The role of Toll-like Receptor (TLR) 9 in the development of a T-helper (Th)1/Th2 response in the murine model of infection with " Leishmania major "

1.1 SUMMARY The role of the non-specific innate immune system is as important as the elaboration of the adaptive immune system in the initiation of an immune response to pathogens. The role of the Toll-like receptors (TLRs) in the innate immune response to virus and bacterial pathogens is widely recognised, however, little is known about the role of TLRs in host defence against eukaryotic pathogens. Immunologic investigations on the marine model of infection with Leishmania major (L. major) have correlated the outcome of the disease with expansion of different subsets of CD4+ cells, designated Th1 and Th2. The resistance of C57BL/6, CBA and C3H/He mice is linked with an IL-12 driven Th1 response. In BALB/c mice the susceptibility correlates with an IL-4 driven Th2 response. The initial event promoting the development of a Th1 or Th2 response still remains elusive. Recently, the contribution of the TLR signalling pathway in the innate and acquired immune response to infection with the intracellular protozoan parasite L. major has been demonstrated. Thus, the purpose of this study is to determine whether TLRs may play a role in influencing the outcome of the infection by directing the development of a Th1 or a Th2 response during infection with L, major parasites, in resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice, respectively. We demonstrated that MyD88, the major TLR adaptor molecule is necessary for C57BL/6 to develop a resistant Th1 response following L. major infection. Our data show the essential role of MyD88 in the establishment of a protective Th1 response. We subsequently aimed to determine which TLRs may be involved in the protective response. Since TLR2 and TLR4 have shown to have a potential role for Leishmania recognition, we analysed the course of infection in TLR2 and TLR4 deficient mice on a C57BL/6 resistant background following L. major infection. Our results clearly demonstrate that TLR2 or TLR4 aze dispensable to control the outcome of the disease as the TLR2 and TLR4 knockout mice developed a protective Th1 response. With the aim of determining a potential TLR candidate important in the initiation of the Thl response, we assessed the mRNA expression of different TLRs (TLR1 to TLR9) using quantitative real-time RT-PCR at different time points during the first week of infection. The results clearly showed an upregulation of TLR7 and TLR9 mRNA expression during the early phase of infection in resistant C57BL/6 mice but not in susceptible BALB/c mice. To provide in vivo evidence for the role for, these TLRs in the outcome of cutaneous leishmaniasis, studies using TLR7 and TLR9 deficient mice on a resistant C57BL/6 background were performed. The TLR7 deficient mice developed a resistance phenotype that was comparable with C57BL/6 wild type mice. Thus, the presence of TLR7 is not indispensable for the development of a Th1 response and resistance to infection. On the contrary, TLR9 deficient mice on the C57BL/6 resistant background showed high variability in the outcome of the disease. Although some mice behave as resistant C57BL/6 mice, half of them developed high lesion following infection and showed a decrease in IFN-γ production and an increase in IL-4 as compared to wild type mice. These results suggest that TLR9 may be involved in the control of infection. To test the hypothesis that regulatory T cells (Treg) are playing a role in the high variability in the disease outcome in TLR9 deficient mice, depletion of CD4+CD25+ T cells with a specific antibody three days before infection with L. major were performed Interestingly, these treated mice developed large lesions, low IL-4 and decreased IFN-γ producion when compared to untreated mice. A better understanding of the mechanism by which Treg cells influence the outcome of the disease in TLR9 deficient mice following L. major infection is currently under investigation. Altogether, this study demonstrates the importance of TLR9 in the induction of a protective T'h1 response, a process that is involved in the resolution of the lesion induced by L. major infection. 1.2 RÉSUMÉ Le rôle de la réponse immunitaire innée a longtemps été négligé quant à l'impact qu'elle pourrait avoir dans l'initiation d'une réponse immune adaptative efficace dirigée contre un pathogène. Si l'importance des récepteurs Toll-like (TLR) du système inné dans la reconnaissance des virus et bactéries a été démontrée, son rôle dans la défense contre les pathogènes eucaryotes reste encore très élusif. Récemment, il a été montré que les voies de signalisation provenant de l'activation des TLRs pouvaient initier la réponse immunitaire innée et adaptative après une infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans un modèle marin d'infection avec L. major alors que la plupart des souches de souris telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1) induite par IL-12, peu de souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse Th2 induite par IL-4. La différentiation Th1/Th2 est un événement qui prend place de manière définitive lors de la première semaine après infection. Les événements précoces promouvant le développement d'une réponse Th1 ou Th2 n'étant pas connus, l'objectif de ce travail a été de démontrer un rôle des TLRs dans l'initiation d'une réponse immune innée et adaptative suite à l'infection par L. major. Nous avons démontré que MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, est nécessaire pour que les souris résistantes C57BL/6 développent une réponse Th1 protectrice. L'importance du rôle de TLR2 et TLR4 dans la reconnaissance du parasite Leishmania ayant été démontrée, nous avons privilégié l'analyse de la réponse immunitaire suite à une infection in vivo de souris déficiente en TLR2 ou TLR4 sur un fond génétique résistant. Les résultats obtenus montrent que la présence de ces récepteurs n'est