In vivo conditional Pax4 overexpression in mature islet β-cells prevents stress-induced hyperglycemia in mice.

OBJECTIVE To establish the role of the transcription factor Pax4 in pancreatic islet expansion and survival in response to physiological stress and its impact on glucose metabolism, we generated transgenic mice conditionally and selectively overexpressing Pax4 or a diabetes-linked mutant variant (Pax4R129 W) in β-cells. RESEARCH DESIGN AND METHODS Glucose homeostasis and β-cell death and proliferation were assessed in Pax4- or Pax4R129 W-overexpressing transgenic animals challenged with or without streptozotocin. Isolated transgenic islets were also exposed to cytokines, and apoptosis was evaluated by DNA fragmentation or cytochrome C release. The expression profiles of proliferation and apoptotic genes and β-cell markers were studied by immunohistochemistry and quantitative RT-PCR. RESULTS Pax4 but not Pax4R129 W protected animals against streptozotocin-induced hyperglycemia and isolated islets from cytokine-mediated β-cell apoptosis. Cytochrome C release was abrogated in Pax4 islets treated with cytokines. Interleukin-1β transcript levels were suppressed in Pax4 islets, whereas they were increased along with NOS2 in Pax4R129 W islets. Bcl-2, Cdk4, and c-myc expression levels were increased in Pax4 islets while MafA, insulin, and GLUT2 transcript levels were suppressed in both animal models. Long-term Pax4 expression promoted proliferation of a Pdx1-positive cell subpopulation while impeding insulin secretion. Suppression of Pax4 rescued this defect with a concomitant increase in pancreatic insulin content. CONCLUSIONS Pax4 protects adult islets from stress-induced apoptosis by suppressing selective nuclear factor-κB target genes while increasing Bcl-2 levels. Furthermore, it promotes dedifferentiation and proliferation of β-cells through MafA repression, with a concomitant increase in Cdk4 and c-myc expression.

Impaired glucose homeostasis in mice lacking the alpha1b-adrenergic receptor subtype.

To assess the role of the alpha1b-adrenergic receptor (AR) in glucose homeostasis, we investigated glucose metabolism in knockout mice deficient of this receptor subtype (alpha1b-AR-/-). Mutant mice had normal blood glucose and insulin levels, but elevated leptin concentrations in the fed state. During the transition to fasting, glucose and insulin blood concentrations remained markedly elevated for at least 6 h and returned to control levels after 24 h whereas leptin levels remained high at all times. Hyperinsulinemia in the post-absorptive phase was normalized by atropine or methylatropine indicating an elevated parasympathetic activity on the pancreatic beta cells, which was associated with increased levels of hypothalamic NPY mRNA. Euglycemic clamps at both low and high insulin infusion rates revealed whole body insulin resistance with reduced muscle glycogen synthesis and impaired suppression of endogenous glucose production at the low insulin infusion rate. The liver glycogen stores were 2-fold higher in the fed state in the alpha1b-AR-/- compared with control mice, but were mobilized at the same rate during the fed to fast transition or following glucagon injections. Finally, high fat feeding for one month increased glucose intolerance and body weight in the alpha1b-AR-/-, but not in control mice. Altogether, our results indicate that in the absence of the alpha1b-AR the expression of hypotalamic NPY and the parasympathetic nervous activity are both increased resulting in hyperinsulinemia and insulin resistance as well as favoring obesity and glucose intolerance development during high fat feeding.

