Sox4 participates in the modulation of Schwann cell myelination.

In order to identify new regulators of Schwann cell myelination potentially playing a role in peripheral nervous system (PNS) pathologies, we analysed gene expression profiling data from three mouse models of demyelinating neuropathies and from the developing PNS. This analysis revealed that Sox4, which encodes a member of the Sry-related high-mobility group box protein family, was consistently upregulated in all three analysed models of neuropathy. Moreover, Sox4 showed a peak in its expression during development that corresponded with the onset of myelination. To gain further insights into the role of Sox4 in PNS development, we generated a transgenic mouse that specifically overexpresses Sox4 in Schwann cells. Sox4 overexpression led to a temporary delay in PNS myelination without affecting axonal sorting. Importantly, we observed that, whereas Sox4 mRNA could be efficiently overexpressed, Sox4 protein expression in Schwann cells was strictly regulated. Finally, our data showed that enforced expression of Sox4 in the mouse model for Charcot-Marie-Tooth 4C aggravated its neuropathic phenotype. Together, these observations reveal that Sox4 contributes to the regulation of Schwann cell myelination, and also indicates its involvement in the pathophysiology of peripheral neuropathies.

Dual and Opposite Effects of hRAD51 Chemical Modulation on HIV-1 Integration.

The cellular DNA repair hRAD51 protein has been shown to restrict HIV-1 integration both in vitro and in vivo. To investigate its regulatory functions, we performed a pharmacological analysis of the retroviral integration modulation by hRAD51. We found that, in vitro, chemical activation of hRAD51 stimulates its integration inhibitory properties, whereas inhibition of hRAD51 decreases the integration restriction, indicating that the modulation of HIV-1 integration depends on the hRAD51 recombinase activity. Cellular analyses demonstrated that cells exhibiting high hRAD51 levels prior to de novo infection are more resistant to integration. On the other hand, when hRAD51 was activated during integration, cells were more permissive. Altogether, these data establish the functional link between hRAD51 activity and HIV-1 integration. Our results highlight the multiple and opposite effects of the recombinase during integration and provide new insights into the cellular regulation of HIV-1 replication.

Modulation de la douleur neuropathique par l'utilisation d'un vecteur viral adéno-associé recombinant et ARN interférent

Une lésion nerveuse périphérique est susceptible d'engendrer une douleur neuropathique caractérisée par des changements d'expression génique dans les neurones nociceptifs des ganglions spinaux. Parmi ces modifications, on note une augmentation transcriptionnelle du gène codant pour la guanosine triphosphate cyclohydrolase 1 (GCH1) considérée comme modulateur clé des douleurs neuropathiques périphériques1. La surexpression de la GCH1 induit alors une hausse de la concentration de la tétrahydrobiopterin (BH4), un cofacteur essentiel pour la production de catécholamines, de sérotonine et d'oxide nitrique dans les ganglions spinaux. La surexpression de ce cofacteur induit la production de ces neurotransmetteurs et contribue à l'augmentation de la sensibilité douloureuse. Dans ce travail, j'ai modulé l'expression de GCH1 par l'utilisation d'un vecteur viral adéno-associé. Tout d'abord, j'ai testé in vitro dans des cellules PC12 différentes molécules d'ARN interfèrent permettant la régulation négative de GCH1. Les cellules PC 12 contiennent constitutionnellement la GCH1 et sont donc intéressantes afin de tester et sélectionner un plasmide permettant une régulation négative efficace de cette molécule in vitro. Cela m'a permis de choisir après sélection de cellules par FACS et quantification protéique par Western blot les meilleurs sh-ARN à utiliser tant pour la régulation négative de GCH1 que pour le vecteur contrôle. J'ai ensuite co- transfecté ces plasmides avec le plasmide pDF6 dans des cellules HEK293T pour la production de mon vecteur viral (rAAV2/6) permettant la régulation négative de la GCH1 ainsi que de mon vecteur contrôle. Après avoir étudié deux voies d'injection chez le rat (dans le nerf sciatique et en intrathécal), j'ai retenu la voie intrathécale comme ayant le meilleur taux de transduction de mon vecteur viral au niveau des ganglions spinaux. Utiliser cette voie d'injection pour mon vecteur permet de cibler plus particulièrement les neurones nociceptifs des ganglions spinaux. J'ai ensuite étudié la modulation de la GCH1 et sa répercussion sur le développement et le maintien des douleurs neuropathiques dans le modèle animal « spared nerve injury » (SNI). Je n'ai pas obtenu de diminution de douleur ni au niveau comportemental ni au niveau moléculaire chez le rat. Ayant répété l'expérience chez la souris, j'ai obtenu une diminution significative de l'expression de la GCH1 au niveau de l'ARN messager. Je n'ai pas étudié l'efficacité de mon vecteur in vivo chez la souris car un autre groupe m'a devancé dans cette expérience et a publié une étude similaire montrant une régulation négative et efficace de la GCH1 sur les symptômes de douleur neuropathique. Mes résultats, associés à cette publication, démontrent la validité de mon hypothèse de départ et ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques en prenant comme cible la production de BH4.

