Projet de sensibilisation des médecins à la santé au travail

Cette étude visait, chez les médecins romands potentiellement confrontés à des maladies en lien avec le travail (généralistes, internistes, dermatologues, allergologues, pneumologues, ORL, rhumatologues et psychiatres des cantons de Genève, Vaud, Valais, Neuchâtel, Jura, Fribourg et de la partie francophone du canton de Berne), à identifier et à décrire : - leur perception des liens entre la santé et le travail, - leurs pratiques vis à vis des maladies liées au travail incluant les difficultés et obstacles qu'ils rencontraient pour la prise en charge thérapeutique, organisationnelle ou assurantielle de ces maladies, - leurs attentes vis à vis de services que l'IST leur fournit ou pourrait leur fournir. Sur 2570 médecins contactés, 34% ont renvoyé un questionnaire (élaboré à la suite d'entretiens semi-directifs auprès de certains d'entre eux) et 32% ont finalement été inclus dans l'étude (soit 806 médecins). Les médecins inclus sont représentatifs de l'ensemble de la population de l'étude sur 3 critères : âge, canton et spécialité. Les résultats permettent de distinguer 4 profils de médecins : - les médecins généralistes, internistes et rhumatologues, qui sont souvent confrontés aux maladies liées au travail, très actifs dans la prise en charge spécifique de ces maladies (en particulier en ce qui concerne le travail du patient et les démarches auprès des assurances), et très demandeurs de services potentiels de l'IST ; - les allergologues et les pneumologues, qui sont peu confrontés aux maladies liées au travail, mais très actifs dans la prise en charge spécifique de ces maladies (en ce qui concerne le travail du patient et les démarches auprès des assurances) et très demandeurs de services potentiels de l'IST ; - les dermatologues et les ORL, qui sont peu confrontés aux maladies liées au travail, moins actifs dans la prise en charge spécifique de ces maladies (en ce qui concerne le travail du patient et les démarches auprès des assurances) et peu demandeurs de services potentiels de l'IST ; - les psychiatres, qui sont souvent confrontés aux maladies liées au travail, peu actifs dans la prise en charge spécifique de ces maladies (en ce qui concerne le travail du patient et les démarches auprès des assurances) et peu demandeurs de services potentiels de l'IST. En fonction de ces résultats, des actions ciblées vers les différentes spécialistes pourront être mises en place ultérieurement.

Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction reference genes in the spared nerve injury model of neuropathic pain : validation and literature search

La douleur neuropathique est définie comme une douleur causée par une lésion du système nerveux somato-sensoriel. Elle se caractérise par des douleurs exagérées, spontanées, ou déclenchées par des stimuli normalement non douloureux (allodynie) ou douloureux (hyperalgésie). Bien qu'elle concerne 7% de la population, ses mécanismes biologiques ne sont pas encore élucidés. L'étude des variations d'expressions géniques dans les tissus-clés des voies sensorielles (notamment le ganglion spinal et la corne dorsale de la moelle épinière) à différents moments après une lésion nerveuse périphérique permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. Elles se détectent de manière sensible par reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction (RT- qPCR). Pour garantir des résultats fiables, des guidelines ont récemment recommandé la validation des gènes de référence utilisés pour la normalisation des données ("Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments", Bustin et al 2009). Après recherche dans la littérature des gènes de référence fréquemment utilisés dans notre modèle de douleur neuropathique périphérique SNI (spared nerve injury) et dans le tissu nerveux en général, nous avons établi une liste de potentiels bons candidats: Actin beta (Actb), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal proteins 18S (18S), L13a (RPL13a) et L29 (RPL29), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) et hydroxymethyl-bilane synthase (HMBS). Nous avons évalué la stabilité d'expression de ces gènes dans le ganglion spinal et dans la corne dorsale à différents moments après la lésion nerveuse (SNI) en calculant des coefficients de variation et utilisant l'algorithme geNorm qui compare les niveaux d'expression entre les différents candidats et détermine la paire de gènes restante la plus stable. Il a aussi été possible de classer les gènes selon leur stabilité et d'identifier le nombre de gènes nécessaires pour une normalisation la plus précise. Les gènes les plus cités comme référence dans le modèle SNI ont été GAPDH, HMBS, Actb, HPRT1 et 18S. Seuls HPRT1 and 18S ont été précédemment validés dans des arrays de RT-qPCR. Dans notre étude, tous les gènes testés dans le ganglion spinal et dans la corne dorsale satisfont au critère de stabilité exprimé par une M-value inférieure à 1. Par contre avec un coefficient de variation (CV) supérieur à 50% dans le ganglion spinal, 18S ne peut être retenu. La paire de gènes la plus stable dans le ganglion spinal est HPRT1 et Actb et dans la corne dorsale il s'agit de RPL29 et RPL13a. L'utilisation de 2 gènes de référence stables suffit pour une normalisation fiable. Nous avons donc classé et validé Actb, RPL29, RPL13a, HMBS, GAPDH, HPRT1 et 18S comme gènes de référence utilisables dans la corne dorsale pour le modèle SNI chez le rat. Dans le ganglion spinal 18S n'a pas rempli nos critères. Nous avons aussi déterminé que la combinaison de deux gènes de référence stables suffit pour une normalisation précise. Les variations d'expression génique de potentiels gènes d'intérêts dans des conditions expérimentales identiques (SNI, tissu et timepoints post SNI) vont pouvoir se mesurer sur la base d'une normalisation fiable. Non seulement il sera possible d'identifier des régulations potentiellement importantes dans la genèse de la douleur neuropathique mais aussi d'observer les différents phénotypes évoluant au cours du temps après lésion nerveuse.