Traitement de l'information sensorielle chez la souris HeCo

L'hétérotopie sous-corticale en bandes ou double-cortex est une malformation cérébrale causée par une interruption de la migration des neurones du néocortex pendant sa formation. La souris HeCo est un modèle murin de cette affection, caractérisée par un amas de neurones corticaux dans la substance blanche sous-corticale. Les signes cliniques de cette maladie sont le plus souvent une épilepsie réfractaire, un retard développemental et mental. Chez l'homme, l'hétérotopie se trouve en partie en profondeur du cortex somatotopique moteur et sensitif et semble participer à leurs fonctions. L'IRM fonctionnelle a montré lors d'une tâche motrice (taper des doigts), l'activation en plus du cortex moteur controlatéral du cortex hétérotopique sous-jacent. La pathogenèse des malformations corticales est toujours mal comprise, c'est pourquoi il est important d'avoir plusieurs modèles animaux. Jusqu'il a peu, il n'existait que le rat TISH, découvert en 1997, dont la génétique n'est pas connue à ce jour. La souris HeCo est un nouveau modèle animal de malformation corticale dont le gène muté impliquant une protéine associée aux microtubules a été découvert récemment. Elle partage avec les cas humains un seuil épileptique abaissé et un certain retard développemental. Objectif : Déterminer si le cortex hétérotopique de la souris HeCo est activé lors d'une tâche sensitive (exploration de l'environnement à l'aide des vibrisses du museau). Méthode : Chez la souris, les vibrisses sont des organes sensitifs essentiels dans l'exploration de l'environnement. Pour déterminer si le cortex hétérotopique est actif lors d'une tâche sensitive, on utilisera donc un exercice de découverte d'une cage enrichie en stimulus. Afin de visualiser les régions du cerveau actives, on utilisera plusieurs méthodes: l'autoradiographie ([14C]2- deoxyglucose, 2-DG) et l'immunohistochimie c-Fos. Le 2-DG est un analogue du glucose qui se fixe dans les régions cérébrales métaboliquement actives, ici impliquées dans la sensibilité. Il est injecté dans le péritoine de la souris à jeun avant l'exploration. Le contrôle négatif se fera en coupant les vibrisses d'un côté avant la tâche sensitive. A la fin de la tâche, on prélève des coupes du cerveau pour mesurer l'autoradioactivité. L'immunohistochimie c-Fos est réalisée sur les cerveaux de souris ayant effectué la même tâche sensitive et détecte une protéine d'activation neuronale. Afin de détecter une activation de l'hétérotopie à plus long terme, on utilisera la cytochrome oxydase, une enzyme qui met en évidence les régions contenant beaucoup de mitochondries, donc métaboliquement très actives. Résultats : La cytochrome oxydase a marqué de façon égale le cortex homotopique de la souris HeCo et le cortex des souris contrôle. Par ailleurs, chez le mutant, elle a montré un faible marquage dans la partie médiale de l'hétérotopie et des zones de marquage plus intenses dans sa partie latérale. L'autoradiographie 2-DG a montré un pattern classique d'activation du cortex homotopique du côté stimulé, avec une intensité plus marquée dans la couche IV. Du même côté, l'hétérotopie latérale montre une intensité similaire à celui de la couche IV. Du côté non stimulé, on note une intensité faible, tant dans le cortex homotopique que dans le cortex hétérotopique. L'immunohistochimie c-Fos a montré une nette différence entre l'hémisphère stimulé et l'hémisphère non stimulé dans la couche IV comme dans l'hétérotopie. Il existe, tant du côté stimulé que du côté non stimulé, un gradient dans l'hétérotopie, le marquage latéral étant du même ordre que dans la couche IV alors qu'il est moins intense médialement. Conclusion : l'hétérotopie corticale latérale, située en particulier sous le cortex somatosensoriel, semble traiter l'information périphérique controlatérale dans le même ordre que le cortex homotopique.

Normal kinetics of intestinal glucose absorption in the absence of GLUT2: evidence for a transport pathway requiring glucose phosphorylation and transfer into the endoplasmic reticulum.