β-Adrenergic modulation of skeletal muscle contraction: key role of excitation-contraction coupling.

Our aim is to describe the acute effects of catecholamines/β-adrenergic agonists on contraction of non-fatigued skeletal muscle in animals and humans, and explain the mechanisms involved. Adrenaline/β-agonists (0.1-30 μm) generally augment peak force across animal species (positive inotropic effect) and abbreviate relaxation of slow-twitch muscles (positive lusitropic effect). A peak force reduction also occurs in slow-twitch muscles in some conditions. β2 -Adrenoceptor stimulation activates distinct cyclic AMP-dependent protein kinases to phosphorylate multiple target proteins. β-Agonists modulate sarcolemmal processes (increased resting membrane potential and action potential amplitude) via enhanced Na(+) -K(+) pump and Na(+) -K(+) -2Cl(-) cotransporter function, but this does not increase force. Myofibrillar Ca(2+) sensitivity and maximum Ca(2+) -activated force are unchanged. All force potentiation involves amplified myoplasmic Ca(2+) transients consequent to increased Ca(2+) release from sarcoplasmic reticulum (SR). This unequivocally requires phosphorylation of SR Ca(2+) release channels/ryanodine receptors (RyR1) which sensitize the Ca(2+) -induced Ca(2+) release mechanism. Enhanced trans-sarcolemmal Ca(2+) influx through phosphorylated voltage-activated Ca(2+) channels contributes to force potentiation in diaphragm and amphibian muscle, but not mammalian limb muscle. Phosphorylation of phospholamban increases SR Ca(2+) pump activity in slow-twitch fibres but does not augment force; this process accelerates relaxation and may depress force. Greater Ca(2+) loading of SR may assist force potentiation in fast-twitch muscle. Some human studies show no significant force potentiation which appears to be related to the β-agonist concentration used. Indeed high-dose β-agonists (∼0.1 μm) enhance SR Ca(2+) -release rates, maximum voluntary contraction strength and peak Wingate power in trained humans. The combined findings can explain how adrenaline/β-agonists influence muscle performance during exercise/stress in humans.

Fast oscillatory activity in the anterior cingulate cortex: dopaminergic modulation and effect of perineuronal net loss.