pas indispensable pour le contrôle de l'infection et la polarisation d'une réponse Th1 caractéristique de la résistance à L. major. Cependant d'autres TLRs peuvent aussi activer la voie de signalisation MyD88 dépendante. L'expression de l'ARNm des différents TLRs dans les ganglions drainant de souris sensibles et résistantes pendant la première semaine d'infection a été déterminée par PCR quantitative en temps réel. Les résultats obtenus montrent que l'ARNm de TLR7 et TLR9 était régulé positivement suite à l'infection par L. major chez les souris résistantes C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était détectable chez les souris sensibles BALB/c. Le rôle des récepteurs TLR7 et TLR9 a donc été évalué par l'infection par L. major des souris déficientes en TLR7 et TLR9 sur fond génétique C57BL/6. Nos résultats ont clairement démontré que les souris déficientes en TLR7 montrent une réponse immunitaire identique à celle des souris résistantes C57BL/6, signifiant que TLR7 n'est pas indispensable au développement d'une Th1 ainsi qu'au contrôle de la parasitémie. Paz contre, les souris déficientes en TLR9 sur un fond génétique résistant ont montré une grande variabilité dans la réponse à l'infection. En effet, la moitié des souris deviennent sensibles à l'infection, ceci étant associé à une diminution dans la production d'IFN-γ et à une augmentation de la production d'IL-4. Ces résultats suggèrent que TLR9 est impliqué dans le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Cependant les résultats avec les souris déficientes en TLR9 montrant une grande hétérogénéité et une balance Th1/Th2 instable, nous avons émis l'hypothèse que les cellules T régulatrices pouvaient être impliquées dans ce phénomène. Nous avons effectivement constaté qu'après déplétion des cellules CD4+CD25+, les souris déficientes en TLR9 développent des lésions aussi grandes que les souris BALB/c après infection par L. major. Cependant le nombre de parasites reste le même que chez les souris C57BL/6. De plus la production d'IL-4 ainsi que celle d'IFN-γ reste extrêment bas. Les mécanismes régulateurs impliqués dans ce processus sont en cours d'analyse. Ce travail met en évidence l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. 1.3 RESUME POUR UN LARGE PUBLIC La leishmaniose est une maladie parasitaire répandue dans le monde entier et touchant plus de 88 pays. L'incidence mondiale de la leishmaniose cutanée et de 1 à 1,5 million de nouveaux cas par année. Plus de 12 millions de personnes sont affectées par la maladie et 350 millions de personnes sont une population à risque. Un modèle marin d'infection avec Leishmania major (L. major) a été établi qui reproduit plusieurs tableaux cliniques observés dans le cas de la leishmaniose cutanée chez l'homme. L'analyse de la réponse immunitaire dans les souris infectées par L. major a permis de distinguer deux groupes : les souris de la plupart des souches telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1), alors que quelques souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse de type Th2. La réponse immune adaptative dans le modèle d'infection avec L. major à été largement étudiée. Cependant, les événements précoces déterminants pour le développement d'une réponse Th1 ou Th2 restent encore très flous. Récemment, plusieurs publications ont montré que les récepteurs Toll-like (TLR) peuvent contribuer à l'initiation de la réponse immunitaire lors d'une infection avec le parasite intracellulaire L. major. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le rôle de MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, dans la réponse immune suite à une infection avec L. major. En l'absence de MyD88, les souris normalement résistantes à l'infection avec L. major deviennent sensibles et développent des lésions importantes. Ces souris ne sont plus capables de développer une réponse Thl, normalement caractéristique de leur phénotype résistant. Nous avons ensuite tenté de comprendre quels TLRs, plus précisément, pouvait être impliqué dans ce processus. Malgré quelques évidences démontrant que TLR2 et TLR4 pouvaient avoir un rôle important dans l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative à Leishmania, nous avons montré que, in vivo après infection avec L. major, la déficience d'un de ces récepteurs n'était pas suffisante à faire basculer la réponse immunitaire. Les souris C57BL/6 déficient en TLR2 ou TLR4 peuvent parfaitement contrôler l'évolution de la maladie. De plus, ces souris, malgré l'absence de TLR2 ou TLR4, sont capables de monter une parfaite réponse Thl. Etant donné que TLR2 et TLR4 n'étaient pas essentiels pour la résistance à la maladie, nous avons analysé les TLRs, parmi les 12 décrits qui pouvaient être indispensables au développement d'une réponse de type Th1 associée à la résistance à l'infection par Leishmania. Nos expériences ont montré que l'expression de l'ARN messager (ARNm) de TLR7 et TLR9 était modulée suite à l'infection par L. major chez la souris résistante C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était visible chez les souris sensible BALB/c. Pensant que ces TLRs pourraient jouer un rôle dans la réponse immunitaire au parasite, nous avons étudié l'évolution de l'infection dans les souris déficientes en TLR7 et TLR9. Nos résultats ont clairement démontré que TLR7 n'était pas indispensable à la résistance au parasite alors que l'absence de TLR9 avait des conséquences radicales sur le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Ce travail révèle ainsi l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. Il est a noté que nos résultats sont en accord avec le fait que les motifs CpG, qui sont des immunostimulateurs interagissant avec le TLR9, ont une activité adjuvante importante dans la préparation de vaccins contre la leishmaniose. Une meilleure compréhension des mécanismes immunologiques impliquant le TLR9 dans la reconnaissance du parasite est alors indispensable pour le développement de vaccins thérapeutiques efficaces.