Glucose is absorbed through the intestine by a transepithelial transport system initiated at the apical membrane by the cotransporter SGLT-1; intracellular glucose is then assumed to diffuse across the basolateral membrane through GLUT2. Here, we evaluated the impact of GLUT2 gene inactivation on this transepithelial transport process. We report that the kinetics of transepithelial glucose transport, as assessed in oral glucose tolerance tests, was identical in the presence or absence of GLUT2; that the transport was transcellular because it could be inhibited by the SGLT-1 inhibitor phlorizin, and that it could not be explained by overexpression of another known glucose transporter. By using an isolated intestine perfusion system, we demonstrated that the rate of transepithelial transport was similar in control and GLUT2(-/-) intestine and that it was increased to the same extent by cAMP in both situations. However, in the absence, but not in the presence, of GLUT2, the transport was inhibited dose-dependently by the glucose-6-phosphate translocase inhibitor S4048. Furthermore, whereas transport of [(14)C]glucose proceeded with the same kinetics in control and GLUT2(-/-) intestine, [(14)C]3-O-methylglucose was transported in intestine of control but not of mutant mice. Together our data demonstrate the existence of a transepithelial glucose transport system in GLUT2(-/-) intestine that requires glucose phosphorylation and transfer of glucose-6-phosphate into the endoplasmic reticulum. Glucose may then be released out of the cells by a membrane traffic-based pathway similar to the one we previously described in GLUT2-null hepatocytes.

Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.

Targeted mutagenesis directed by oligonucleotides (ONs) is a promising method for manipulating the genome in higher eukaryotes. In this study, we have compared gene editing by different ONs on two new target sequences, the eBFP and the rd1 mutant photoreceptor betaPDE cDNAs, which were integrated as single copy transgenes at the same genomic site in 293T cells. Interestingly, antisense ONs were superior to sense ONs for one target only, showing that target sequence can by itself impart strand-bias in gene editing. The most efficient ONs were short 25 nt ONs with flanking locked nucleic acids (LNAs), a chemistry that had only been tested for targeted nucleotide mutagenesis in yeast, and 25 nt ONs with phosphorothioate linkages. We showed that LNA-modified ONs mediate dose-dependent target modification and analyzed the importance of LNA position and content. Importantly, when using ONs with flanking LNAs, targeted gene modification was stably transmitted during cell division, which allowed reliable cloning of modified cells, a feature essential for further applications in functional genomics and gene therapy. Finally, we showed that ONs with flanking LNAs aimed at correcting the rd1 stop mutation could promote survival of photoreceptors in retinas of rd1 mutant mice, suggesting that they are also active in vivo.

Alpha beta lineage-committed thymocytes can be rescued by the gamma delta T cell receptor (TCR) in the absence of TCR beta chain.

Commitment of the alpha beta and gamma delta T cell lineages within the thymus has been studied in T cell receptor (TCR)-transgenic and TCR mutant murine strains. TCR gamma delta-transgenic or TCR beta knockout mice, both of which are unable to generate TCR alpha beta-positive T cells, develop phenotypically alpha beta-like thymocytes in significant proportions. We provide evidence that in the absence of functional TCR beta protein, the gamma delta TCR can promote the development of alpha beta-like thymocytes, which, however, do not expand significantly and do not mature into gamma delta T cells. These results show that commitment to the alpha beta lineage can be determined independently of the isotype of the TCR, and suggest that alpha beta versus gamma delta T cell lineage commitment is principally regulated by mechanisms distinct from TCR-mediated selection. To accommodate our data and those reported previously on the effect of TCR gamma and delta gene rearrangements on alpha beta T cell development, we propose a model in which lineage commitment occurs independently of TCR gene rearrangement.

Heterologous desensitization of the glucagon-like peptide-1 receptor by phorbol esters requires phosphorylation of the cytoplasmic tail at four different sites.