Dopamine release in the prefrontal cortex plays a critical role in cognitive function such as working memory, attention and planning. Dopamine exerts complex modulation on excitability of pyramidal neurons and interneurons, and regulates excitatory and inhibitory synaptic transmission. Because of the complexity of this modulation, it is difficult to fully comprehend the effect of dopamine on neuronal network activity. In this study, we investigated the effect of dopamine on local high-frequency oscillatory neuronal activity (in β band) in slices of the mouse anterior cingulate cortex (ACC). We found that dopamine enhanced the power of these oscillations induced by kainate and carbachol, but did not affect their peak frequency. Activation of D2R and in a lesser degree D1R increased the oscillation power, while activation of D4R had no effect. These high-frequency oscillations in the ACC relied on both phasic inhibitory and excitatory transmission and functional gap junctions. Thus, dopamine released in the ACC promotes high-frequency synchronized local cortical activity which is known to favor information transfer, fast selection and binding of distributed neuronal responses. Finally, the power of these oscillations was significantly enhanced after degradation of the perineuronal nets (PNNs) enwrapping most parvalbumin interneurons. This study provides new insights for a better understanding of the abnormal prefrontal gamma activity in schizophrenia (SZ) patients who display prefrontal anomalies of both the dopaminergic system and the PNNs.

Modulation of the glutamatergic transmission by Dopamine: a focus on Parkinson, Huntington and Addiction diseases.

Dopamine (DA) plays a major role in motor and cognitive functions as well as in reward processing by regulating glutamatergic inputs. In particular in the striatum the release of DA rapidly influences synaptic transmission modulating both AMPA and NMDA receptors. Several neurodegenerative and neuropsychiatric disorders, including Parkinson, Huntington and addiction-related diseases, manifest a dysregulation of glutamate and DA signaling. Here, we will focus our attention on the mechanisms underlying the modulation of the glutamatergic transmission by DA in striatal circuits.