Novel immunotherapeutic strategies against human papillomavirus type 16 (HPV 16) induced lesions and cervical cancer

RESUME Le cancer du col de l'utérus, deuxième cause de mort par cancer chez la femme, a pu être associé à une infection par plusieurs types de virus du Papillome Humain (HPV), et en particulier HPV 16. Les vaccins prophylactiques sont efficaces à prévenir le cancer du col utérin alors que les lésions de haut grade sont généralement traitées par ablation chirurgicale et par d'éventuels traitements additionnels. Les risques de récurrence liés aux ablations et le taux de mortalité (50%) lié au cancer, démontrent le besoin de développer des stratégies alternatives afin de cibler les lésions précancéreuses. A ce jour, les vaccins thérapeutiques ont démontré peu de résultats cliniques, contrastant avec les régressions de tumeurs ectopiques observées après vaccination dans des modèles murins avec tumeurs associées à HPV. L'induction de réponses immunitaires protectrices dans la muqueuse génitale semble être cruciale pour l'efficacité des vaccins thérapeutiques HPV et évaluer leur efficacité dans un modèle murin avec tumeurs-HPV génitales représente un pré-requis important avant de procéder à des études cliniques. Par conséquent, nous avons établi un modèle murin orthotopique où des tumeurs se développent dans (a muqueuse génitale après une instillation intra-vaginale (i.vag) de cellules tumorales exprimant les oncogènes E6/E7 d'HPV 16 et transduites par un vecteur lentiviral codant la luciferase afin de suivre le développement de ces tumeurs in vivo par imagerie. La caractérisation histologique a démontré que les tumeurs grandissaient dans l'épithélium vaginal et en accord avec leur localisation, des cellules Τ CD8 spécifiques à E7 induites par la tumeur n'étaient détectées que dans la muqueuse génitale et les ganglions drainants. Une infiltration de cellules Τ régulatrices a aussi été mise en évidence, empêchant la régression spontanée de ces tumeurs. Par conséquent, ce modèle devrait être plus adéquat pour tester des stratégies thérapeutiques, étant donné qu'il partage certaines similarités immunologiques avec les lésions génitales naturelles causées par HPV. Etant donné que les oncogènes E6 et E7 d'HPV sont nécessaires à la maintenance du phénotype cancéreux des cellules cervicales, elles représentent des antigènes cibles pour la vaccination thérapeutique. Nous avons démontré que des souris immunisées par voie sous-cutanée (s.c.) avec une dose d'un vaccin à base de polypeptide E7 d'HPV 16 et d'adjuvants, présentaient de nombreuses cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans leurs organes lymphatiques mais également dans la muqueuse génitale. De plus, le manque de corrélation entre les réponses spécifiques mesurées dans la périphérie et dans la muqueuse génitale souligne la nécessité et l'importance de déterminer les réponses immunitaires localement là où les lésions dues à HPV se développent. Si une vaccination par voie muqueuse est plus propice à traiter/régresser des infections génitales/tumeurs que le voie parentérale est un sujet débattu. Nos données montrent que seule la voie s.c. était capable de régresser la quasi totalité des tumeurs génitales chez la souris bien que des réponses CD8 spécifiques à E7 similaires étaient mesurées dans la muqueuse génitale après des vaccinations intra-nasale et i.vag. Afin d'augmenter la réponse spécifique au vaccin dans la muqueuse génitale, des immunostimulants ont été administrés par voie i.vag après vaccination. Nous avons démontré qu'une application i.vag d'agonistes des Toll like receptors après une vaccination s.c. induisait de manière significative une augmentation des cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans la muqueuse génitale. Plus précisément et concernant les CpG et Poly l:C, l'effet était probablement associé à une attraction locale des cellules Τ CD8 et deuxièmement dépendait respectivement des voies de signalisation TLR9 et TLR3/Mda5. Finalement, cette stratégie combinatoire a permis de régresser des grosses tumeurs génitales chez la souris, suggérant qu'une telle immunothérapie pourrait adéquatement traiter des lésions dues à HPV chez les femmes. SUMMARY Cervical cancer is the second leading cause of cancer mortality in women worldwide and results from an infection with a subset of Human Papillomavirus (HPV), HPV 16 representing the most prevalent type. The available prophylactic vaccines are an effective strategy to prevent cervical cancer while already established high grade lesions usually require surgical ablation of lesion with possible additional treatments. Recurrence risks linked to conventional ablations and the high mortality (50%) related to cervical cancer demonstrate the need for alternative strategies like immunotherapies to target pre¬cancerous lesions. Until now, therapeutic vaccines only showed limited clinical results, which strongly contrast with the regression of ectopic tumors observed in the available murine HPV tumor models after vaccination. Induction of protective immune responses in the genital mucosa (GM) may be crucial for efficacy of HPV therapeutic vaccines and evaluating their efficacy in a murine model with genital HPV- tumors represents an important prerequisite for clinical trials. Thus, we have here established an orthotopic mouse model where tumors in the GM develop after an intravaginal (i.vag) instillation of HPV 16 E6/E7 oncogenes-expressing tumor cells transduced with a luciferase encoding lentivirus vector for in vivo imaging of tumor growth. Histological characterization showed that tumor grew within the vaginal epithelium and according to their mucosal location tumor- induced E7-specific CD8 Τ cells were restricted to the GM and genital draining lymph nodes together with high Τ regulatory cells infiltrates preventing spontaneous regression. Consequently, sharing several immunological similarities with natural genital HPV lesions, this novel genital tumor model may be more adequate to test therapeutic strategies. As E6 and/or E7 HPV oncogenes expression is required for the maintenance of the cancerous phenotype of cervical cells, they represent target antigens for therapeutic vaccination. We reported that mice subcutaneously (s.c.) immunized once with an adjuvanted HPV 16 E7 polypeptide vaccine harbored high E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in their lymphoid organs and more importantly in the GM. In addition, the lack of correlation between specific responses measured in the periphery with those measured in the GM highlighted the necessity and relevance to determine the immune responses locally where HPV 16-induced lesions develop. Whether a mucosal route of immunization is better to treat/regress genital infections/tumors than parenteral immunization is still debated. Our data shows that although similar E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells responses were measured in the GM upon mucosal routes of E7 vaccine delivery (nasal and vaginal immunizations), only the s.c immunization was able to regress at least all genital tumors in mice. To further increase the vaccine-specific responses in the GM, immunostimulatory agents were i.vag administrated after vaccination. We demonstrated that a single i.vag application of toll like receptor (TLR) agonists after a s.c. E7 vaccination induced a significant increase of E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in the GM. More precisely, regarding CpG and Poly l:C, the effect is most probably associated with a local attraction of total CD8 Τ cells and secondly depends on TLR9 and TLR3/Mda5 signaling pathways, respectively. Finally, this combinatorial strategy induced tumor regression in mice harboring large genital tumors, suggesting that such an immunotherapy could be adequate to treat HPV-induced lesions in women.