Enquêter

L'enquête criminelle veut comprendre des événements singuliers, identifier les personnes impliquées et délimiter leur rôle en regard d'un ensemble de règles. Le raisonnement chemine dans les deux sens. Les traces prélevées sur les lieux indiquent ce qui s'est passé et aident à décrite les entités pertinentes, voire de pointer directement sur un ensemble de personnes et d'objets. A l'inverse, le raisonnement part souvent de cercles de personnes, cherche à comprendre les relations qu'elles entretiennent entre elles et examine les liens potentiels avec des activités. C'est parfois de grandes quantités d'information qu'il faut gérer et interpréter par la construction de banques de données et l'élaboration de moyens de visualiser une information complexe. Le forensicien résout aussi dans une grande variété de circonstances la terrible inconnue de l'identité des personnes décédées. Les méthodes de l'enquête criminelle et d'identification portent sur des personnes et des lieux incertains. Les conséquences désagréables que peuvent subir les intéressés faussement désignés et leurs proches impliquent systématiquement une analyse des risques, notamment une délimitation claire du potentiel et des limites des méthodes développées.

ELECTROCORTICAL DYNAMICS OF MOTOR INHIBITORY CONTROL WITH AGING

Motor inhibitory control plays a central role in adaptive behaviors during the entire lifespan. Inhibitory motor control refers to the ability to stop all (global) or a part (selective) of a planned or ongoing motor action. Although the neural processing underlying the global inhibitory control has received much attention from cognitive neuroscientists, brain modulations that occur during selective inhibitory motor control remain unknown. The aim of the present thesis is to investigate the spatio-temporal brain processes of selective inhibitory motor control in young and old adults using high-density electroencephalography. In the first part, we focus on early (preparatory period) spatio-temporal brain processes involved in selective and global inhibitory control in young (study I) and old adults (study II) using a modified Go/No-go task. In study I, we distinguished global from selective inhibition in the early attentional stage of inhibitory control and provided neurophysiological evidence in favor of the combination model. In study II, we showed an under-recruitment of neural resources associated with preservation of performance in old adults during selective inhibition, suggesting efficient cerebral and behavioral adaptations to environmental changes. In the second part, we investigate beta oscillations in the late (post-execution period) spatio-temporal brain processes of selective inhibition during a motor Switching task (i.e., tapping movement from bimanual to unimanual) in young (study III) and old adults (study IV). In study III, we identified concomitant beta synchronization related (i) to sensory reafference processes, which enabled the stabilization of the movement that was perturbed after switching, and (ii) to active inhibition processes that prevented movement of the stopping hand. In study IV, we demonstrated a larger beta synchronization in frontal and parietal regions in old adults compared to young adults, suggesting age-related brain modulations in active inhibition processes. Apart from contributing to a basic understanding of the electrocortical dynamics underlying inhibitory motor control, the findings of the present studies contribute to knowledge regarding the further establishment of specific trainings with aging. -- Le contrôle de l'inhibition motrice joue un rôle central dans les adaptations comportementales quel que soit l'âge. L'inhibition motrice se réfère à la capacité à arrêter entièrement (globale) ou en partie (sélective) une action motrice planifiée ou en cours. Bien que les processus neuronaux sous-jacents de l'inhibition globale aient suscité un grand intérêt auprès des neurosciences cognitives, les modulations cérébrales dans le contrôle de l'inhibition motrice sélective sont encore peu connues. Le but de cette thèse est d'étudier les processus cérébraux spatio-temporels du contrôle de l'inhibition motrice sélective chez les adultes jeunes et âgés en utilisant l'électroencéphalogramme à haute densité. Dans la première partie, nous comparons les processus cérébraux spatio-temporels précoces (préparation motrice) de l'inhibition sélective et globale chez des adultes jeunes (étude I) et âgés (étude II) en utilisant une tâche Go/No-go modifiée. Dans l'étude I, nous avons distingué l'inhibition globale et sélective au niveau des processus attentionnels précoces du contrôle de l'inhibition et nous avons apporté des preuves neurophysiologiques de l'existence d'un modèle de combinaison. Dans l'étude II, nous avons montré une sous-activation neuronale associée à un maintien de la performance dans l'inhibition sélective chez les adultes âgés, suggérant des adaptations cérébrales et comportementales aux contraintes environnementales. Dans la seconde partie, nous examinons les processus cérébraux spatio-temporels tardifs (post-exécution motrice) de l'inhibition sélective pendant une tâche de Switching (tapping bimanuel vers un tapping unimanuel) chez des adultes jeunes (étude III) et âgés (étude IV). Dans l'étude III, nous avons distingué des synchronisations beta liées (i) au traitement des réafférences sensorielles permettant de stabiliser le mouvement perturbé après le switching, et (ii) aux processus d'inhibition active afin d'empêcher les mouvements de la main arrêtée. Dans l'étude IV, cette synchronisation beta était plus forte dans les régions frontales et pariétales chez les âgés par rapport aux jeunes adultes suggérant des modulations cérébrales de l'inhibition active avec l'âge. Outre la contribution fondamentale sur la compréhension des dynamiques électrocorticales dans le contrôle de l'inhibition motrice, les résultats de ces études contribuent à développer les connaissances pour la mise en place de programmes d'entraînements adaptés aux personnes âgées.

