-regulated genes in vivo, we also quantified transcript levels of several relevant CREB-regulated susceptibility genes in brain structures involved in the pathophysiology of mood disorders. Strikingly, we found the underexpression of primary components of the neurotrophin system: Bdnf and its cognate receptor TrkB, a marked decrease in the Nr4a family of transcription factors, implicated in neuroplasticity and associated with dopamine-related disorders, as well as in several other relevant CREB regulated genes. Moreover, neurochemical analysis revealed that Crtcl null mice presented alteration in prefrontal cortical monoamine turnover as well as in hippocampal and accumbal serotonin levels, similarly associated with mood disorders etiology and pharmacotherapy. Together, the present thesis supports the involvement of CRTC1 pathway hypofunction in the pathogenesis of mood disorders and specifically in pathological aggression, obesity and depression-related behavior comorbidities. Ultimately, CRTC1 may represent an interesting antidepressant, antiaggressive or mood stabilizer drug target candidate through the modulation of major CREB regulated susceptibility genes. Les troubles de l'humeur comptent parmi les maladies psychiatriques les plus prévalentes, psychosocialement débilitantes, chroniques et avec le plus grand risque de rechute. Malgré de considérable avancées dans leur caractérisation, la nature hétérogène des facteurs de susceptibilité et des symptômes présentés par les patients, semble justifier l'absence de traitement entraînant une rémission complète de la maladie. L'hypothèse de l'étiologie neurobiologique des troubles de l'humeur a évolué depuis la théorie des monoamines et des neurotrophines. Actuellement, elle tend à les englober dans un modèle polygénique épistatique induisant une déficience de la neuroplasticité des circuits impliqué dans la régulation des émotions. Par conséquent, il apparaît particulièrement relevant de caractériser des voies moléculaires impliquées dans la plasticité neuronale, communément altérées parmi les différents syndromes et symptômes des maladies de l'humeur, afin d'améliorer leur compréhension ainsi que de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Le facteur de transcription CREB a été de façon répétée et cohérente impliqué dans les mécanismes à long terme de la plasticité neuronale, ainsi que dans la régulation de plusieurs gènes de susceptibilité aux maladies de l'humeur. De plus, une altération dans l'activité de CREB a été impliqué dans leur étiologie et pharmacothérapie. De façon intéressante, des résultats préliminaires sur la protéine récemment découverte CREB-regulated transcription coactivator 1 (CRTC1) ont indiqué que son activation était dépendante de l'activité neuronale, qu'il était un senseur du calcium et de l'AMPc, ainsi qu'un coactivateur de CREB requis et puissant impliqué dans les mécanismes de plasticité neuronale associés à la potentialisation à long terme. En outre, des résultats ont suggéré que le gène majeur de susceptibilité Bdnf est régulé par CRTC1. Ainsi, notre objectif a été d'investiguer un rôle éventuel de CRTC1 dans les maladies de l'humeur en générant et caractérisant une lignée de souris déficiente pour Crtcl, tant au niveau comportemental que moléculaire. De façon intéressante, leur caractérisation détaillée a révélé un profil comportemental reflétant de nombreux aspects des maladies de l'humeur incluant une altération des interactions sociales, une agression pathologique, l'obésité, un retard psychomoteur, une réponse émotionnelle au stress accrue, une diminution de la motivation sexuelle, et des comportements reliés à la dépression. Afin d'investiguer les mécanismes moléculaires sous- jacents cette altération du comportement, ainsi que l'implication de CRTC1 dans l'expression des gènes régulés par CREB in vivo, nous avons quantifié les niveaux de transcrits de plusieurs gènes de susceptibilité régulés par CREB et impliqués dans la physiopathologie des maladies de l'humeur. Remarquablement, nous avons trouvé la sous-expression de composants primordiaux du système neurotrophique: Bdnf et son récepteur TrkB, une diminution majeure de la famille des facteurs de transcription Nr4a, impliqués dans la neuroplasticité et associés à des désordres liés à la dopamine, ainsi que de nombreux autres gènes relevants régulés par CREB. De plus, une analyse neurochimique a révélé que les souris déficientes pour Crtcî présentent une altération du turn-over des monoamines du cortex préfrontal ainsi que des niveaux hippocampaux et accumbaux de sérotonine, associés de façon similaire dans l'étiologie et la pharmacothérapie des maladies de l'humeur. Vue dans son ensemble, la présente thèse supporte l'implication d'une sous-régulation de la voie de CRTCI dans la pathogenèse des maladies de l'humeur ainsi que dans la comorbidité de l'agression pathologique, l'obésité et la dépression. En conclusion, CRTCI pourrait représenter une cible médicamenteuse intéressante aux propriétés antidépressante, antiagressive ou stabilisatrice de l'humeur au travers de la modulation de gènes de susceptibilité majeurs régulés par CREB.

Hélium en réanimation : de la mécanique des fluides à la clinique

En raison de sa faible densité, l'hélium tend à favoriser la présence de conditions d'écoulement laminaires dans les voies aériennes, tout en diminuant la résistance à l'écoulement en conditions turbulentes. Cette propriété rend compte de son intérêt potentiel lors d'atteintes obstructives des voies aériennes supérieures ou inférieures. Plusieurs études ont démontré des effets cliniques et physiopathologiques favorables dans ces situations, tant en respiration spontanée qu'en ventilation mécanique, invasive ou non invasive. Pour l'heure, nous manquons d'études bien conduites démontrant que ces effets favorables s'accompagnent d'un impact bénéfique sur le devenir des patients. Dans cette attente, le recours de routine aux mélanges hélium-oxygène (He-O2) ne peut être préconisé et son utilisation doit être limitée à des situations cliniques individuelles avec des objectifs ciblés.