Glucagon-like peptide-1 stimulates glucose-induced insulin secretion by binding to a specific G protein-coupled receptor that activates the adenylyl cyclase pathway. We previously demonstrated that heterologous desensitization of the receptor by protein kinase C correlated with phosphorylation in a 33-amino acid-long segment of the receptor carboxyl-terminal cytoplasmic tail. Here, we determined that the in vivo sites of phosphorylation are four serine doublets present at positions 431/432, 441/442, 444/445, and 451/452. In vitro phosphorylation of fusion proteins containing mutant receptor C-tails, however, indicated that whereas serines at position 431/432 were good substrates for protein kinase C (PKC), serines 444/445 and 451/452 were poor substrates, and serines 441/442 were not substrates. In addition, serine 416 was phosphorylated on fusion protein but not in intact cells. This indicated that in vivo a different PKC isoform or a PKC-activated kinase may phosphorylate the receptor. The role of phosphorylation on receptor desensitization was assessed using receptor mutants expressed in COS cells or Chinese hamster lung fibroblasts. Mutation of any single serine doublet to alanines reduced the extent of phorbol 12-myristate 13-acetate-induced desensitization, whereas substitution of any combination of two serine doublets suppressed it. Our data thus show that the glucagon-like peptide-1 receptor can be phosphorylated in response to phorbol 12-myristate 13-acetate on four different sites within the cytoplasmic tail. Furthermore, phosphorylation of at least three sites was required for desensitization, although maximal desensitization was only achieved when all four sites were phosphorylated.

PGC1alpha expression is controlled in skeletal muscles by PPARbeta, whose ablation results in fiber-type switching, obesity, and type 2 diabetes.

Mice in which peroxisome proliferator-activated receptor beta (PPARbeta) is selectively ablated in skeletal muscle myocytes were generated to elucidate the role played by PPARbeta signaling in these myocytes. These somatic mutant mice exhibited a muscle fiber-type switching toward lower oxidative capacity that preceded the development of obesity and diabetes, thus demonstrating that PPARbeta is instrumental in myocytes to the maintenance of oxidative fibers and that fiber-type switching is likely to be the cause and not the consequence of these metabolic disorders. We also show that PPARbeta stimulates in myocytes the expression of PGC1alpha, a coactivator of various transcription factors, known to play an important role in slow muscle fiber formation. Moreover, as the PGC1alpha promoter contains a PPAR response element, the effect of PPARbeta on the formation and/or maintenance of slow muscle fibers can be ascribed, at least in part, to a stimulation of PGC1alpha expression at the transcriptional level.

Global transcriptome sequencing identifies chlamydospore specific markers in Candida albicans and Candida dubliniensis.

Candida albicans and Candida dubliniensis are pathogenic fungi that are highly related but differ in virulence and in some phenotypic traits. During in vitro growth on certain nutrient-poor media, C. albicans and C. dubliniensis are the only yeast species which are able to produce chlamydospores, large thick-walled cells of unknown function. Interestingly, only C. dubliniensis forms pseudohyphae with abundant chlamydospores when grown on Staib medium, while C. albicans grows exclusively as a budding yeast. In order to further our understanding of chlamydospore development and assembly, we compared the global transcriptional profile of both species during growth in liquid Staib medium by RNA sequencing. We also included a C. albicans mutant in our study which lacks the morphogenetic transcriptional repressor Nrg1. This strain, which is characterized by its constitutive pseudohyphal growth, specifically produces masses of chlamydospores in Staib medium, similar to C. dubliniensis. This comparative approach identified a set of putatively chlamydospore-related genes. Two of the homologous C. albicans and C. dubliniensis genes (CSP1 and CSP2) which were most strongly upregulated during chlamydospore development were analysed in more detail. By use of the green fluorescent protein as a reporter, the encoded putative cell wall related proteins were found to exclusively localize to C. albicans and C. dubliniensis chlamydospores. Our findings uncover the first chlamydospore specific markers in Candida species and provide novel insights in the complex morphogenetic development of these important fungal pathogens.

Role of the stress sigma factor RpoS in GacA/RsmA-controlled secondary metabolism and resistance to oxidative stress in Pseudomonas fluorescens CHA0.