Segmentation automatique de la matière grise et de la matière blanche par un algorithme génétique : une étude de validation

Résumé Objectif: l'observation des variations de volume de la matière grise (MG), de la matière blanche (MB), et du liquide céphalo-rachidien (LCR) est particulièrement utile dans l'étude de nombreux processus physiopathologiques, la mesure quantitative 'in vivo' de ces volumes présente un intérêt considérable tant en recherche qu'en pratique clinique. Cette étude présente et valide une méthode de segmentation automatique du cerveau avec mesure des volumes de MG et MB sur des images de résonance magnétique. Matériel et Méthode: nous utilisons un algorithme génétique automatique pour segmenter le cerveau en MG, MB et LCR à partir d'images tri-dimensionnelles de résonance magnétique en pondération Ti. Une étude morphométrique a été conduite sur 136 sujets hommes et femmes de 15 à 74 ans. L'algorithme a ensuite été validé par 5 approches différentes: I. Comparaison de mesures de volume sur un cerveau de cadavre par méthode automatique et par mesure de déplacement d'eau selon la méthode d'Archimède. 2. Comparaison de mesures surfaces sur des images bidimensionnelles segmentées soit par un traçage manuel soit par la méthode automatique. 3. Evaluation de la fiabilité de la segmentation par acquisitions et segmentations itératives du même cerveau. 4. Les volumes de MG, MB et LCR ont été utilisés pour une étude du vieillissement normal de la population. 5. Comparaison avec les données existantes de la littérature. Résultats: nous avons pu observer une variation de la mesure de 4.17% supplémentaire entre le volume d'un cerveau de cadavre mesuré par la méthode d'Archimède, en majeure partie due à la persistance de tissus après dissection_ La comparaison des méthodes de comptage manuel de surface avec la méthode automatique n'a pas montré de variation significative. L'épreuve du repositionnement du même sujet à diverses reprises montre une très bonne fiabilité avec une déviation standard de 0.46% pour la MG, 1.02% pour la MB et 3.59% pour le LCR, soit 0.19% pour le volume intracrânien total (VICT). L'étude morphométrique corrobore les résultats des études anatomiques et radiologiques existantes. Conclusion: la segmentation du cerveau par un algorithme génétique permet une mesure 100% automatique, fiable et rapide des volumes cérébraux in vivo chez l'individu normal.

Physiques sonores

Ce livre, publié grâce aux soutiens logistiques et financiers du Lausanne Underground Film and Music Festival et du Groupe de la Riponne, est le premier de la collection Rip on / off. Textes édités et traduits (de l'anglais) par Christian Indermuhle et Thibault Walter dans le cadre des activités éditoriales du Groupe de la Riponne à l'occasion du Lausanne Underground Film and Music Festival 2008. Avec des collaborations de Nikola Mounoud, Boris Wlassof, Fernando Sixto, Guy-Marc Hinant, Naut Humon pour les textes ; de Julien Notter et Sébastien Vigne pour le graphisme. Un CD original, Form & Disposition, composé et masterisé par Zbigniew Karkowski, joué aux percussions par Daniel Buess et enregistré par Alex Buess en septembre 2008 aux studios 2.8.1 à Bâle, est offert avec ce livre. "Ces textes ne sont pas des compléments à l'oeuvre musicale de Zbigniew Karkowski, ils n'en sont ni une théorie, ni une explication. La musique se suffit à elle-même, elle déploie ses propres régimes d'intelligence et de conceptualités. Il s'agit donc ici de dire autre chose. Et de permettre à zk de rendre compte de sa pratique et de sa longue expérimentation de la matérialité des sons et de leur puissance. Quand nous avons choisi d'éditer, de traduire ces textes et de les enrichir de matériaux nouveaux, nous savions que nous ne pouvions nous dispenser des réseaux souterrains multipliés qu'un tel projet suppose. Ainsi, et suite à plusieurs rencontres, notamment dans le cadre de concerts donnés depuis 2005 sur la scène du luff, nous avons demandé à zk d'écrire ce livre, de rassembler ses textes d'il y a vingt ans ceux-là mêmes qui flottaient à la dérive du web, et de les compléter en enrichissant les entretiens qu'il avait eus en 2002 avec Boris Wlassof, dont les textes avaient initialement été publiés dans le numéro 59 de Revue et Corrigée. Nous avons choisi par ailleurs d'aider ou de perdre le lecteur en lui proposant, pour se guider un peu, en fin de parcours, deux glossaires reprenant quelques uns des termes musicaux et des personnages évoqués dans ce livre, et aussi d'inviter Fernando Sixto et Naut Humon à nous donner l'écho de deux oreilles ayant entendu l'oeuvre de zk, afin que ce livre multipliât les accès à ses univers musicaux, et qu'il ne soit pas le marbre qui refermât leur tombeau. Le bruit est vivant, c'est cette vitalité qu'il s'agit ici d'écouter."

Politique douanière de la Confédération suisse: 1919-1925. "Les paysans montent aux barricades"

