Surface-sampling and analysis of TATP by swabbing and gas chromatography/mass spectrometry

The method of sample recovery for trace detection and identification of explosives plays a critical role in several criminal investigations. After bombing, there can be difficulties in sending big objects to a laboratory for analysis. Traces can also be searched for on large surfaces, on hands of suspects or on surfaces where the explosive was placed during preparatory phases (e.g. places where an IED was assembled, vehicles used for transportation, etc.). In this work, triacetone triperoxide (TATP) was synthesized from commercial precursors following reported methods. Several portions of about 6 mg of TATP were then spread on different surfaces (e.g. floors, tables, etc.) or used in handling tests. Three different swabbing systems were used: a commercial swab, pre-wetted with propan-2-ol (isopropanol) and water (7:3), dry paper swabs, and cotton swabs wetted with propan-2-ol. Paper and commercial swabs were also used to sample a metal plate, where a small charge of about 4 g of TATP was detonated. Swabs were sealed in small glass jars with screw caps and Parafilm® M and sent to the laboratory for analysis. Swabs were extracted and analysed several weeks later by gas chromatography/mass spectrometry. All the three systems gave positive results, but wetted swabs collected higher amounts of TATP. The developed procedure showed its suitability for use in real cases, allowing TATP detection in several simulations, including a situation in which people wash their hands after handling the explosive.

Analyse fonctionnelle et moléculaire d'un nouveau gène (VIT32) impliqué dans le mécanisme d'action de la vasopressine