Characterization of local and systemic immune-modulation in melanoma patients

Le mélanome cutané est un des cancers les plus agressifs et dont l'incidence augmente le plus en Suisse. Une fois métastatique, le pronostic de survie moyenne avec les thérapies actuelles est d'environ huit mois, avec moins de 5% de survie à cinq ans. Les récents progrès effectués dans la compréhension de la biologie de la cellule tumorale mais surtout dans l'importance du système immunitaire dans le contrôle de ce cancer ont permis le développement de nouveaux traitements novateurs et prometteurs. Ces thérapies, appelées immunothérapies, reposent sur la stimulation et l'augmentation de la réponse immunitaire à la tumeur. Alors que les derniers essais cliniques ont démontré l'efficacité de ces traitements chez les patients avec des stades avancés de la maladie, le contrôle de la maladie à long- terme est seulement atteint chez une minorité des patients. La suppression locale et systémique de la réponse immunitaire spécifique anti-tumorale apparaitrait comme une des raisons expliquant la persistance d'un mauvais pronostic clinique chez ces patients. Des études sur les souris ont montré que les vaisseaux lymphatiques joueraient un rôle primordial dans ce processus en induisant une tolérance immune, ce qui permettrait à la tumeur d'échapper au contrôle du système immunitaire et métastatiser plus facilement. Ces excitantes découvertes n'ont pas encore été établi et prouvé chez l'homme. Dans cette thèse, nous montrons pour la première fois que les vaisseaux lymphatiques sont directement impliqués dans la modulation de la réponse immunitaire au niveau local et systémique dans le mélanome chez l'homme. Ces récentes découvertes montrent le potentiel de combiner des thérapies visant le système lymphatique avec les immunothérapies actuellement utilisées afin d'améliorer le pronostic des patients atteint du mélanome. -- Cutaneous melanoma is one of the most invasive and metastatic human cancers and causes 75% of skin cancer mortality. Current therapies such as surgery and chemotherapy fail to control metastatic disease, and relapse occurs frequently due to microscopic residual lesions. It is, thus, essential to develop and optimize novel therapeutic strategies to improve curative responses in these patients. In recent decades, tumor immunologists have revealed the development of spontaneous adaptive immune responses in melanoma patients, leading to the accumulation of highly differentiated tumor-specific T cells at the tumor site. This remains one of the most powerful prognostic markers to date. Immunotherapies that augment the natural function of these tumor-specific T cells have since emerged as highly attractive therapeutic approaches to eliminate melanoma cells. While recent clinical trials have demonstrated great progress in the treatment of advanced stage melanoma, long-term disease control is still only achieved in a minority of patients. Local and systemic immune suppression by the tumor appears to be responsible, in part, for this poor clinical evolution. These facts underscore the need for a better analysis and characterization of immune- related pathways within the tumor microenvironment (TME), as well as at the systemic level. The overall goal of this thesis is, thus, to obtain greater insight into the complexity and heterogeneity of the TME in human melanoma, as well as to investigate immune modulation beyond the TME, which ultimately influences the immune system throughout the whole body. To achieve this, we established two main objectives: to precisely characterize local and systemic immune modulation (i) in untreated melanoma patients and (ii) in patients undergoing peptide vaccination or checkpoint blockade therapy with anti-cytotoxic T- lymphocyte-asisctaed protein-4 (CTLA-4) antibody. In the first and main part of this thesis, we analyzed lymphatic vessels in relation to anti-tumor immune responses in tissues from vaccinated patients using a combination of immunohistochemistry (IHC) techniques, whole slide scanning/analysis, and an automatic quantification system. Strikingly, we found that increased lymphatic vessel density was associated with high expression of immune suppressive molecules, low functionality of tumor-infiltrating CD8+ T cells and decreased cytokine production by tumor-antigen specific CD8+ T cells in the blood. These data revealed a previously unappreciated local and systemic role of lymphangiogenesis in modulating T cell responses in human cancer and support the use of therapies that target lymphatic vessels combined with existing and future T cell based therapies. In the second objective, we describe a metastatic melanoma patient who developed pulmonary sarcoid-like granulomatosis following repetitive vaccination with peptides and CpG. We demonstrated that the onset of this pulmonary autoimmune adverse event was related to the development of a strong and long-lasting tumor-specific CD8+ T cell response. This constitutes the first demonstration that a new generation tumor vaccine can induce the development of autoimmune adverse events. In the third objective, we assessed the use of Fourier Transform Infrared (FTIR) imaging to identify melanoma cells and lymphocyte subpopulations in lymph node (LN) metastasis tissues, thanks to a fruitful collaboration with researchers in Brussels. We demonstrated that the different cell types in metastatic LNs have different infrared spectral features allowing automated identification of these cells. This technic is therefore capable of distinguishing known and novel biological features in human tissues and has, therefore, significant potential as a tool for histopathological diagnosis and biomarker assessment. Finally, in the fourth objective, we investigated the role of colony- stimulating factor-1 (CSF-1) in modulating the anti-tumor response in ipilimumab-treated