In Pseudomonas fluorescens biocontrol strain CHA0, the two-component system GacS/GacA positively controls the synthesis of extracellular products such as hydrogen cyanide, protease, and 2,4-diacetylphloroglucinol, by upregulating the transcription of small regulatory RNAs which relieve RsmA-mediated translational repression of target genes. The expression of the stress sigma factor sigmaS (RpoS) was controlled positively by GacA and negatively by RsmA. By comparison with the wild-type CHA0, both a gacS and an rpoS null mutant were more sensitive to H2O2 in stationary phase. Overexpression of rpoS or of rsmZ, encoding a small RNA antagonistic to RsmA, restored peroxide resistance to a gacS mutant. By contrast, the rpoS mutant showed a slight increase in the expression of the hcnA (HCN synthase subunit) gene and of the aprA (major exoprotease) gene, whereas overexpression of sigmaS strongly reduced the expression of these genes. These results suggest that in strain CHA0, regulation of exoproduct synthesis does not involve sigmaS as an intermediate in the Gac/Rsm signal transduction pathway whereas sigmaS participates in Gac/Rsm-mediated resistance to oxidative stress.

A novel cyanide-inducible gene cluster helps protect Pseudomonas aeruginosa from cyanide

Pseudomonas aeruginosa produces the toxic secondary metabolite hydrogen cyanide (HCN) at high cell population densities and low aeration. Here, we investigated the impact of HCN as a signal in cell-cell communication by comparing the transcriptome of the wild-type strain PAO1 to that of an HCN-negative mutant under cyanogenic conditions. HCN repressed four genes and induced 12 genes. While the individual functions of these genes are unknown, with one exception (i.e. a ferredoxin-dependent reductase), a highly inducible six-gene cluster (PA4129-PA4134) was found to be crucial for protection of P.aeruginosa from external HCN intoxication. A double mutant deleted for PA4129-PA4134 and cioAB (encoding cyanide-insensitive oxidase) did not grow with 100M KCN, whereas the corresponding single mutants were essentially unaffected, suggesting a synergistic action of the PA4129-PA4134 gene products and cyanide-insensitive oxidase.

Identification and purification of two distinct complexes containing the five RAD51 paralogs.

Cells defective in any of the RAD51 paralogs (RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2, and XRCC3) are sensitive to DNA cross-linking agents and to ionizing radiation. Because the paralogs are required for the assembly of DNA damage-induced RAD51 foci, and mutant cell lines are defective in homologous recombination and show genomic instability, their defect is thought to be caused by an inability to promote efficient recombinational repair. Here, we show that the five paralogs exist in two distinct complexes in human cells: one contains RAD51B, RAD51C, RAD51D, and XRCC2 (defined as BCDX2), whereas the other consists of RAD51C with XRCC3. Both protein complexes have been purified to homogeneity and their biochemical properties investigated. BCDX2 binds single-stranded DNA and single-stranded gaps in duplex DNA, in accord with the proposal that the paralogs play an early (pre-RAD51) role in recombinational repair. Moreover, BCDX2 complex binds specifically to nicks in duplex DNA. We suggest that the extreme sensitivity of paralog-defective cell lines to cross-linking agents is owing to defects in the processing of incised cross links and the consequential failure to initiate recombinational repair at these sites.