Protection of pancreatic beta-cells by high density lipoproteins

SUMMARYThe incidence of type 2 diabetes (T2D) is increasing worldwide and is linked to the enhancement of obesity. The principal cause of T2D development is insulin resistance, which lead to the increase of insulin production by the pancreatic beta-cells. In a pathological environment, namely dyslipidaemia, hyperglycaemia and inflammation, beta-cell compensation will fail in more vulnerable cells and diabetes will occur. High Density Lipoproteins (HDLs), commonly named "good cholesterol" are known to be atheroprotective. Low levels of HDLs are associated with increased prevalence of cardiovascular disease but are also an independent risk factor for the development of T2D. HDLs were demonstrated to protect pancreatic beta-cells against several stresses. However the molecular mechanisms of the protection are unknown and the objectives of this work were to try to elucidate the way how HDLs protect. The first approach was a broad screening of genes regulated by the stress and HDLs. A microarray analysis was performed on beta-cells stressed by serum deprivation and rescued by HDLs. Among the genes regulated, we focused on 4E-BP1, a cap-dependent translational inhibitor. In addition, HDLs were also found to protect against several other stresses.Endoplasmic reticulum (ER) stress is a mechanism that may play a role in the onset of T2D. The unfolded protein response (UPR) is a physiological process that aims at maintaining ER homeostasis in conditions where the protein folding and secretion is perturbed. Specific signalling pathways are involved in the increase of folding, export and degradation capacity of the ER. However, in case where the stress is prolonged, this mechanism turns to be pathological, by inducing cell death effector pathways, leading to beta-cell apoptosis. In our study, we discovered that HDLs were protective against ER stress induced by drugs and physiological stresses such as saturated free fatty acids. HDLs protected beta-cells by promoting ER homeostasis via the improvement of the folding and trafficking od proteins from the ER to the Golgi apparatus.Altogether our results suggest that HDLs are important for beta-cell function and survival, by protecting them from several stresses and acting on ER homeostasis. This suggests that attempt in keeping normal HDLs levels or function in patients is crucial to lessen the development of T2D.RÉSUMÉL'incidence du diabète de type 2 est en constante augmentation et est fortement liée à l'accroissement du taux d'obésité. La cause principale du diabète de type 2 est la résistance à l'insuline, qui entraîne une surproduction d'insuline par les cellules bêta pancréatiques. Dans un environnement pathologique associé à l'obésité (dyslipidémie, hyperglycémie et inflammation), les cellules bêta les plus vulnérables ne sont plus capables de compenser en augmentant leur production d'insuline, dysfonctionnent, ce qui conduit à leur mort par apoptose. Les lipoprotéines de hautes densités (HDLs), communément appelées (( bon cholestérol », sont connues pour leurs propriétés protectrices contre l'athérosclérose. Des niveaux bas de HDLs sanguins sont associés au risque de développer un diabète de type 2. Les HDLs ont également montré des propriétés protectrices contre divers stresses dans la cellule bêta. Cependant, les mécanismes de protection restent encore inconnus et l'objectif de ce travail a été d'investiguer les mécanismes moléculaires de protection des HDLs. La première approche choisie a été une étude du profil d'expression génique par puce à ADN afin d'identifier les gènes régulés par le stress et les HDLs. Parmi les gènes régulés, notre intérêt s'est porté sur 4E-BP1, un inhibiteur de la traduction coiffe- dépendante, dont l'induction par le stress était corrélée avec une augmentation de l'apoptose. Suite à cette étude, les HDLs ont également montrés un rôle protecteur contre d'autres stresses. Il s'agit particulièrement du stress du réticulum endoplasmique (RE), qui est un mécanisme qui semble jouer un rôle clé dans le développement du diabète. L'UPR (« Unfolded Protein Response ») est un processus physiologique tendant à maintenir l'homéostasie du réticulum endoplasmique, organelle prépondérante pour la fonction des cellules sécrétrices, notamment lorsqu'elle est soumise à des conditions extrêmes telles que des perturbations de la conformation tertiaire des protéines ou de la sécrétion. Dans ces cas, des voies de signalisation moléculaires sont activées, ce qui mène à l'exportation des protéines mal repliées, à leur dégradation et à l'augmentation de l'expression de chaperonnes capables d'améliorer le repliement des protéines mal formées. Toutefois, en cas de stress persistant, ce mécanisme de protection s'avère être pathologique. En induisant des voies de signalisation effectrices de l'apoptose, il conduit finalement au développement du diabète. Dans cette étude, nous avons démontré que les HDLs étaient capables de protéger la cellule bêta contre le stress du RE induits par des inhibiteurs (thapsigargine, tunicamycine) ou des stresses physiologiques tels que les acides gras libres. Les HDLs ont la capacité d'améliorer l'homéostasie du RE, notamment en favorisant le repliement et le transfert des protéines du RE à l'appareil de Golgi.En résumé, ces données suggèrent que les HDLs sont bénéfiques pour la survie des cellules bêta soumises à des stresses impliqués dans le développement du diabète, notamment en restaurant l'homéostasie du RE. Ces résultats conduisent à soutenir que le maintien des taux de cholestérol joue un rôle important dans la limitation de l'incidence du diabète.