Pregnancy-induced chromatin remodeling in the breast of postmenopausal women.

Early pregnancy and multiparity are known to reduce the risk of women to develop breast cancer at menopause. Based on the knowledge that the differentiation of the breast induced by the hormones of pregnancy plays a major role in this protection, this work was performed with the purpose of identifying what differentiation-associated molecular changes persist in the breast until menopause. Core needle biopsies (CNB) obtained from the breast of 42 nulliparous (NP) and 71 parous (P) postmenopausal women were analyzed in morphology, immunocytochemistry and gene expression. Whereas in the NP breast, nuclei of epithelial cells were large and euchromatic, in the P breast they were small and hyperchromatic, showing strong methylation of histone 3 at lysine 9 and 27. Transcriptomic analysis performed using Affymetrix HG_U133 oligonucleotide arrays revealed that in CNB of the P breast, there were 267 upregulated probesets that comprised genes controlling chromatin organization, transcription regulation, splicing machinery, mRNA processing and noncoding elements including XIST. We concluded that the differentiation process induced by pregnancy is centered in chromatin remodeling and in the mRNA processing reactome, both of which emerge as important regulatory pathways. These are indicative of a safeguard step that maintains the fidelity of the transcription process, becoming the ultimate mechanism mediating the protection of the breast conferred by full-term pregnancy.

Simultaneous co-expression of memory- and effector-related genes by individual human CD8 T cells depends on antigen specificity and differentiation

Purpose/Objective: Phenotypic and functional T cell properties are usually analyzed at the level of defined cell populations. However, large differences between individual T cells may have important functional consequences. To answer this issue, we performed highly sensitive single-cell gene expression profiling, which allows the direct ex vivo characterization of individual virus- and tumor-specific T cells from healthy donors and melanoma patients. Materials and methods: HLA-A*0201-positive patients with stage III/ IV metastatic melanoma were included in a phase I clinical trial (LUD- 00-018). Patients received monthly low-dose of the Melan-AMART- 1 26_35 unmodified natural (EAAGIGILTV) or the analog A27L (ELAGIGILTV) peptides, mixed CPG and IFA. Individual effector memory CD28+ (EM28+) and EM28- tetramer-specific CD8pos T cells were sorted by flow cytometer. Following direct cell lysis and reverse transcription, the resulting cDNA was precipitated and globally amplified. Semi-quantitative PCR was used for gene expression and TCR BV repertoire analyses. Results: We have previously shown that vaccination with the natural Melan-A peptide induced T cells with superior effector functions as compared to the analog peptide optimized for enhanced HLA binding. Here we found that natural peptide vaccination induced EM28+ T cells with frequent co-expression of both memory/homing-associated genes (CD27, IL7R, EOMES, CXCR3 and CCR5) and effector-related genes (IFNG, KLRD1, PRF1 and GZMB), comparable to protective EBV- and CMV-specific T cells. In contrast, memory/homing- and effectorassociated genes were less frequently co-expressed after vaccination with the analog peptide. Conclusions: These findings reveal a previously unknown level of gene expression diversity among vaccine- and virus-specific T cells with the simultaneous co-expression of multiple memory/homing- and effector- related genes by the same cell. Such broad functional gene expression signatures within antigen-specific T cells may be critical for mounting efficient responses to pathogens or tumors. In summary, direct ex vivo high-resolution molecular characterization of individual T cells provides key insights into the processes shaping the functional properties of tumor- and virus-specific T cells.

Functional analysis of a conserved DNA methyltransferase in caulobacter crescentus