Résumé Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale (tube distal et tube collecteur) du néphron ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition ionique et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent le maintien de la pression sanguine. Dans la cellule principale du tube collecteur cortical (CCD), le taux de réabsorption de sodium dépend essentiellement de l'activité du canal épithélial à sodium (ENaC) à la membrane apicale et de la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K±ATPase) à la membrane basolatérale. L'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales de CCD, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape précoce dite « non-génomique » et une étape tardive dite « génotnique ». Durant l'étape précoce, la vasopressine régule l'expression de gènes, dont certains peuvent être impliqués dans le transport de sodium, comme ENaC et la Na+ -K+ATP ase. Le but de mon travail a été d'étudier l'implication d'une protéine appelée VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) dans le transport de sodium. L'expression de VIP32 est augmentée par la vasopressine dans les cellules principales de CCD. Dans l'ovocyte de Xenopus laevis utilisé comme système d'expression hétérologue, nous avons montré que l'expression de VIP32 provoque la maturation méiotique de l'ovocyte par l'activation de la voie des MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et du facteur de promotion méiotique (MPF). La co-expression d'ENaC et de VIP32 diminue l'activité d'ENaC de façon sélective, par l'activation de la voie des MAPK, sans affecter l'expression du canal à la surface membranaire. Nous avons également montré que la régulation de l'activité d'ENaC par la voie des MAPK est dépendante du mécanisme de régulation d'ENaC lié à un motif du canal appelé PY. Ce motif est impliqué dans le contrôle de la probabilité d'ouverture ainsi que l'expression à la surface membranaire d'ENaC. Dans les cellules principales, VIP32 par l'activation de la voie des MAPK peut être impliqué dans la régulation négative du transport transépithélial qui a lieu après plusieurs heures de traitement à la vasopressine. Le tube collecteur de reins normaux présente un taux basal significatif d'activité de la voie MAPK MEK1/2-ERK1/2. Dans la lignée mpkCCDc14 de cellules principales de CCD de souris, que nous avons utilisé pour cette partie du travail, nous avons montré la présence d'un taux basal d'activité d'ERK1/2 (pERK1/2). L'aldostérone et la vasopressine, connus pour stimuler le courant sodique transépithélial dans le CCD, ne changeaient pas le taux basal de pERK1/2. Le transport de sodium transépithélial basal, ou stimulé par l'aldostérone ou la vasopressine est diminué par l'effet de PD98059, un inhibiteur de MEK1/2 qui diminue parallèlement le taux de pERK1/2. Nous avons également montré dans des cellules non stimulées, ou stimulées par de l'aldostérone ou de la vasopressine, que l'activité de la Na+-K+ ATPase, mais pas celle d'ENaC est inhibée par des traitements avec différents inhibiteurs de MEK1/2. Par un marquage de la Na±-K+ATPase à la surface membranaire nous avons montré que la voie d'ERK1/2 contrôle l'activité intrinsèque de la Na+-K+ ATPase, plutôt que son expression à la surface membranaire. Ces données ont montré que l'activité de la Na+-K+ATPase et le transport transépithélial de sodium sont contrôlés par l'activité basal et constitutive de la voie d'ERK1/2. Summary The regulation of sodium reabsorption in the distal nephron (distal tubule and cortical collecting duct) in the kidney plays an essential role in the control of extracellular fluids composition and volume, and thereby blood pressure. In the principal cell of the collecting duct (CCD), the level of sodium reabsorption mainlly depends on the activity of both epithlial sodium channel (ENaC) and sodium-potassium-adenosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). The activity of these two transporters is regulated by hormones especially aldosterone, vasopressin and insuline.In the principal cell of the CCD, vasopressin regulates sodium transport via a short-term effect and a late genomic effect. During the genomic effect vasopressin activates a complex network of vasopressin-dependent genes involved in the regulation of sodium transport as ENaC and Na+-K+ATPase. We were interested in the role of a recently identified vasopressin induced protein (VIP32) and its implication in the regulation of sodium transport in principal cell of the CCD. The Xenopus oocyte expression system revealed two functions : expressed alone VIP32 rapidly induces oocyte meiotic maturation through the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the meiotic promoting factor and when co-expressed with ENaC, V1P32 selectively dowrn-egulates channel activity, but not channel cell surface expression. We have shown that the ENaC downregulation mediated by the activation of the MAPK pathway is related to the PY motif of ENaC. This motif is implicated in ENaC cell surface expression and open probability regulation. In the kidney principal cell, VIP32 through the activation of MAPK pathway may be involved in the downregulation of transepithelial sodium transport observed within a few hours after vasopressin treatment. The collecting duct of normal kidney exhibits significant activity of the MEK1/2-ERK1/2 MAPK pathway. Using in vitro cultured mpkCCDc14 principal cells we have shown a significant basal level of ERK1/2 activity (pERK1/2). Aldosterone and vasopressin, known to upregulate sodium reabsorption in CCDs, did not change ERK1/2 activity. Basal and aldosterone- or vasopressin-stimulated sodium transport were downregulated by the MEK1/2 inhibitor PD98059 in parallel with a decrease in pERK1/2 in vitro. The activity of Na+-K+ATPase but not that of ENaC was inhibited by MEK1/2 inhibitors in both, unstimulated and aldosterone- or vasopressin-stimulated CCDs in vitro. Cell surface labelling showed that intrinsic activity rather than cell surface expression of Na+-K+ATPase was controlled by pERK1/2. Our data demonstrate that basal constitutive activity of ERK1/2 pathway controls Na+-K+ATPase activity and transepithelial sodium transport in the principal cell. Résumé tout public Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale du néphron (l'unité fonctionnelle du rein) ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent de maintenir une pression sanguine effective. Dans les cellules principales du tube collecteur, une région spécifique du néphron distal, le transport de sodium dépend essentiellement de l'activité de deux transporteurs de sodium : le canal épithélial à sodium (ENaC) et la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). Afin de répondre aux besoins de l'organisme, l'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales du tube collecteur, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape rapide et une étape lente dite « génomique ». Durant l'étape lente, la vasopressine régule l'expression de gènes pouvant être impliqués dans le transport de sodium, dont notamment ceux d'ENaC et de la Na+-K+ATPase. Parmi les gènes dont l'expression est augmentée par la vasopressine, celui de VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) fait l'objet de cette étude. Le but de mon travail a été d'étudier, dans un système d'expression hétérologue (l'ovocyte de Xenopus leavis), l'implication de VIP32 dans le transport de sodium. Nous avons montré que VIP32 est capable d'activer un mécanisme moléculaire en cascade appelé MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et est aussi capable de diminuer l'activité d'ENaC. Parallèlement, dans une lignée de cellules principales de tube collecteur les mpkCCDc14, nous avons montré que le taux basal d'activité de la cascade MAPK est capable de réguler l'activité de la Na+-K+ATPase, tandis qu'il n'influence pas l'activité d'ENaC.