The role of Pten in the Hematopoietic System and the Hematopoietic Stem Cells

Résumé Identification, localisation et activation des cellules souches hématopoiétiques dormantes in vivo Les cellules souches somatiques sont présentes dans la majorité des tissus régénératifs comme la peau, l'épithélium intestinal et le système hématopoiétique. A partir d'une seule cellule, elles ont les capacités de produire d'autres cellules souches du même type (auto-renouvellement) et d'engendrer un ensemble défini de cellules progénitrices différenciées qui vont maintenir ou réparer leur tissu hôte. Les cellules souches adultes les mieux caractérisées sont les cellules souches hématopoiétiques (HSC), localisées dans la moelle osseuse. Un des buts de mon travail de doctorat était de caractériser plus en profondeur la localisation des HSCs endogènes in vivo. Pour ce faire, la technique "label retaining assay", se basant sur la division peu fréquentes et sur la dormance des cellules souches, a été utilisée. Après un marquage des souris avec du BrdU (analogue à l'ADN) suivi d'une longue période sans BrdU, les cellules ayant incorporés le marquage ("label retaining cells" LCRs) ont pu être identifiées dans la moelle osseuse. Ces cellules LCRs étaient enrichies 300 fois en cellules de phenotype HSC et, en utilisant de la cytofluorométrie, il a pu être montré qu'environ 15% de toutes les HSCs d'une souris restent dormantes durant plusieures semaines. Ces HSCs dormantes à long terme ne sont probablement pas impliquées dans la maintenance de 'hématopoièse. Par contre, on assiste à l'activation rapide de ces HSCs dormantes lors d'une blessure, comme une ablation myéloide. Elles re-entrent alors en cycle cellulaire et sont essentielles pour une génération rapide des cellules progénitrices et matures qui vont remplacer les cellules perdues. De plus, la détection des LCRs, combinée avec l'utilisation du marqueur de HSCs c-kit, peut être utilisée pour la localisation des HSCs dormantes présentes dans la paroi endostéale de la cavité osseuse. De manière surprenante, les LCRs c-kit+ ont surtout étés trouvées isolées en cellule unique, suggérant que le micro-environement spécifique entourant et maintenant les HSCs, appelé niche, pourrait être très réduit et abriter une seule HSC par niche. Rôles complexes du gène supresseur de tumeur Pten dans le système hématopoiétique La phosphatase PTEN disparaît dans certains cancers héréditaires ou sporadiques humains, comme les gliomes, les cancers de l'utérus ou du sein. Pten inhibe la voie de signalisation de la PI3-kinase et joue un rôle clé dans l'apoptose, la croissance, la prolifération et la migration cellulaire. Notre but était d'étudier le rôle de Pten dans les HSC normale et durant la formation de leucémies. Pour ce faire, nous avons généré un modèle murin dans lequel le gène Pten peut être supprimé dans les cellules hématopoiétiques, incluant les HSCs. Ceci a été possible en croissant l'allèle conditionnelle ptenflox soit avec le transgène MxCre inductible par l'interféron α soit avec le transgène Scl-CreERt inductible par le tamoxifen. Ceci permet la conversion de l'allèle ptenflox en l'allèle nul PtenΔ dans les HSCs et les autres types cellulaires hématopoiétiques. Les souris mutantes Pten développent une splénomégalie massive causée par une expansion dramatiques de toutes les cellules myéloides. De manière interessante, alors que le nombre de HSCs dans la moelle osseuse diminue progressivement, le nombre des HSCs dans la rate augmente de manière proportionnelle. Etrangement, les analyses de cycle cellulaire ont montrés que Pten n'avait que peu ou pas d'effet sur la dormance des HSCs ou sur leur autorenouvellement. En revanche, une augmentation massive du niveau de la cytokine de mobilisation G-CSF a été détéctée dans le serum sanguin, suggérant que la suppression de Pten stimulerait la mobilisation et la migration des HSC de la moelle osseuse vers la rate. Finallement, la transplantation de moelle osseuse délétée en Pten dans des souris immuno-déficientes montre que Pten fonctionnerait comme un suppresseur de tumeur dans le système hématopoiétique car son absence entraîne la formation rapide de leucémies lymphocytaires. Summary Identification, localization and activation of dormant hematopoietic stun cells in vivo Somatic stem cells are present in most self-renewing tissues including the skin, the intestinal epithelium and the hematopoietic system. On a single cell basis they have the capacity to produce more stem cells of the same phenotype (self-renewal) and to give rise to a defined set of mature differentiated progeny, responsible for the maintenance or repair of the host tissue. The best characterized adult stem cell is the hematopoietic stem cell (HSC) located in the bone marrow. One goal of my thesis work was to further characterize the location of endogenous HSCs in vivo. To do this, a technique called "label retaining assay» was used which takes advantage of the fact that stem cells (including HSCs) divide very infrequently and can be dormant for months. After labeling mice with the DNA analogue BrdU followed by a long BrdU free "chase", BrdU "label retaining cells" (CRCs) could be identified in the bone marrow. These CRCs were 300-fold enriched for phenotypic HSCs and by using flow cytometry analysis it could be shown that about 15% of all HSCs in the mouse are dormant for many weeks. Our results suggest that these long-term dormant HSCs are unlikely to be involved in homeostatic maintenance. However they are rapidly activated and reenter the cell cycle in response to injury signals such as myeloid ablation. In addition, detection of LRCs in combination with the HSC marker c-Kit could be used to locate engrafted dormant HSCs close to the endosteal lining of the bone marrow cavities. Most surprisingly, c-Kit+LRCs were found predominantly as single cells suggesting that the specific stem cell maintaining microenvironment, called niche, has limited space and may house only single HSCs. Complex roles of the tumor suppressor gene Pten in the hematopoietic system. The phosphatase PTEN is lost in hereditary and sporadic forms of human cancers, including gliomas, endometrial and breast cancers. Pten inhibits the PI3-kina.se pathway and plays a key role in apoptosis, cell growth, proliferation and migration. Our aim was to study the role of Pten in normal HSCs and during leukemia formation. To do this, we generated a mouse model in which the Pten gene can be deleted in hematopoietic cells including HSCs. This was achieved by crossing the conditional ptenflox allele with either the interferona inducible MxCre or the tamoxifen inducible Scl-CreERT transgene. This allowed the conversion of the ptenflox allele into a pterr' null allele in HSCs and other hematopoietic cell types. As a result Pten mutant mice developed massive splenomegaly due to a dramatic expansion of all myeloid cells. Interestingly, while the number of bone marrow HSCs progressively decreased, the number of HSCs in the spleen increased to a similar extent. Unexpectedly, extensive cell cycle analysis showed that Pten had little or no effect on HSC dormancy or HSC self-renewal. Instead, dramatically increased levels of the mobilizing cytokine G-CSF were detected in the blood serum suggesting that loss-of Pten stimulates mobilization and migration of HSC from the BM to the spleen. Finally, transplantation of Pten deficient BM cells into immuno-compromised mice showed that Pten can function as a tumor suppressor in the hematopoietic system and that its absence leads to the rapid formation of T cell leukemia.