CcrM is a DNA methyltransferase that methylates the adenine in GANTC motifs in the chromo-some of the bacterial model Caulobacter crescentus. The loss of the CcrM homolog is lethal in C. crescentus and in several other species of Alphaproteobacteria. In this research, we used different experimental and bioinformatic approaches to determine why CcrM is so critical to the physiology of C. crescentus. We first showed that CcrM is a resident orphan DNA methyltransferase in non-Rickettsiales Alphaproteobacteria and that its gene is strictly conserved in this clade (with only one ex¬ception among the genomes sequenced so far). In C. crescentus, cells depleted in CcrM in rich medium quickly lose viability and present an elongated phenotype characteristic of an im¬pairment in cell division. Using minimal medium instead of rich medium as selective and main¬tenance substrate, we could generate a AccrM mutant that presents a viability comparable to the wild type strain and only mild morphological defects. On the basis of a transcriptomic ap¬proach, we determined that several genes essential for cell division were downregulated in the AccrM strain in minimal medium. We offered decisive arguments to support that the efficient transcription of two of these genes, ftsZ and mipZ, coding respectively for the Z-ring forming GTPase FtsZ and an inhibitor of FtsZ polymerization needed for the correct positioning of the Z- ring at mid-cell, requires the methylation of an adenine in a conserved GANTC motif located in their core promoter region. We propose a model, according to which the genome of C. crescentus encodes a transcriptional activator that requires a methylated adenine in a GANTC context to bind to DNA and suggest that this transcriptional regulator might be the global cell-cycle regulator GcrA. In addition, combining a classic genetic approach and in vitro evolution experiments, we showed that the mortality and cell division defects of the AccrM strain in rich medium are mainly due to limiting intracellular levels of the FtsZ protein. We also studied the dynamics of GANTC methylation in C. crescentus using the SMRT technol¬ogy developed by Pacific Biosciences. Our findings support the commonly accepted model, accord¬ing to which the methylation state of GANTC motifs varies during the cell cycle of C. crescentus: before the initiation of DNA replication, the GANTC motifs are fully-methylated (methylated on both strands); when the DNA gets replicated, the GANTC motifs become hemi-methylated (methyl¬ated on one strand only) and this occurs at different times during replication for different loci along the chromosome depending on their position relative to the origin of replication; the GANTC mo¬tifs are only remethylated after DNA replication has finished as a consequence of the massive and short-lived expression of CcrM in predivisional cells. About 30 GANTC motifs in the C. crescentus chromosome were found to be undermethylated in most of the bacterial population; these might be protected from CcrM activity by DNA binding proteins and some of them could be involved in methylation-based bistable transcriptional switches. - CcrM est une ADN méthyltransférase qui méthyle les adénines dans le contexte GANTC dans le génome de la bactérie modèle Caulobacter crescentus. La perte de l'homologue de CcrM chez C. crescentus et chez plusieurs autres espèces d'Alphaproteobactéries est létale. Dans le courant de cette recherche, nous tentons de déterminer pourquoi la protéine CcrM est cruciale pour la survie de C. crescentus. Nous démontrons d'abord que CcrM est une adénine méthyltransférase orpheline résidente, dont le gène fait partie du génome minimal partagé par les Alphaprotéobactéries non-Rickettsiales (à une exception près). Lorsqu'une souche de C. crescentus est privée de CcrM, sa viabilité décroît rapi¬dement et ses cellules présentent une morphologie allongée qui suggère que la division cellulaire est inhibée. Nous sommes parvenus à créer une souche AccrM en utilisant un milieu minimum, au lieu du milieu riche classiquement employé, comme milieu de sélection et de maintenance pour la souche. Lorsque nous avons étudié le transcriptome de cette souche de C. crescentus privée de CcrM, nous avons pu constater que plusieurs gènes essentiels pour le bon déroulement de la division cellulaire bactérienne étaient réprimés. En particulier, l'expression adéquate des gènes ftsZ et mipZ - qui codent, respectivement, pour FtsZ, la protéine qui constitue, au milieu de la cellule, un anneau protéique qui initie le processus de division et pour MipZ, un inhibiteur de la polymérisation de FtsZ qui est indispensable pour le bon positionnement de l'anneau FtsZ - est dépendante de la présence d'une adénine méthylée dans un motif GANTC conservé situé dans leur région promotrice. Nous présentons un modèle selon lequel le génome de C. crescentus code pour un facteur de transcription qui exige la présence d'une adénine méthylée dans un contexte GANTC pour s'attacher à l'ADN et nous suggérons qu'il pourrait s'agir du régulateur global du cycle cellulaire GcrA. En outre, nous montrons, en combinant la génétique classique et une approche basée sur l'évolution expérimentale, que la mortalité et l'inhibition de la division cellulaire caractéristiques de la souche àccrMeη milieu riche sont dues à des niveaux excessivement bas de protéine FtsZ. Nous avons aussi étudié la dynamique de la méthylation du chromosome de C. crescentus sur la base de la technologie SMRT développée par Pacific Biosciences. Nous confirmons le modèle communément accepté, qui affirme que l'état de méthylation des motifs GANTC change durant le cycle cellulaire de C. crescentus: les motifs GANTC sont complètement méthylés (méthylés sur les deux brins) avant de début de la réplication de l'ADN; ils deviennent hémi-méthylés (méthylés sur un brin seulement) une fois répliqués, ce qui arrive à différents moments durant la réplication pour différents sites le long du chromosome en fonction de leur position par rapport à l'origine de répli-cation; finalement, les motifs GANTC sont reméthylés après la fin de la réplication du chromosome lorsque la protéine CcrM est massivement, mais très transitoirement, produite. Par ailleurs, nous identifions dans le chromosome de C. crescentus environ 30 motifs GANTC qui restent en perma-nence non-méthylés dans une grande partie de la population bactérienne; ces motifs sont probable-ment protégés de l'action de CcrM par des protéines qui s'attachent à l'ADN et certains d'entre eux pourraient être impliqués dans des mécanismes de régulation générant une transcription bistable.

Phase I/IIa study of cilengitide and temozolomide with concomitant radiotherapy followed by cilengitide and temozolomide maintenance therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma.