Étude de la fonction de GLUT8 sur un modèle de souris "knock-out"

Résumé GLUT8 est la première des nouvelles isoformes des GLUT récemment identifiés. Il est fortement exprimé dans les testicules et plus faiblement dans les blastocystes, le cerveau, particulièrement au niveau de l'hippocampe, et le coeur. En conditions basales, il est retenu dans un compartiment intracellulaire. Si on l'exprime en surface cellulaire, par la mutation du motif d'internalisation dileucine, il transporte le glucose avec une bonne affinité. Dans le but d'étudier sa fonction au niveau de l'organisme, nous avons créé un modèle de knock out conditionnel, en entourant le dernier exon du gène de GLUT8 par deux sites loxP. En croisant nos souris avec une souche de souris transgénique exprimant la cre-recombinase dans les cellules de la lignée germinale, nous avons généré un modèle de souris portant la délétion totale de GLUT8 de manière constitutionnelle. Les statistiques effectuées sur les premières naissances indiquent qu'une partie des souris knock out ne survit pas, suggérant un rôle de GLUT8 au niveau du développement embryonnaire. Les souris qui ont survécu ne présentent toutefois pas d'anomalies durant la croissance et sont fertiles. Elles ont des taux de glucose et d'insuline sanguins normaux. Au niveau cérébral, la structure de l'hippocampe n'est pas modifiée par la suppression de GLUT8, cependant, les souris GLUT8-/- présentent une prolifération cellulaire augmentée dans le gyrus denté. Cette augmentation de division cellulaire pourrait être la réponse adaptée à une éventuelle augmentation de la mort cellulaire au niveau de l'hippocampe. Elles ne semblent toutefois pas présenter de défauts cognitifs majeurs dans le bassin de Morris en conditions normales. Toutefois, en conditions de jeûne, elles tendent à une meilleure mémorisation à court terme. Les études morphologiques et histologiques au niveau cardiaque n'ont pas révélé de d'hypertrophie au niveau ventriculaire. La stimulation de la contraction à l'isoprotérénol n'a pas mis en évidence de défaut d'adaptation des coeurs GLUT8-/-. Cependant l'analyse fonctionnelle par électrocardiogramme, en conditions basales, a montré une augmentation de la durée de l'onde P, suggérant un défaut dans la dépolarisation des oreillettes. Nos résultats indiquent que GLUT8 ne joue pas un rôle prédominant dans la survie et la fonction basale des souris. Il pourrait jouer un rôle plus important dans des situations stressantes pour l'organisme, comme l'hypoglycémie ou les conditions d'ischémie qui induiraient son expression à la membrane plasmique et stimuleraient le captage du glucose. Abstract GLUT8 was the first of the recently identified isoform of the GLUT family proteins. It is strongly expressed in the testis. It is also found at a lower level in the blastocyst, in heart and in the brain. Under basal conditions, it is retained in the intracellular compartment, but when the internalization motif dileucine is mutated, GLUT8 translocates to the plasma membrane and transports glucose with a relatively high affinity. To study its function in vivo, we created a conditional knock out mouse model. To do so, we targeted the last exon of the GLUT8 gene with two loxP sites. We then crossed these mice with a transgenic model expressing the cre-recombinase in the gem' line to generate a constitutional total knock out mouse. The statistics made on the first breedings showed that some of the knock out mice do not survive, suggesting a role of GLUT8 in the embryonic development. Conversely mice who survive do not show developmental defects and they are fertile with normal glucose and insulin blood levels. In the brain, the general structure of the hippocampus is not modified by the deletion of GLUT8. However, GLUT8-/- mice show an increase in the cell proliferation in the dentate gyms. This cell proliferation could be due to an increase in the cell death in the hippocampus. When tested in the morris water maze, these mice do not show any cognitive defects in the basal conditions, but they have a tendency to learn better in fasted conditions. The morphological and histological studies made at the heart level did not show any cardiac hypertrophy in the ventricles. The stimulation with isoproterenol did not show any adaptation defects in the GLUT8-/- hearts. However, the functional analysis made in basal conditions with the electrocardiogram showed an increase in the P wave length, suggesting a defect in the atrial depolarization in the knock out mice. Overall, our results show that GLUT8 does not play an important role in the basal general functions in the mice, but might play a more important role during whole organism stress. Hypoglycaemia or ischemia, for example could stimulate the GLUT8 translocation to the plasma membrane to increase specifically glucose uptake. Résumé tout public Les différentes cellules de l'organisme possèdent des propriétés particulières, qui leur permettent de maintenir les fonctions de l'organe auquel elles appartiennent. La membrane plasmique qui les délimite sélectionne les substances qui vont pénétrer à l'intérieur de la cellule et permet ainsi de maintenir un environnement interne constant. Le glucose est une source d'énergie importante pour la cellule et doit pouvoir pénétrer à l'intérieur de la cellule. Il utilise pour cela des protéines de transport qui le feront passer de part et d'autre de la membrane. Les protéines de la famille des GLUT (pour GLUcose Transporter) possèdent cette capacité. GLUT8 est un membre de la famille des GLUT identifié récemment. Il possède la capacité de transporter le glucose quand il se présente à la surface de la cellule. Il est principalement exprimé dans les testicules, dans le coeur et le cerveau et durant le développement embryonnaire. Son rôle n'est toutefois pas encore défini. Ce travail consiste à étudier la fonction de GLUT8 au niveau de l'organisme entier. Nous avons créé un modèle de souris dans lesquelles l'expression de GLUT8 a été supprimée pour mettre en évidence son importance dans le maintien de l'intégrité des fonctions du corps. Les observations effectuées sur les souris qui n'expriment plus GLUT8 nous indiquent que leurs cellules prolifèrent plus vite au niveau de l'hippocampe. L'hippocampe est une structure située dans le cerveau qui est impliquée dans les phénomènes d'apprentissage. Les souris qui ont été testées dans des tâches d'apprentissage n'ont malgré cela pas montré une amélioration de la mémorisation. Dans le coeur, la suppression de GLUT8 semble présenter un défaut quand on mesure l'activité électrique du coeur par électrocardiogramme. Toutefois, ils fonctionnent normalement et ne présentent pas de défauts morphologiques en conditions normales. Les expériences effectuées sur les modèles de souris indiquent que GLUT8 ne jouerait pas un rôle prédominant dans le fonctionnement normal du corps. Il pourrait exercer sa fonction dans des situations plus particulières comme l'hypoglycémie, où il permettrait une meilleure capacité à transporter le glucose dans les cellules.