On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

The antibody response in mice to carrier-free synthetic polymers of Plasmodium falciparum circumsporozoite repetitive epitope is I-Ab-restricted: possible implications for malaria vaccines.

The immunogenicity of a novel synthetic peptide consisting of an average of 40 (Asn-Ala-Asn-Pro) repeats of the circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum, (NANP)40, was studied in mice without using any carrier proteins. First, high titers of anti-(NANP)40 antibodies could be obtained after immunization of C57BL/6 mice. These antibodies also reacted with an extract of mosquitoes infected with P. falciparum sporozoites. C57BL/6 nu/nu mice did not produce antibodies against (NANP)40. Secondly, when 14 strains of mice with nine different H-2 haplotypes were immunized with (NANP)40 without carrier, only H-2b mice were found to produce anti-(NANP)40 antibodies, whereas all non-H-2b mice were consistently unresponsive. This response was demonstrated to be I-A-linked by using recombinant and mutant mice. I-Ab [B10.A(5R)] mice produced anti-(NANP)40 antibodies as well as H-2b inbred mice. B6CH-2bm12 I-Ab-mutant mice showed only a very low response. Third, the antibody response against (NANP)40 could be induced in nonresponder mice by immunization with the peptide coupled to a carrier protein. In view of the existence of such an exceptional H-2b restriction in the response to sporozoite synthetic peptides in mice, the triggering of peptide-specific T cell responses in humans receiving sporozoite malaria vaccines might be difficult to achieve.