Purpose: Invasion and migration are key processes of glioblastoma and are tightly linked to tumor recurrence. Integrin inhibition using cilengitide has shown synergy with chemotherapy and radiotherapy in vitro and promising activity in recurrent glioblastoma. This multicenter, phase I/IIa study investigated the efficacy and safety of cilengitide in combination with standard chemoradiotherapy in newly diagnosed glioblastoma. Patients and Methods: Patients (age >= 18 to >= 70 years) were treated with cilengitide (500 mg) administered twice weekly intravenously in addition to standard radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide. Treatment was continued until disease progression or for up to 35 weeks. The primary end point was progression-free survival (PFS) at 6 months. Results: Fifty-two patients ( median age, 57 years; 62% male) were included. Six- and 12-month PFS rates were 69% (95% CI, 54% to 80%) and 33% ( 95% CI, 21% to 46%). Median PFS was 8 months ( 95% CI, 6.0 to 10.7 months). Twelve- and 24-month overall survival ( OS) rates were 68% ( 95% CI, 53% to 79%) and 35% ( 95% CI, 22% to 48%). Median OS was 16.1 months ( 95% CI, 13.1 to 23.2 months). PFS and OS were longer in patients with tumors with O-6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter methylation (13.4 and 23.2 months) versus those without MGMT promoter methylation (3.4 and 13.1 months). The combination of cilengitide with temozolomide and radiotherapy was well tolerated, with no additional toxicity. No pharmacokinetic interactions between temozolomide and cilengitide were identified. Conclusion: Compared with historical controls, the addition of concomitant and adjuvant cilengitide to standard chemoradiotherapy demonstrated promising activity in patients with glioblastoma with MGMT promoter methylation. J Clin Oncol 28:2712-2718. (C) 2010 by American Society of Clinical Oncology

Clinical utility of g-cimp and idh1 status as dual prognostic markers in glioblastoma

The glioma CpG island methylator phenotype (G-CIMP) has been shown to be highly correlated with prognosis andwas noted to be highly concordant with IDH1mutation in malignant glioma in the limited number of samples analyzed. To better understand the relationship of G-CIMP with IDH1 mutation status and patient outcome, we examined G-CIMP status in detail in a larger retrospective series of glioblastomas as well as tumor samples from the RTOG 0525 clinical trial. Sampleswere tested for 6 CIMPmarkers andwere correlated with patient outcomes. In the retrospective tumor set (n ¼ 301),we found 3 distinct survival groups based on the number of CIMP markers: 0-1 (CIMP-negative), 2-4 (CIMP-intermediate), and 5 or greater (CIMP-positive) with median survivals 13.8, 20.1, and 90.6 months, respectively. This finding was validated in the RTOG 0525 samples (median survivals 15.0, 20.3, and 37.0 months). Among 787 cases with both IDH and CIMP data, 617 were CIMP-negative, 136 were CIMP-intermediate, and 34 were CIMP-positive. Seven hundred forty-four were wild type for IDH1 mutation, and 43 were mutant. CIMP and IDH status were positively correlated but outliers were found. Among the 610 CIMP-negative tumors, there were 7 IDH-mutant tumors, which showed no difference in outcome. Similarly, among the 34 CIMP-positive tumors, there were 21 IDH-mutant cases, which also showed no difference in outcome. However, among the CIMP-intermediate cases, there were 15 IDH-mutant cases with significantly (p ¼ 0.0003) improved outcome (medians not reached vs. 18.5 months, 2 year survival 87% vs. 32%). Multivariate analysis showed that both IDH1 mutation status and CIMP status were independent predictors of outcome. These findings suggest the clinical utility of refining the CIMP status into negative, intermediate, and positive groups and the finding that both IDH1 and CIMPstatus are important molecular markers in GBM.

Evolutionary origin and functions of retrogene introns.

Retroposed genes (retrogenes) originate via the reverse transcription of mature messenger RNAs from parental source genes and are therefore usually devoid of introns. Here, we characterize a particular set of mammalian retrogenes that acquired introns upon their emergence and thus represent rare cases of intron gain in mammals. We find that although a few retrogenes evolved introns in their coding or 3' untranslated regions (untranslated region, UTR), most introns originated together with untranslated exons in the 5' flanking regions of the retrogene insertion site. They emerged either de novo or through fusions with 5' UTR exons of host genes into which the retrogenes inserted. Generally, retrogenes with introns display high transcription levels and show broader spatial expression patterns than other retrogenes. Our experimental expression analyses of individual intron-containing retrogenes show that 5' UTR introns may indeed promote higher expression levels, at least in part through encoded regulatory elements. By contrast, 3' UTR introns may lead to downregulation of expression levels via nonsense-mediated decay mechanisms. Notably, the majority of retrogenes with introns in their 5' flanks depend on distant, sometimes bidirectional CpG dinucleotide-enriched promoters for their expression that may be recruited from other genes in the genomic vicinity. We thus propose a scenario where the acquisition of new 5' exon-intron structures was directly linked to the recruitment of distant promoters by these retrogenes, a process potentially facilitated by the presence of proto-splice sites in the genomic vicinity of retrogene insertion sites. Thus, the primary role and selective benefit of new 5' introns (and UTR exons) was probably initially to span the often substantial distances to potent CpG promoters driving retrogene transcription. Later in evolution, these introns then obtained additional regulatory roles in fine tuning retrogene expression levels. Our study provides novel insights regarding mechanisms underlying the origin of new introns, the evolutionary relevance of intron gain, and the origin of new gene promoters.