Hexyl-aminolevulinate mediated photodynamic therapy: how to spare normal urothelium. An in vitro approach

Résumé Objectifs : La thérapie photodynamique a pour but la destruction sélective du tissu néoplasique par interaction de lumière, d'oxygène et d'une substance photosensibilisatrice (la Protoporphyrine IX dans notre étude). Malgré une accumulation sélective du photosensibilisateur dans le tissu tumoral, la thérapie photodynamique du carcinome urothélial de la vessie peut endommager les cellules normales de l'épithélium urinaire. La prévention de ces lésions est importante pour la régénération de la muqueuse. Notre étude sur un modèle in vitro d'urothélium porcin étudie l'influence de la concentration du photosensibilisateur, des paramètres d'irradiation et de la production d'intermédiaires réactifs de l'oxygène (ROS) sur les effets photodynamique. Le but était de déterminer les conditions seuil pour épargner l'urothélium sain. Méthode: Dans une chambre de culture transparente à deux compartiments, des muqueuses vésicales de porc maintenues en vie ont été incubées avec une solution d'hexyl-aminolévulinate (HAL), le précurseur de la Protoporphyrine IX. Ces muqueuses ont ensuite été irradiées avec des doses lumineuses croissantes en lumière bleue et en lumière blanche, et les altérations cellulaires ont été évaluées par microscopie électronique à balayage et par un colorant fluorescent, le Sytox green. Nous avons également évalué la production d'intermédiaires réactifs de l'oxygène parla mesure de la fluorescence intracellulaire de Rhodamine 123 (R123), produit de l'oxydation de la Dihydrorhodamine 123 (DHR123) non fluorescente. Ces valeurs ont été corrélées avec celles du photo blanchiment de la PAIX. Résultats : Le taux de mortalité cellulaire était dépendant de la concentration de PAIX. Après 3 heures d'incubation, la valeur seuil de dose lumineuse pour la lumière bleu était de 0.15 et 0.75 J/cm2 (irradiance 30 et 75 mW/cm2, respectivement) et pour la lumière blanche de 0.55 J/cm2 (irradiante 30 mW/cm2). Le taux de photo blanchiment était inversement proportionnel à l'irradiante. Le système de détection des intermédiaires réactifs de l'oxygène DHR123/R123 a démontré une bonne corrélation avec les valeurs seuil pour toutes les conditions d'irradiation utilisées. Conclusions : Nous avons déterminé les doses lumineuses permettant d'épargner 50% des cellules urothéliales saines. L'utilisation d'une faible irradiante associée à des systèmes permettant de mesurer la production d'intermédiaires réactifs de l'oxygène dans les tissus irradiés pourrait améliorer la dosimétrie in vivo et l'efficacité de la thérapie photodynamique. Abstract Background and Objectives: Photodynamic therapy of superficial bladder cancer may cause damages to the normal surrounding bladder wall. Prevention of these is important for bladder healing. We studied the influence of photosensitizes concentration, irradiation parameters and production of reactive oxygen species (ROS) on the photodynamically induced damage in the porcine urothelium in vitro. The aim was to determine the threshold conditions for the cell survival. Methods: Living porcine bladder mucosae were incubated with solution of hexylester of 5-aminolevulinic acid (HAL). The mucosae were irradiated with increasing doses and cell alterations were evaluated by scanning electron microscopy and by Sytox green fluorescence. The urothelial survival score was correlated with Protoporphyrin IX (PpIX) photobleaching and intracellular fluorescence of Rhodamine 123 reflecting the ROS production. Results: The mortality ratio was dependent on PpIX concentration. After 3 hours of incubation, the threshold radiant exposures for blue light were 0.15 and 0.75 J/cm2 (irradiance 30 and 75 mW/cm2, respectively) and for white light 0.55 J/cm2 (irradiance 30 mW/cm2). Photobleaching rate increased with decreasing irradiance. Interestingly, the DHR123/R123 reporter system correlated well with the threshold exposures under all conditions used. Conclusions: we have determined radiant exposures sparing half of normal urothelial cells. We propose that the use of low irradiance combined with systems reporting the ROS production in the irradiated tissue could improve the in vivo dosimetry and optimize the PDT.