La première guerre mondiale a créé des déséquilibres fondamentaux au sein de l'économie mondiale. D'une part, elle a endetté les Etats à un point tel que ces derniers ont été poussés à pratiquer des politiques inflationnistes aux effets sociaux parfois désastreux. D'autre part, elle a détruit le système monétaire international et avec lui le système de régulation des échanges commerciaux. Enfin, elle a provoqué un gonflement de l'appareil productif, ce qui se traduira par des tendances à la surproduction une fois la paix revenue. Bien que la Suisse soit restée neutre durant le conflit, la situation de guerre ne la pas épargnée et les déséquilibres fondamentaux évoqués l'ont aussi touchée de plein fouet à partir de 1919. Fortement intégrée dans l'économie mondiale, que ce soit au niveau des échanges d'hommes, de marchandises et de capitaux, la Suisse a surtout souffert des dérèglements intervenus sur le plan des échanges internationaux. Menant une politique du franc fort, les autorités ont dû faire face aux conséquences négatives de cette stratégie monétaire sur les différentes branches productives de l'économie. Surdimensionnées à l'issue de quatre années de pénurie, marquées par la difficulté d'importer, les branches de l'industrie et de l'agriculture travaillant pour le marché intérieur doivent faire face à une importation massive de produits étrangers. Celle-ci est encore stimulée par la politique de dumping monétaire de certains partenaires commerciaux. Quant à l'industrie d'exportation, elle ne parvient plus à écouler ses produits sur les marchés à monnaie dépréciée. Le chômage grimpe rapidement au cours de l'année 1921, ravivant les tensions sociales exacerbées par les grèves générales de 1918 et 1919. C'est dans ce contexte social explosif que la question de l'assainissement des finances fédérales doit être résolue. Durant le conflit, l'accroissement des dépenses de l'Etat a été couvert, dans une large mesure, par un accroissement de la dette et un recours à la planche à billet. Il s'agit donc de déterminer quels impôts vont fournir les sommes nécessaires au service et à l'amortissement de la dette. Les nouvelles tâches embrassées par la Confédération au cours du conflit provoquent par ailleurs un déficit budgétaire structurel que les autorités veulent combler au plus vite pour ne pas mettre en danger le franc suisse et éviter de tirer les taux de l'argent à la hausse. Pour faire face aux défis commerciaux et financiers générés par la guerre, la Confédération dispose de plusieurs outils lui permettant de mener une politique volontariste. Parmi ceux-ci, la politique douanière occupe une place très importante, puisqu'elle est à la fois la principale source de revenus de la Confédération et un bras de levier efficace pour influencer les flux commerciaux. Certes, de par son importance dans la répartition de la richesse nationale, la politique douanière a toujours été l'objet de conflits politiques homériques. Entre 1880 et 1914, un débat continu a opposé les différents groupes socio-économiques cherchant à défendre des intérêts fiscaux et commerciaux bien compris. Cependant, à l'issue de la Première guerre mondiale, les enjeux du débat prennent un ampleur qualitativement différente, puisqu'il s'agit de répondre à la question que tout le monde se pose: qui va payer la guerre ? Ce mémoire de licence analyse pourquoi et comment la réponse à cette question a engendré des conflits politiques extrêmement violents qui ont contribué à maintenir un climat social tendu au cours de la première moitié des années 1920. Pour diriger la politique douanière suisse en conformité avec leurs intérêts, les grandes associations faîtières de l'économie n'ont pas hésité à prolonger le régime des pleins pouvoirs en vigueur durant la guerre. Le 18 février 1921, des pleins pouvoirs douaniers sont attribués par le Parlement au Conseil fédéral. En vertu de ceux-ci, le gouvernement mène une politique entièrement dévouée aux intérêts des partenaires du bloc bourgeois-paysan alors au pouvoir. Afin de réguler les flux commerciaux, des mesures de restriction de l'importation sont instaurées. En matière de fiscalité, il s'agit avant tout de ne pas recourir trop à l'imposition directe frappant le revenu et le capital, mais d'utiliser l'imposition indirecte, et en particulier la taxation douanière. Pour satisfaire la paysannerie, dont l'appui politique est nécessaire, les positions agricoles du nouveau tarif sont fortement augmentées, ce qui pousse le prix des denrées alimentaires à la hausse. Cette partie du programme douanier, qui est défavorable aux milieux de l'industrie d'exportation, engendre quelques tensions au sein même du bloc bourgeois. Grands perdants de la politique fiscale menée par le Conseil fédéral, les salariés tentent de s'y opposer par tous les moyens à disposition. La politique autoritaire instaurée dans le domaine douanier les empêche toutefois de recourir au référendum. Une large coalition d'associations et de partis de gauche décident alors de s'opposer à la politique du gouvernement par le biais d'une initiative. La politique douanière devient le lieu de rassemblement d'une clientèle politique très diverse susceptible de déboucher sur la constitution d'un cartel politique de centre-gauche. Parallèlement, le PSS lance une autre initiative demandant à ce que la dette de guerre soit payée par un prélèvement unique sur la fortune. Au cours des années 1921 à 1923, la politique fiscale devient un champ d'affrontement politique de première importance. Certes, la gauche socialiste ne se gêne pas d'instrumentaliser ce champ pour attiser la lutte des classes, mais c'est surtout la droite nationaliste qui jette de l'huile sur le feu. Le discours antisocialiste qui caractérise la campagne de votation est de la plus grande violence. Au-delà des enjeux financiers et économiques qui sous-tendent le débat douanier, l'initiative remet en question les fondements mêmes de l'organisation politique suisse. Scellée en 1902, l'alliance douanière est en effet la clef de voûte du bloc bourgeois-paysan des associations faîtières. Une victoire de l'initiative serait la porte ouverte à un cartel de centre-gauche ou, plus grave encore, à une alliance rouge-verte. En stigmatisant les partisans bourgeois de l'initiative, qui sont accusés de faire un pacte avec le diable, l'USCI et l'USP parviennent à isoler le mouvement ouvrier. La défaite de 1923 est ainsi sans appel. Elle marque un jalon important de la «ghettoïsation» que le mouvement ouvrier aura à subir tout au long de l'Entre-deux-guerres. En plébiscitant les pleins pouvoirs douaniers, la votation donne aussi décharge aux autorités politiques pour leur gestion autoritaire de l'économie. Impensable avant la guerre, la soustraction d'arrêtés au référendum se systématisera dans l'Entre-deux-guerres, participant à une remise en question plus large des principes démocratiques. Au centre de la gestion des conséquences économiques et financières de la Première guerre mondiale, la politique douanière permet donc d'expliciter les conséquences sociales et politiques que le conflit a provoquées sur le plus long terme par le biais de l'explosion de la dette de l'Etat.