Sex and clock to discover new PPARα functions

Summary : PPARα is a ligand-activated transcription factor that is a member of the nuclear receptor superfamily. In rodents, PPARα is highly expressed in liver, especially in parenchymal cells, where it has an impact on several hepatic functions such as nutrient metabolism, inflammation and metabolic stress. Ligands for PPARα comprise long chain unsaturated fatty acids, eicosanoids and lipid lowering fibrate drugs. In liver, many metabolic processes are orchestrated by the hepatic circadian clock. The aim of the hepatic clock is to synchronize cellular pathways allowing animals to adapt their metabolism to predictable daily changes in the environment. Indeed, similar to PPARα, the hepatic clock influences nutrient metabolism and detoxification through circadian output regulators :the PAR-domain basic leucine zipper proteins called PAR blip proteins. In this report, we showed that through a positive feedback loop mechanism, PAR. blip, proteins participate to the availability of PPARα endogenous ligands that contribute to the circadian expression and functions of PPARα. Interestingly, we also discovered some unexpected hepatic sexual dimorphic functions of PPARα. These functions are determined b PPARα sumoylation, interaction with DNA methylation mechanism and with unexpected proteins with gender specificity. The connection between circadian clock and hepatic sexual dimorphism opens new perspectives regarding the chronobiology of PPARα activity and the beneficial effects of PPARα agonist in the treatment of diseases related to steroid hormones metabolism characterized by inflammation and hepatotoxicity. Résumé : PPARα est un facteur de transcription activé par un ligand, membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Chez les rongeurs, PPARα est fortement exprimé dans le foie, spécialement dans les cellules du parenchyme dans lesquelles il joue un role important dans les fonctions hépatiques tels que le métabolisme des nutriments, l'inflammation et les stress métaboliques. Les ligands pour PPARα comprennent les acides gras à longues chaînes, les eicosanoides et les médicaments hypolipidémiques (fibrates). Dans le foie, beaucoup de processus métaboliques sont orchestrés par l'horloge circadienne hépatique. Le but de cette horloge est de synchroniser les voies métaboliqués permettant aux animaux d'adapter leurs métabolismes aux changements journaliers. Ainsi, l'horloge hépatique influence le métabolisme des nutriments tels que l'utilisation des lipides à travers certains régulateurs circadians appelés facteurs de transcription PAR bZips. Dans ce mémoire, nous avons montré qu'à travers une boucle de régulation, les protéines PAR bZip contrôlent la production des ligands endogènes à PPARα, jouant un rôle dans l'expression circadienne et les fonctions de PPARα. Nous avons également découvert des aspects méconnus des fonctions liées au dimorphisme sexuel de PPARα. Nous avons montré que PPARα est différemment sumoylisé entre les sexes et interagit avec la méthylation de l'ADN ainsi qu'avec des protéines insoupçonnées comme partenaires de PPARα. De part leur lien avec l'horloge circadienne et le dimorphisme sexuel, nos découvertes ouvrent de nouvelles perspectives concernant la chronobiologie de l'activité de PPARα et les effets bénéfiques des ses activateurs dans le traitement des maladies liées au métabolisme des hormones stéroides.

IL28B expression depends on a novel TT/-G polymorphism which improves HCV clearance prediction.

Approximately 3% of the world population is chronically infected with the hepatitis C virus (HCV), with potential development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Despite the availability of new antiviral agents, treatment remains suboptimal. Genome-wide association studies (GWAS) identified rs12979860, a polymorphism nearby IL28B, as an important predictor of HCV clearance. We report the identification of a novel TT/-G polymorphism in the CpG region upstream of IL28B, which is a better predictor of HCV clearance than rs12979860. By using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from individuals carrying different allelic combinations of the TT/-G and rs12979860 polymorphisms, we show that induction of IL28B and IFN-γ-inducible protein 10 (IP-10) mRNA relies on TT/-G, but not rs12979860, making TT/-G the only functional variant identified so far. This novel step in understanding the genetic regulation of IL28B may have important implications for clinical practice, as the use of TT/G genotyping instead of rs12979860 would improve patient management.

Influence of IFNL3/4 Polymorphisms on the Incidence of Cytomegalovirus Infection After Solid-Organ Transplantation.

BACKGROUND: Polymorphisms in IFNL3 and IFNL4, the genes encoding interferon λ3 and interferon λ4, respectively, have been associated with reduced hepatitis C virus clearance. We explored the role of such polymorphisms on the incidence of cytomegalovirus (CMV) infection in solid-organ transplant recipients. METHODS: White patients participating in the Swiss Transplant Cohort Study in 2008-2011 were included. A novel functional TT/-G polymorphism (rs368234815) in the CpG region upstream of IFNL3 was investigated. RESULTS: A total of 840 solid-organ transplant recipients at risk for CMV infection were included, among whom 373 (44%) received antiviral prophylaxis. The 12-month cumulative incidence of CMV replication and disease were 0.44 and 0.08 cases, respectively. Patient homozygous for the minor rs368234815 allele (-G/-G) tended to have a higher cumulative incidence of CMV replication (subdistribution hazard ratio [SHR], 1.30 [95% confidence interval {CI}, .97-1.74]; P = .07), compared with other patients (TT/TT or TT/-G). The association was significant among patients followed by a preemptive approach (SHR, 1.46 [95% CI, 1.01-2.12]; P = .047), especially in patients receiving an organ from a seropositive donor (SHR, 1.92 [95% CI, 1.30-2.85]; P = .001), but not among those who received antiviral prophylaxis (SHR, 1.13 [95% CI, .70-1.83]; P = .6). These associations remained significant in multivariate competing risk regression models. CONCLUSIONS: Polymorphisms in the IFNL3/4 region influence susceptibility to CMV replication in solid-organ transplant recipients, particularly in patients not receiving antiviral prophylaxis.

Presence of an oligodendroglioma-like component in newly diagnosed glioblastoma identifies a pathogenetically heterogeneous subgroup and lacks prognostic value: central pathology review of the EORTC_26981/NCIC_CE.3 trial.