Strain-transcending Fc-dependent killing of Plasmodium falciparum by merozoite surface protein 2 allele-specific human antibodies.

It is widely accepted that antibody responses against the human parasitic pathogen Plasmodium falciparum protect the host from the rigors of severe malaria and death. However, there is a continuing need for the development of in vitro correlate assays of immune protection. To this end, the capacity of human monoclonal and polyclonal antibodies in eliciting phagocytosis and parasite growth inhibition via Fcγ receptor-dependent mechanisms was explored. In examining the extent to which sequence diversity in merozoite surface protein 2 (MSP2) results in the evasion of antibody responses, an unexpectedly high level of heterologous function was measured for allele-specific human antibodies. The dependence on Fcγ receptors for opsonic phagocytosis and monocyte-mediated antibody-dependent parasite inhibition was demonstrated by the mutation of the Fc domain of monoclonal antibodies against both MSP2 and a novel vaccine candidate, peptide 27 from the gene PFF0165c. The described flow cytometry-based functional assays are expected to be useful for assessing immunity in naturally infected and vaccinated individuals and for prioritizing among blood-stage antigens for inclusion in blood-stage vaccines.

Stringent V beta requirement for the development of NK1.1+ T cell receptor-alpha/beta+ cells in mouse liver.

The liver of C57BL/6 mice contains a major subset of CD4+8- and CD4-8- T cell receptor (TCR)-alpha/beta+ cells expressing the polymorphic natural killer NK1.1 surface marker. Liver NK1.1+TCR-alpha/beta+ (NK1+ T) cells require interaction with beta2-microglobulin-associated, major histocompatibility complex I-like molecules on hematopoietic cells for their development and have a TCR repertoire that is highly skewed to Vbeta8.2, Vbeta7, and Vbeta2. We show here that congenic C57BL/6.Vbeta(a) mice, which lack Vbeta8- expressing T cells owing to a genomic deletion at the Vbeta locus, maintain normal levels of liver NK1+ T cells owing to a dramatic increase in the proportion of cells expressing Vbeta7 and Vbeta2 (but not other Vbetas). Moreover, in C57BL/6 congenic TCR-V Vbeta3 and -Vbeta8.1 transgenic mice (which in theory should not express other Vbeta, owing to allelic exclusion at the TCR-beta locus), endogenous TCR-Vbeta8.2, Vbeta7, and Vbeta2 (but not other Vbetas) are frequently expressed on liver NK1+T cells but absent on lymph node T cells. Finally, when endogenous V beta expression is prevented in TCR-Vbeta3 and Vbeta8.1 transgenic mice (by introduction of a null allele at the C beta locus), the development of liver NK1+T cells is totally abrogated. Collectively, our data indicate that liver NK1+T cells have a stringent requirement for expression of TCR-Vbeta8.2, Vbeta7, or Vbeta2 for their development.