Acid-sensing ion channels : modulation by serine-proteases and involvement in acid-induced action potential generation in hippocampal neurons

SUMMARY Acid-sensing ion channels (ASICs) are non-voltage gated sodium channels. They are activated by rapid extracellular acidification and generate an inactivating inward current. Four ASIC genes have been cloned: ASIC1, 2, 3 and 4, with variants a and b for ASIC1and AS1C2. ASICs are expressed in neurons of the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS). In the CNS, ASICs have a role in learning, memory, as well as in neuronal death in ischemia. In the PNS, ASICs are involved in the perception of acid-induced pain, as well as in mechanoperception. In one part of my thesis project, we addressed the question of the mechanism of regulation of ASIC1 a by the serine protease trypsin at the molecular level. Trypsin modifies the function of ASIC1 a but not of ASIC1b. In order to identify the channel region responsible for this effect, we created chimeras between ASIC1 a and 1b. Subsequently, to identify the exact trypsin target(s), we mutated predicted trypsin sites in the region identified by the chimera. In the second part of a project, we investigated the role of ASICs at the cellular level, in neuronal signaling. Using the whole-cell patch clamp in hippocampal neuronal culture, we studied the potential involvement of ASICs in action potential (AP) generation. In the first part of the thesis work, we showed that trypsin modifies ASIC1a function: it shifts the pH activation and the steady-state inactivation curve towards more acidic values and accelerates the time course of the channel recovery from inactivation. We also showed that trypsin cleaves ASIC1a and that the functional effect and a channel cleavage correlate. In the inactivated state, channels cannot be modified by trypsin. Cleavage occurs in a channel region that is also important for inactivation of all ASICs; a part of this region is critical for the inhibition of ASIC1 a by the spider toxin Psalmotoxin1. In the second part of the thesis work, we showed that ASIC activity can modulate AP generation. ASIC activity by itself can induce trains of APs. In situations in which this activity by itself is not sufficient to induce APs, it can contribute to AP generation. During high neuronal activity, ASIC activity can block already existing trains of APs. In conclusion, depending on the activity of neuron in a particular moment, ASICs can differently modulate AP generation; they can induce, facilitate or inhibit APs. We also showed that trypsin changes the capability of ASICs to modulate AP generation by shifting the pH dependence to more acidic values, which adapts channel gating to pH conditions which may occur in pathological conditions such as ischemia. Our finding that trypsin modifies ASIC1 a function identifies a novel pharmacological tool, and proposes a mechanism of ASIC1a regulation that may have a physiological importance. The identification of the exact site of trypsin action gives insight to the molecular mechanisms of ASIC regulation. This work proposes a role in modulation of AP generation for ASICs in the CNS. RESUME Les canaux ASIC sont les canaux ioniques activés par l'acidification rapide extracellulaire. Activés, ils génèrent un courant entrant qui inactive en présence de stimulus acide. Quatre gènes ASIC ont été clonés, ASIC1, 2, 3 et 4, avec les variants a et b pour ASIC1 et 2. Les ASICs sont exprimés dans les neurones du système nerveux central (SNC) et périphérique (SNP). Dans le SNC, les ASIC ont un rôle dans le mémoire, apprentissage et la mort neuronale dans t'ischémie. Dans le SNP, ils ont un rôle dans la perception de la douleur et méchanosensation. Dans une partie de mon projet de thèse, nous avons étudié les mécanismes de la régulation d'ASIC1a par la sérine-protéase trypsine au niveau moléculaire. La trypsine modifie la fonction d'ASIC1a et pas ASIC1b. Nous avons créé les chimères entre ASIC1 a et 1 b, afin d'identifier la région du canal responsable pour l'effet. Pour identifier le(s) site(s) exactes de l'action de la trypsine, nous avons muté les sites potentiels de la trypsine dans la région identifiée par les chimères. Dans la deuxième partie du projet, nous avons étudié le rôle des ASICs au niveau cellulaire. En utilisant la technique du patch clamp dans les cultures des neurones de l'hippocampe, nous avons étudié l'implication des ASICs dans la génération des potentiels d'action (PA). Nous avons montré que la trypsine agit sur le canal ASIC1a ; elle décale l'activation et « steady-state » inactivation vers les valeurs plus acides, et elle raccourcit le temps du « recovery » du canal. La trypsine coupe ASIC1a sur le résidu K145 et l'effet fonctionnel et la coupure corrèlent. Nous avons identifié la région du canal responsable pour l'inactivation de tous les ASICs ; une partie de cette région est responsable pour ['inhibition d'ASIC1 a par la Psalmotoxinel . Nous avons montré que les ASICs peuvent moduler la génération des PAs. L'activité des ASICs peut induire les trains des PAs. Quand l'activité des ASICs n'est pas suffisante pour induire le PA, elle peut contribuer à sa génération. Pendant l'activité neuronale forte, l'activité des ASICs peut bloquer les trains des PAs qui existent déjà. En conclusion, dépendant de l'activité neuronale, les ASICs peuvent moduler la génération des PAs différemment ; ils peuvent induire, faciliter ou inhiber les PAs. La trypsine change la capacité des ASICs de moduler les PAs. Après l'action de la trypsine, les ASICs peuvent moduler la génération des PAs dans les conditions légèrement acides, suivies par les fluctuations du pH acide, qui peuvent exister dans l'ischémie. Le fait que la trypsine agit sur ASIC1a définit l'outil pharmacologique et propose le mécanisme de la régulation d'ASICI a qui pourrait avoir l'importance physiologique. L'identification du site de l'action de la trypsine éclaircit les mécanismes moléculaires de la régulation des ASICs. Cette étude propose un rôle des ASICs dans la modulation de la génération des PAs. Résumé pour le public large Les neurones sont les cellules de système nerveux dont la fonction est la signalisation. Comme toutes les autres cellules, les neurones ont une membrane qui sépare l'intérieur du milieu extérieur. Cette membrane est imperméable pour des particules chargées (ions). Dans cette membrane existent les protéines spécifiques, « canaux », qui permettent le transport des ions d'un côté de la membrane à l'autre, comme réponse aux stimuli différents. Ce transport des ions à travers la membrane génère un courant, qu'on peut mesurer. Ce courant est la base de la communication entre les neurones, ou, ce qu'on appelle la signalisation neuronale. Quand ce courant est suffisamment grand, il permet la génération du potentiel d'action, qui est le message principal de communication neuronale. Les canaux ASIC (acid-sensing ion channel), que nous étudions dans le laboratoire, sont activés par les acides. Les acides sont relâchés dans beaucoup de situations dans le système nerveux. Les ASIC ont été découverts récemment (en 1996), et nous ne connaissons pas encore très bien toutes les fonctions de ces canaux. Nous savons qu'ils ont un rôle dans le mémoire, apprentissage, la sensation de la douleur et l'infarctus cérébral. Dans la première partie de ce projet de thèse, nous avons voulu mieux comprendre comment fonctionnent ces canaux. Pour faire ça, nous avons étudié la régulation des ASICs par une protéine, trypsine, qui coupe le canal ASIC. Nous avons étudié ou exactement la trypsine coupe le canal et quels effets ça produit sur la fonction du canal. Dans la deuxième partie du projet de thèse, nous avons voulu mieux connaître comment le canal fonctionne au niveau de la cellule, comment il interagit avec les autres canaux et si il a un rôle dans la génération des potentiels d'action. Nous avons pu montrer que la trypsine change la fonction du canal, ce qui lui permet de fonctionner différemment. Nous avons aussi déterminé ou exactement ta trypsine coupe le canal. Au niveau de la cellule, nous avons montré que les ASIC peuvent moduler la génération des potentiels d'action, étant, dépendant de l'activité du neurone, soit activateurs, soit inhibiteurs. La trypsine est une molécule qui peut être libérée dans le système nerveux pendant certaines conditions, comme l'infarctus cérébral. A cause de ça, les connaissances que la trypsine agit sur le anal ASIC pourraient être important physiologiquement. La connaissance de l'endroit exacte ou la trypsine coupe le canal nous aide à mieux comprendre la relation structure-fonction du canal. La modulation de la génération des potentiels d'actions par les ASIC indique que ces canaux peuvent avoir un rôle important dans la signalisation neuronale.