patients using IHC and in vitro co-cultures, revealing that melanoma cells produce CSF-1 via CTL-derived cytokines when attacked by cytotoxic T lymphocytes (CTLs), resulting in the recruitment of immunosuppressive monocytes. These findings support the combined use of CSF-1R blockade with T cell based immunotherapy for melanoma patients. Taken together, our results reveal the existence of novel mechanisms of immune modulation and thus promote the optimization of combination immunotherapies against melanoma. -- Le mélanome cutané est un des cancers humains les plus invasifs et métastatiques et est responsable de 75% de la mortalité liée aux cancers de la peau. Les thérapies comme la chirurgie et la chimiothérapie ont échoué à contrôler le mélanome métastatique, par ailleurs les rechutes sous ces traitements ont été montrées fréquentes. Il est donc essentiel de développer et d'optimiser de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer les réponses thérapeutiques de ces patients. Durant les dernières décennies, les immunologistes spécialisés dans les tumeurs ont démontré qu'un patient atteint du mélanome pouvait développer spontanément une réponse immune adaptative à sa tumeur et que l'accumulation de cellules T spécifiques tumorales au sein même de la tumeur était un des plus puissants facteurs pronostiques. Les immunothérapies qui ont pour but d'augmenter les fonctions naturelles de ces cellules T spécifiques tumorales ont donc émergé comme des approches thérapeutiques très attractives pour éliminer les cellules du mélanome. Alors que les derniers essais cliniques ont démontré un progrès important dans le traitement des formes avancées du mélanome, le contrôle de la maladie à long-terme est seulement atteint chez une minorité des patients. La suppression immune locale et systémique apparaitrait comme une des raisons expliquant la persistance d'un mauvais pronostic clinique chez ces patients. Ces considérations soulignent la nécessité de mieux analyser et caractériser les voies immunitaires non seulement au niveau local dans le microenvironement tumoral mais aussi au niveau systémique dans le sang des patients. Le but de cette thèse est d'obtenir une plus grande connaissance de la complexité et de l'hétérogénéité du microenvironement tumoral dans les mélanomes mais aussi d'investiguer la modulation immunitaire au delà du microenvironement tumoral au niveau systémique. Afin d'atteindre ce but, nous avons établi deux objectifs principaux : caractériser précisément la modulation locale et systémique du système immunitaire (i) chez les patients atteints du mélanome qui n'ont pas reçu de traitement et (ii) chez les patients qui ont été traités soit par des vaccins soit par des thérapies qui bloquent les points de contrôles. Dans la première et majeure partie de cette thèse, nous avons analysé les vaisseaux lymphatiques en relation avec la réponse immunitaire anti-tumorale dans les tissus des patients vaccinés grâce à des techniques d'immunohistochimie et de quantification informatisé et automatique des marquages. Nous avons trouvé qu'une densité élevée de vaisseaux lymphatiques dans la tumeur était associée à une plus grande expression de molécules immunosuppressives ainsi qu'à une diminution de la fonctionnalité des cellules T spécifiques tumoral dans la tumeur et dans le sang des patients. Ces résultats révèlent un rôle jusqu'à là inconnu des vaisseaux lymphatiques dans la modulation directe du système immunitaire au niveau local et systémique dans les cancers de l'homme. Cette recherche apporte finalement des preuves du potentiel de combiner des thérapies visant le système lymphatique avec des autres immunothérapies déjà utilisées en clinique. Dans le second objectif, nous rapportons le cas d'un patient atteint d'un mélanome avec de multiples métastases qui a développé à la suite de plusieurs vaccinations répétées et consécutives avec des peptides et du CpG, un évènement indésirable sous la forme d'une granulomatose pulmonaire sarcoid-like. Nous avons démontré que l'apparition de cet évènement était intimement liée au développement d'une réponse immunitaire durable et spécifique contre les antigènes de la tumeur. Par là- même, nous prouvons pour la première fois que la nouvelle génération de vaccins est aussi capable d'induire des effets indésirables auto-immuns. Pour le troisième objectif, nous avons voulu savoir si l'utilisation de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) était capable d'identifier les cellules du mélanome ainsi que les différents sous-types cellulaires dans les ganglions métastatiques. Grâce à nos collaborateurs de Bruxelles, nous avons pu établir que les diverses composantes cellulaires des ganglions atteints par des métastases du mélanome présentaient des spectres infrarouges différents et qu'elles pouvaient être identifiées d'une façon automatique. Cette nouvelle technique permettrait donc de distinguer des caractéristiques biologiques connues ou nouvelles dans les tissus humains qui auraient des retombées pratiques importantes dans le diagnostic histopathologique et dans l'évaluation des biomarqueurs. Finalement dans le dernier objectif, nous avons investigué le rôle du facteur de stimulation des colonies (CSF-1) dans la modulation de la réponse immunitaire anti-tumorale chez les patients qui ont été traités par l'Ipilimumab. Nos expériences in vivo au niveau des tissus tumoraux et nos co-cultures in vitro nous ont permis de démontrer que les cytokines secrétées par les cellules T spécifiques anti-tumorales induisaient la sécrétion de CSF-1 dans les cellules du mélanome ce qui résultait en un recrutement de monocytes immunosuppresseurs. Dans son ensemble, cette thèse révèle donc l'existence de nouveaux mécanismes de modulation de la réponse immunitaire anti-tumorale et propose de nouvelles optimisations de combinaison d'immunothérapies contre le mélanome.