Genetic dissection of c-Myc function during mouse organogenesis

Résumé Le gène c-myc est un des oncogènes les plus fréquemment mutés dans les tumeurs humaines. Même si plus de 70 % des cancers humains montrent une dérégulation de c-Myc, les connaissances sur son rôle physiologique pendant le développement, et dans la souris adulte restent très peu connus. Récemment, notre laboratoire a pu montrer que c-Myc contrôle l'équilibre entre le renouvellement et la différenciation des cellules souches hématopoïetiques (CSH) dans la souris adulte. Ceci est probablement dû à lacapacité de c-Myc de contrôler l'entrée et la sortie des CSH de leur niche de la moelle osseuse, en régulant plusieurs molécules d'adhésion, parmi lesquelles la cadhérine-N (Wilson et al., 2004; Wilson and Trumpp, 2006). Des études utilisant un mutant d'inactivation ont demontré que la protéine c-Myc est essentielle pour le développement au delà du jour embryonnaire E9.5. Les embryons c-Myc déficients sont plus petits que la normale et possèdent de nombreux défauts; en particulier ils ne peuvent établir un système hématopoietique embryonnaire primitif (Trumpp et al., 2001). Nous avons récemment découvert que le développement du placenta dépend de la présence de cMyc. Ceci permet de proposer que certains, sinon tous, les défauts embryonnaires puorraient dériver indirectement d'un défaut nutritionnel causé par la défaillance du placenta. Afin de répondre à cette question de manière génétique, nous avons utilisé l'allele conditionel c-mycflox (Trumpp et al., 2001) en combinaison avec l'allele Sox2-Cre (Hayashi et al., 2002). Celui-ci détermine l'expression de la récombinase Cre spécifiquement dans les cellules de l'épiblaste à partir de E6.5, tandis qu'il n'y a pas, ou seulement très peu, d'activité de la récombinase Cre dans les tissus extraembryonnaires.Alnsi, cette stratégie nous permet de générer des embryons sans c-Myc qui se développent en présence d'un compartment extraembryonnaire ou c-Myc est exprimé normalement (Sox2Cre;c-mycflox2) Ces embryons, Sox2Cre;c-mycflox2 se développent et grandissent normalement tout en formant un système vasculaire normal, mais meurent à E11.5 à cause d'un sévère manque de cellules hématopoïetiques. De façon très intéressante, la seule population qui semble être présente en nombre à peu près normal dans ces embryons est celle des précurseurs et des cellules souches. Les cellules qui forment cette population prolifèrent normalement mais ne peuvent pas former des colonies in vitro, ce qui montre que ces cellules ont perdu leur activité de cellules souches. Cependant, lorsque nous avons analysé ces cellules plus en détail en éxaminant l'expression des molécules d'intégrine nous avons découvert que l'integrine ß est sur-éxprimée à la surface des cellules c-Myc déficientes. Ceci pourrait indiquer un mécanisme par lequel c-Myc régule des molécules d'adhésion sur les cellules du sang. En conséquence, en absence de c-Myc, l'adhésion et la migration des cellules du sang de l'AGM (Aorte-Gonade-Mésonéphros) vers le foie de l'embryon, à travers le système vasculaire, est compromise. En outre, nous avons pu montrer que les hépatocytes du foie, qui constitue le site principal de formation des cellules hématopoïetiques pendant le développement, est sévèrement atteint dans des Sox2Cre;c-mycflox2 embryons. Ceci n'est pas du à un défaut propre aux cellules hépatiques qui ont perdu c-Myc, mais résulte plutôt de l'absence de cellules hématopoietïques qui normalement colonisent le foie à ce stade du développement. Ces résultats représentent la première preuve directe que le développement des hépatoblastes est dépendant de signaux provenant des cellules du sang. Summary The myc gene is one of the most frequently mutated oncogenes in human tumors. It is found to be mis-regulated in over 70% of all human cancers. However, our knowledge about its physiological role in mammalian development and adulthood remains limited. Recent work in our laboratory showed that c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal and differentiation in the adult mouse. This is likely due to the capacity of c-Myc to control entry and exit of HSCs from the bone marrow niche by regulating a number of cell adhesion molecules including N-cadherin (Wilson et al., 2004; Wilson and Trumpp 2006). During development knockout studies showed that c-Myc is required for embryonic development beyond embryonic day (E) 9.5. c-Myc deficient embryos are severely reduced in size and show multiple defects including the failure to establish a primitive hematopoietic system (Trumpp et al., 2001). Importantly, we recentry uncovered that placental development also seems to depend on normal c-Myc function, raising the possibility that some if not all of the embryonic defects observed could be mediated indirectly by a nutrition defect caused by placental failure. To address this possibility genetically, we took advantage of the conditional c-mycflox allele (Trumpp et al., 2001) in combination with the Sox2-Cre allele (Hayashi et al., 2002), in which Cre expression is specifically targeted to all epiblast cells by E6.5, while there is little or no Cre activity inextra-embryonic lineages. Thus, this strategy allows the generation of c-Myc deficient embryos, which develop within a normal c-Myc expressing extra-embryonic compartment (Sox2Cre;c-mycflox2) Such Sox2Cre;c-mycflox2 embryos develop and grow appropriately and form a normal vascular system but die at E11.5 due to a severe lack of blood cells. Interestingly, the only hematopoietic population that seems to be present in almost normal numbers in the embryo is the stem/progenitor cell population. Cells within this populatíon proliferate normal but can not give rise to hematopoietic colonies in vitro showing that functional hematopoietic stem cell (HSC) activity is lost. However, when we analyzed these phenotypic HSCs in more detail and examined integrin expression in mutant stem/progenitor cells, we observed that ß1-integrin is upregulated. This may point to a potential mechanism whereby c-Myc regulates adhesíon molecules on hematopoietic cells and thereby disturbs adhesion and migration from the AGM (aorta-gonads-mesonephros) through the vascular system to the liver. Furthermore, we uncovered that the fetal liver, the main site of hematopoietic expansion at that stage, is severely affected in Sox2Cre;c-mycflox2 embryos and that this is not due to a cell intrinsic defect of c-Myc deficient hepatocytes but rather due to the lack of hematopoietic cells that normally colonize the fetal liver at that stage of development. This provides first direct evidence that hepatoblast development depends on signals derived from blood cells.