Effectiveness of a low-intensity smoking cessation intervention for hospitalized patients

Résumé en français Contexte Les interventions intensives d'aide à l'arrêt de la cigarette en milieu hospitalier n'ont pas été adoptées à large échelle, peut-être en raison de barrières organisationnelles. Nous évaluons dans cette étude l'efficacité d'une approche moins contraignante. Méthodes Nous avons conçu et réalisé une étude de cohorte avec un groupe de contrôle historique dans le département de médecine d'un hôpital universitaire de 850 lits. Cent dix-sept fumeurs éligibles consécutifs ont bénéficié d'une intervention d'aide à l'arrêt de la cigarette et 113 fumeurs hospitalisés avant l'implémentation de cette intervention ont constitué notre groupe de contrôle. L'intervention d'aide à l'arrêt de la cigarette, d'une durée de 30 minutes, était réalisée par un médecin assistant formé en désaccoutumance au tabac, sans aucun contact ultérieur de suivi. Tous les patients ont ensuite reçu un questionnaire pour évaluer quelles étaient leurs habitudes en matière de tabagisme 6 mois après leur sortie d'hôpital. Nous avons considéré les patients perdus de vue comme fumeurs et l'abstinence tabagique ponctuelle (au moins 7 jours consécutifs) des ex-fumeurs a été validée par leur médecin traitant. Résultats Les taux d'arrêt de la cigarette validés étaient de 23.9% dans le groupe intervention et de 9.7% dans le groupe contrôle (odds ratio 2.9, intervalle de confiance à 95% [IC95] 1.4 à 6.2). Après ajustement pour les facteurs confondants potentiels, l'intervention était toujours efficace, avec un odds ratio ajusté de 2.7 (1095 = 1.0 à 5.0). Conclusion Une intervention d'aide à l'arrêt de la cigarette de faible intensité, sans contact de suivi, est associée avec un plus haut taux d'arrêt de la cigarette à 6 mois en comparaison avec un groupe de contrôle historique.

New human kallikrein 14: enzymatic characterization and inhibitors development.