Glioblastoma (GBM) is a morphologically heterogeneous tumor type with a median survival of only 15 months in clinical trial populations. However, survival varies greatly among patients. As part of a central pathology review, we addressed the question if patients with GBM displaying distinct morphologic features respond differently to combined chemo-radiotherapy with temozolomide. Morphologic features were systematically recorded for 360 cases with particular focus on the presence of an oligodendroglioma-like component and respective correlations with outcome and relevant molecular markers. GBM with an oligodendroglioma-like component (GBM-O) represented 15% of all confirmed GBM (52/339) and was not associated with a more favorable outcome. GBM-O encompassed a pathogenetically heterogeneous group, significantly enriched for IDH1 mutations (19 vs. 3%, p = 0.003) and EGFR amplifications (71 vs. 48%, p = 0.04) compared with other GBM, while co-deletion of 1p/19q was found in only one case and the MGMT methylation frequency was alike (47 vs. 46%). Expression profiles classified most of the GBM-O into two subtypes, 36% (5/14 evaluable) as proneural and 43% as classical GBM. The detection of pseudo-palisading necrosis (PPN) was associated with benefit from chemotherapy (p = 0.0002), while no such effect was present in the absence of PPN (p = 0.86). In the adjusted interaction model including clinical prognostic factors and MGMT status, PPN was borderline nonsignificant (p = 0.063). Taken together, recognition of an oligodendroglioma-like component in an otherwise classic GBM identifies a pathogenetically mixed group without prognostic significance. However, the presence of PPN may indicate biological features of clinical relevance for further improvement of therapy.

Intravaginal TLR agonists increase local vaccine-specific CD8 T cells and human papillomavirus-associated genital-tumor regression in mice.

Human papillomaviruses (HPV)-related cervical cancer is the second leading cause of cancer death in women worldwide. Despite active development, HPV E6/E7 oncogene-specific therapeutic vaccines have had limited clinical efficacy to date. Here, we report that intravaginal (IVAG) instillation of CpG-ODN (TLR9 agonist) or poly-(I:C) (TLR3 agonist) after subcutaneous E7 vaccination increased ∼fivefold the number of vaccine-specific interferon-γ-secreting CD8 T cells in the genital mucosa (GM) of mice, without affecting the E7-specific systemic response. The IVAG treatment locally increased both E7-specific and total CD8 T cells, but not CD4 T cells. This previously unreported selective recruitment of CD8 T cells from the periphery by IVAG CpG-ODN or poly-(I:C) was mediated by TLR9 and TLR3/melanoma differentiation-associated gene 5 signaling pathways, respectively. For CpG, this recruitment was associated with a higher proportion of GM-localized CD8 T cells expressing both CCR5 and CXCR3 chemokine receptors and E-selectin ligands. Most interestingly, IVAG CpG-ODN following vaccination led to complete regression of large genital HPV tumors in 75% of mice, instead of 20% with vaccination alone. These findings suggest that mucosal application of immunostimulatory molecules might substantially increase the effectiveness of parenterally administered vaccines.Mucosal Immunology advance online publication 12 September 2012; doi:10.1038/mi.2012.83.

Vaccination-induced functional competence of circulating human tumor-specific CD8 T-cells.

T-cells specific for foreign (e.g., viral) antigens can give rise to strong protective immune responses, whereas self/tumor antigen-specific T-cells are thought to be less powerful. However, synthetic T-cell vaccines composed of Melan-A/MART-1 peptide, CpG and IFA can induce high frequencies of tumor-specific CD8 T-cells in PBMC of melanoma patients. Here we analyzed the functionality of these T-cells directly ex vivo, by multiparameter flow cytometry. The production of multiple cytokines (IFNγ, TNFα, IL-2) and upregulation of LAMP-1 (CD107a) by tumor (Melan-A/MART-1) specific T-cells was comparable to virus (EBV-BMLF1) specific CD8 T-cells. Furthermore, phosphorylation of STAT1, STAT5 and ERK1/2, and expression of CD3 zeta chain were similar in tumor- and virus-specific T-cells, demonstrating functional signaling pathways. Interestingly, high frequencies of functionally competent T-cells were induced irrespective of patient's age or gender. Finally, CD8 T-cell function correlated with disease-free survival. However, this result is preliminary since the study was a Phase I clinical trial. We conclude that human tumor-specific CD8 T-cells can reach functional competence in vivo, encouraging further development and Phase III trials assessing the clinical efficacy of robust vaccination strategies.

Gluco-incretins regulate beta-cell glucose competence by epigenetic silencing of Fxyd3 expression.

BACKGROUND/AIMS: Gluco-incretin hormones increase the glucose competence of pancreatic beta-cells by incompletely characterized mechanisms. METHODS: We searched for genes that were differentially expressed in islets from control and Glp1r-/-; Gipr-/- (dKO) mice, which show reduced glucose competence. Overexpression and knockdown studies; insulin secretion analysis; analysis of gene expression in islets from control and diabetic mice and humans as well as gene methylation and transcriptional analysis were performed. RESULTS: Fxyd3 was the most up-regulated gene in glucose incompetent islets from dKO mice. When overexpressed in beta-cells Fxyd3 reduced glucose-induced insulin secretion by acting downstream of plasma membrane depolarization and Ca++ influx. Fxyd3 expression was not acutely regulated by cAMP raising agents in either control or dKO adult islets. Instead, expression of Fxyd3 was controlled by methylation of CpGs present in its proximal promoter region. Increased promoter methylation reduced Fxyd3 transcription as assessed by lower abundance of H3K4me3 at the transcriptional start site and in transcription reporter assays. This epigenetic imprinting was initiated perinatally and fully established in adult islets. Glucose incompetent islets from diabetic mice and humans showed increased expression of Fxyd3 and reduced promoter methylation. CONCLUSIONS/INTERPRETATION: Because gluco-incretin secretion depends on feeding the epigenetic regulation of Fxyd3 expression may link nutrition in early life to establishment of adult beta-cell glucose competence; this epigenetic control is, however, lost in diabetes possibly as a result of gluco-incretin resistance and/or de-differentiation of beta-cells that are associated with the development of type 2 diabetes.