Airway surface liquid volume regulation determines different airway phenotypes in liddle compared with betaENaC-overexpressing mice.

Studies in cystic fibrosis patients and mice overexpressing the epithelial Na(+) channel beta-subunit (betaENaC-Tg) suggest that raised airway Na(+) transport and airway surface liquid (ASL) depletion are central to the pathogenesis of cystic fibrosis lung disease. However, patients or mice with Liddle gain-of-function betaENaC mutations exhibit hypertension but no lung disease. To investigate this apparent paradox, we compared the airway phenotype (nasal versus tracheal) of Liddle with CFTR-null, betaENaC-Tg, and double mutant mice. In mouse nasal epithelium, the region that functionally mimics human airways, high levels of CFTR expression inhibited Liddle epithelial Nat channel (ENaC) hyperfunction. Conversely, in mouse trachea, low levels of CFTR failed to suppress Liddle ENaC hyperfunction. Indeed, Na(+) transport measured in Ussing chambers ("flooded" conditions) was raised in both Liddle and betaENaC-Tg mice. Because enhanced Na(+) transport did not correlate with lung disease in these mutant mice, measurements in tracheal cultures under physiologic "thin film" conditions and in vivo were performed. Regulation of ASL volume and ENaC-mediated Na(+) absorption were intact in Liddle but defective in betaENaC-Tg mice. We conclude that the capacity to regulate Na(+) transport and ASL volume, not absolute Na(+) transport rates in Ussing chambers, is the key physiologic function protecting airways from dehydration-induced lung disease.

Identification of the SPLUNC1 ENaC-inhibitory domain yields novel strategies to treat sodium hyperabsorption in cystic fibrosis airway epithelial cultures.

The epithelial sodium channel (ENaC) is responsible for Na(+) and fluid absorption across colon, kidney, and airway epithelia. Short palate lung and nasal epithelial clone 1 (SPLUNC1) is a secreted, innate defense protein and an autocrine inhibitor of ENaC that is highly expressed in airway epithelia. While SPLUNC1 has a bactericidal permeability-increasing protein (BPI)-type structure, its NH2-terminal region lacks structure. Here we found that an 18 amino acid peptide, S18, which corresponded to residues G22-A39 of the SPLUNC1 NH2 terminus inhibited ENaC activity to a similar degree as full-length SPLUNC1 (∼2.5 fold), while SPLUNC1 protein lacking this region was without effect. S18 did not inhibit the structurally related acid-sensing ion channels, indicating specificity for ENaC. However, S18 preferentially bound to the βENaC subunit in a glycosylation-dependent manner. ENaC hyperactivity is contributory to cystic fibrosis (CF) lung disease. Unlike control, CF human bronchial epithelial cultures (HBECs) where airway surface liquid (ASL) height was abnormally low (4.2 ± 0.6 μm), addition of S18 prevented ENaC-led ASL hyperabsorption and maintained CF ASL height at 7.9 ± 0.6 μm, even in the presence of neutrophil elastase, which is comparable to heights seen in normal HBECs. Our data also indicate that the ENaC inhibitory domain of SPLUNC1 may be cleaved away from the main molecule by neutrophil elastase, suggesting that it may still be active during inflammation or neutrophilia. Furthermore, the robust inhibition of ENaC by the S18 peptide suggests that this peptide may be suitable for treating CF lung disease.