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC En biologie, si une découverte permet de répondre à quelques questions, en général elle en engendre beaucoup d'autres. C'est ce qui s'est produit récemment dans le monde des kallicréines. De la famille des protéases, protéines ayant la faculté de couper plus ou moins spécifiquement d'autres protéines pour exercer un rôle biologique, la famille des kallicréines humaines n'était composée que de 3 membres lors du siècle dernier. Parmi eux, une kallicréine mondialement utilisée pour détecter le cancer de la prostate, le PSA. En 2000, un chercheur de l'hôpital universitaire Mont Sinaï à Toronto, le Professeur Eleftherios Diamandis, a découvert la présence de 12 nouveaux gènes appartenant à cette famille, situés sur le même chromosome que les 3 premières kallicréines. Cette découverte majeure a placé les spécialistes des kallicréines face à une montagne d'interrogations car les fonctions de ces nouvelles protéases étaient totalement inconnues. La kallicréine humaine 14 (hK14) présente un intérêt particulier, car elle se retrouve associée à différents cancers, notamment les carcinomes ovariens et mammaires. Cette association ne répond cependant pas à la fonction de cette protéase. L'objectif de ce travail de thèse était donc de découvrir, dans un premier temps, la spécificité de cette nouvelle kallicréine, c'est-à-dire le type de coupure qu'elle engendre au niveau des protéines qu'elle cible. Utilisant une technologie de pointe qui exploite la propriété des bactériophages à se répliquer dans les bactéries à l'infini, des dizaines de millions de combinaisons protéiques aléatoires ont été présentées à hK14, qui a pu sélectionner celles qui lui étaient favorables pour la coupure. Cette technique qualitative porte le nom de Phage Display Substrate. Une fois la sélection réalisée, il fallait transférer ces séquences coupées ou substrats dans un système permettant de donner une valeur quantitative à l'efficacité de coupure. Pour cela nous avons développé une technologie qui permet d'évaluer cette efficacité en utilisant des protéines fluorescentes de méduse, modifiées génétiquement, dont l'excitation de la première (CFP : cyan fluorescent protein) par la lumière à une certaine longue d'onde permet le transfert d'énergie à la seconde (YFP : yellow fluorescent protein), via un substrat qui les lie. Pour que ce transfert d'énergie se produise, il faut que les deux protéines fluorescentes soient proches, comme c'est le cas lorsqu'elles sont liées par un substrat. La coupure de ce lien provoque un changement de transfert d'énergie qui est quantifiable en utilisant un spectrofluoromètre. Cette technologie permet donc de suivre la réaction d'hydrolyse (coupure) des protéases. Afin de poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre la fonction biologique d'hK14 ainsi que son éventuelle implication dans le cancer, nous avons développé des inhibiteurs spécifiques d'hK14. Les séquences qui on été le plus efficacement coupées par hK14 ont été utilisées pour transformer deux types d'inhibiteurs classiques, qui circulent dans notre sang, en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Selon les résultats obtenus in vitro, ils pourront être évalués in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. RESUME Les protéases sont des enzymes impliquées dans des processus physiologiques mais aussi parfois pathologiques. La famille des kallicréines tissulaires humaines représente le plus grand groupe de protéases humaines, dont plusieurs pourraient participer au développement de certaines maladies. D'autre part, ces protéases sont apparues comme des marqueurs de pathogénicité potentiels, notamment dans les cas de cancers hormono-dépendants. La kallicréine humaine 14 a été récemment découverte et son implication dans quelques maladies, particulièrement dans le cas de tumeurs, semble probable. En effet, son expression génique est augmentée au niveau des tissus cancéreux de la prostate et du sein et son expression protéique s'est révélée plus élevée dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein ou des ovaires. Cependant, comme c'est le cas pour la plupart des kallicréines, sa fonction est encore inconnue. Afin de mieux connaître son rôle biologique et/ou pathologique, nous avons décidé de caractériser son activité enzymatique. Nous avons tout d'abord mis au point un système de substrats entièrement biologique permettant d'étudier in vitro l'activité des protéases. Ce système est basé sur le phénomène de FRET, à savoir le transfert d'énergie de résonance fluorescente qui intervient entre deux molécules fluorescentes voisines si le spectre d'émission de la protéine donneuse chevauche le spectre d'excitation de la protéine receveuse. Nous avons fusionné de manière covalente une protéine fluorescente bleue (CFP) et une jaune (YFP) en les liant avec diverses séquences. Par clivage de la séquence de liaison, une perte du transfert d'énergie peut être mesurée par un spectrofluoromètre. Cette technologie représente un moyen facile de suivre la réaction d'hydrolyse des protéases. Les conditions optimales de production de ces substrats CFP-YFP ont été déterminées, de même que les paramètres pouvant éventuellement influencer le FRET. Ce système possède une grande résistance à la protéolyse non spécifique et est applicable à un grand nombre de protéase. Contrairement aux substrats fluorogéniques, il permet d'étudier les acides aminés se trouvant des deux côtés du site de clivage. Ce système étant entièrement biologique, il est le reflet des interactions protéine-protéine et représente un outil biologique facile, bon marché et rapide pour caractériser les protéases. Dans un premier temps, hK14 a été mise en présence d' une banque de haute diversité de pentapeptides aléatoires présentée à la surface de phages afin d'identifier des substrats spécifiques. Ensuite, le système CFP-YFP a été employé pour trier les peptides sélectionnés afin d'identifier les séquences de substrats les plus sensibles et spécifiques pour hK14. Nous avons montré, qu'en plus de sa prévisible activité de type trypsine, hK14 possède aussi une très surprenante activité de type chymotrypsine. Les séquences les plus sensibles ont été choisies pour cribler la banque de donnée Swissprot, permettant ainsi l'identification de 6 substrats protéiques humains potentiels pour hK14. Trois d'entre eux, la laminine α-5, le collagène IV et la matriline-4, qui sont des composants de la matrice extracellulaire, ont démontré une grande susceptibilité à l'hydrolyse par hK14. De plus, la séparation éléctrophorétique a montré que la dégradation de la laminine α-5 et de la matriline-4 par hK14 devait se produire aux sites identifiés par la technologie du phage display. Pour terminer, nous avons transformé, par mutagenèse dirigée, deux serpines (inhibiteurs de protéases de type sérine) connues, AAT et ACT (alpha anti-trypsine et alpha anti-chymotrypsine), qui inhibent un vaste éventail d'enzymes humaines en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Ces inhibiteurs pourront être utilisés d'une part pour poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre l'implication d'hK14 dans des voies physiologiques ou dans le cancer et d'autre part pour les évaluer in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. SUMMARY Proteases consist of enzymes involved in physiological events, but also, in case of dysregulation, in pathogenicity. The human tissue kallikrein family represents the largest human protease cluster and includes several members that either could participate in the course of certain diseases or emerged as potential biological markers, especially in hormone dependent cancers. The human kallikrein 14 has been recently discovered and suggested implications in some disorders, particularly in tumors since its gene expression is up-regulated in prostate and breast cancer tissues and its protein expression increased in the serum of patients with breast and ovarian cancers. However, like most kallikreins, its function remains unknown. To better understand hK14 biological and/or pathological role, we decided to characterize its enzymatic activity. First of all, we developped a biological system suitable for in vitro study of protease activity. This system is based on the so-called FRET phenomenon, that is the Fluorescence Resonance Energy Transfer that occurs between two nearby fluorescent proteins if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. We fused covalently a cyan fluorescent protein (CFP) and a yellow fluorescent protein (YFP) with diverses sequences. Upon cleavage of the linker sequence by protease, the loss of energy transfer can be measured by a spectrofluorometer allowing an easy following of hydrolysis reaction. The optimal conditions to produce in bacterial system these CFP-YFP substrates were determined as well as the parameters that could eventually influence the FRET. This system demonstrated a high degree of resistance to non-specific proteolysis and applicability to various conditions corresponding to a great number of existing proteases. Other avantages are the possibility to study the amino acids located both sides of the cleavage site as well as the interest to work in a full biological system reflecting protein-protein interaction. A phage substrate library with exhaustive diversity was used prior to CFP-substrate-YFP system to isolate specific human kallikrein 14 substrates. After that the CFP-YFP system was used to sort peptides and identify highly sensitive and specific substrate sequences for hK14. We showed that besides its predictable trypsin-like activity, hK14 also possesses a surprising chymotrypsin-like activity. The screening of the Swissprot database was achieved with the most sensitive sequences and allowed the identification of 6 potential human protein substrates for hK14. Three of them, laminin α-5, collagen IV and matrilin-4, which are components of the extracellular matrix were incubated with hK14, by which they were efficiently hydrolyzed. Moreover, electrophoretic separation revealed that degradation of laminin α-5 and matrilin-4 by hK14 generated fragments with identical molecular size than the predicted N-terminal fragments that would result from hK14 specific cleavage, proving the value of phage display substrate to identify potential substrates. Finally, with site-directed mutagenesis, we transformed two well-known serpins (serine protease inhibitors), AAT and ACT (alpha anti-trypsin and alpha anti-chymotrypsin), which inhibit a vast spectrum of human enzymes into highly efficient and specific hK14 inhibitors. These inhibitors will be used to pursue experiments that could help understand hK14 implication in physiological pathways as well as in cancer biology and also to perform their in vivo evalution as potential cancer treatment.