Intracortical connectivity of layer VI pyramidal neurons in the somatosensory cortex of normal and barrelless mice.

In mice, barrels in layer IV of the somatosensory cortex correspond to the columnar representations of whisker follicles. In barrelless (BRL) mice, barrels are absent, but functionally, a columnar organization persists. Previously we characterized the aberrant geometry of thalamic projection of BRL mice using axonal reconstructions of individual neurons. Here we proceeded with the analysis of the intracortical projections from layer VI pyramidal neurons, to assess their contribution to the columnar organization. From series of tangential sections we reconstructed the axon collaterals of individual layer VI pyramidal neurons in the C2 barrel column that were labelled with biocytin [controls from normal (NOR) strain, 19 cells; BRL strain, nine cells]. Using six morphological parameters in a cluster analysis, we showed that layer VI neurons in NOR mice are distributed into four clusters distinguished by the radial and tangential extent of their intracortical projections. These clusters correlated with the cortical or subcortical projection of the main axon. In BRL mice, neurons were distributed within the same four clusters, but their projections to the granular and supragranular layers were significantly smaller and their tangential projection was less columnar than in NOR mice. However, in both strains the intracortical projections had a preference for the appropriate barrel column (C2), indicating that layer VI pyramidal cells could participate in the functional columnar organization of the barrel cortex. Correlative light and electron microscopy analyses provided morphometric data on the intracortical synaptic boutons and synapses of layer VI pyramidal neurons and revealed that projections to layer IV preferentially target excitatory dendritic spines and shafts.

Rapid profiling of intact glucosinolates in Arabidopsis leaves by UHPLC-QTOFMS using a charged surface hybrid column.

INTRODUCTION: The analysis of glucosinolates (GS) is traditionally performed by reverse-phase liquid chromatography coupled to ultraviolet detection after a time-consuming desulphation step, which is required for increased retention. Simpler and more efficient alternative methods that can shorten both sample preparation and analysis are much needed. OBJECTIVE: To evaluate the feasibility of using ultrahigh-pressure liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-QTOFMS) for the rapid profiling of intact GS. METHODOLOGY: A simple and short extraction of GS from Arabidopsis thaliana leaves was developed. Four sub-2 µm reverse-phase columns were tested for the rapid separation of these polar compounds using formic acid as the chromatographic additive. High-resolution QTOFMS was used to detect and identify GS. RESULTS: A novel charged surface hybrid (CSH) column was found to provide excellent retention and separation of GS within a total running time of 11 min. Twenty-one GS could be identified based on their accurate mass as well as isotopic and fragmentation patterns. The method was applied to determine the changes in GS content that occur after herbivory in Arabidopsis. In addition, we evaluated its applicability to the profiling of other Brassicaceae species. CONCLUSION: The method developed can profile the full range of GS, including the most polar ones, in a shorter time than previous methods, and is highly compatible with mass spectrometric detection.

Normal weight obesity: relationship with lipids, glycaemic status, liver enzymes and inflammation

BACKGROUND AND AIMS: Normal weight obesity (NWO) is defined as an excessive body fat associated with a normal body mass index (BMI) and has been associated with early inflammation, but its relationship with cardiovascular risk factors await investigation. METHODS AND RESULTS: Cross-sectional study including 3213 women and 2912 men aged 35-75 years to assess the clinical characteristics of NWO in Lausanne, Switzerland. Body fat was assessed by bioimpedance. NWO was defined as a BMI<25 kg/m(2) and a % body fat ≥66(th) gender-specific percentiles. The prevalence of NWO was 5.4% in women and less than 3% in men, so the analysis was restricted to women. NWO women had a higher % of body fat than overweight women. After adjusting for age, smoking, educational level, physical activity and alcohol consumption, NWO women had higher blood pressure and lipid levels and a higher prevalence of dyslipidaemia (odds-ratio=1.90 [1.34-2.68]) and fasting hyperglycaemia (odds-ratio=1.63 [1.10-2.42]) than lean women, whereas no differences were found between NWO and overweight women. Conversely, no differences were found between NWO and lean women regarding levels of CRP, adiponectin and liver markers (alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and gamma glutamyl transferase). Using other definitions of NWO led to similar conclusions, albeit some differences were no longer significant. CONCLUSION: NWO is almost nonexistent in men. Women with NWO present with higher cardiovascular risk factors than lean women, while no differences were found for liver or inflammatory markers. Specific screening of NWO might be necessary in order to implement cardiovascular prevention.