Controlling cytokinesis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe : the role of dma1; and ubc8

ABSTRACT The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is a single celled eukaryote that has proved to be an excellent model system for the study of cell cycle control. S. pombe cells are rod shaped and grow mainly by elongation at their tips. They divide by formation of medially-placed cell wall, or septum, which cleaves the cell in two. Once the cell commits itself to mitosis the site of division is determined by formation of an acto-myosin based contractile ring at the cell cortex. The ring is assembled in stages throughout mitosis and contracts at the end of anaphase, coincident with spindle disassembly. The contraction, but not the assembly, of the ring requires the signal transduction network called the septation initiation network or SIN. The core components of the SIN are three protein kinases (cdc7p, sidl p and sid2p) and their regulatory subunits (spg1 p, cdcl4p and moblp, respectively). Signalling is dependent upon the nucleotide status of the GTPase spgl p, which is regulated by a two-component GAP protein, cdc16p-byr4p. Signalling is thought to emanate from the spindle pole body, where core SIN components are anchored to a scaffold comprised of sid4p and cdc11p. Activation of the SIN requires the protein kinase plolp, which also has additional roles in mitosis. SIN signalling is tightly regulated to assure the proper co-ordination of mitosis and cytokinesis. Ectopic activation of the SIN in interphase can uncouple septum formation from mitosis, while deregulated SIN signalling leads to formation of cells with multiple septa that do not cleave. Regulators of SIN activity are therefore of considerable interest. This study has concentrated upon two of these, dma1 and ubc8. I have demonstrated that dmal becomes essential when SIN signalling is activated. This leads me to propose a tripartite model for regulation of the SIN during the mitotic cell cycle. Increased expression of dma1 inhibits SIN signalling and prevents cell division. To identify potential targets and mediators of this, multicopy suppressors of dma1 toxicity were identified. One of these, ubc8, is the subject of this thesis. Genetic and molecular analyses are consistent with the view that ubc8p acts as an inhibitor of the SIN Localisation of ubc8p indicates that it is a nuclear protein. The ubc8 gene is not essential, but in its absence cells are unable to prevent septum formation if progression through mitosis is impaired. These data suggest that it may be an effector of the spindle assembly checkpoint. Together, these data shed new light upon the mechanisms by which cytokinesis is regulated in S. pombe. RESUME La levure Schizosaccharomyces pombe est un eucaryote unicellulaire qui est un bon système d'étude du cycle cellulaire. Les cellules de S. pombe sont en forme de bâtonnets et poussent par allongement aux deux bouts. Elles se divisent en formant une paroi au milieu de la cellule, qui s'appelle un septum et qui sépare la cellule en deux. Une fois que la cellule est engagée dans la mitose, le site de clivage est déterminé par la formation d'un anneau contractile d'acto-myosine au niveau du cortex cellulaire. Cet anneau est séquentiellement assemblé au cours de la mitose et se contacte à la fin de l'anaphase, au moment où le fuseau mitotique et désassemblé. La contraction, mais non pas l'assemblage, de l'anneau dépend d'un réseau de signalisation appelé septation initiation netvvork' ou SIN. Les composants centraux du SIN sont trois kinases (cdc7, sidi et sid2) ainsi que leurs sous-unités régulatrices (spgl, cdc14 et mob1, respectivement). La signalisation dépend du nucléotide rattaché à la GTPase spgl qui est régulée par une GAP comprenant deux sous-unités cdc16 et byr4. La signalisation est présumée provenir du pôle du fuseau où les composants centraux du SIN sont ancrés grâce à un échafaudage comprenant sid4 et cdcl 1. La signalisation est étroitement régulée pour assurer une bonne coordination entre mitose et cytokinèse. Une activation ectopique du SIN en interphase peut découpler la formation du septum de la mitose, engendrant des cellules à multiples septa qui ne sont pas clivés. C'est pourquoi les régulateurs du SIN sont d'un intérêt considérable. Cette étude se concentre autour de deux ces régulateurs, dma1 et ubc8. J'ai montré que dma1 devient essentiel quand la signalisation du SIN est activée. Ceci m'amène à proposer un modèle en trois parties pour la régulation du SIN durant la mitose. Une expression élevée de dma1 inhibe la signalisation du SIN et empêche la division cellulaire. Afin d'identifier des substrats ou médiateurs potentiels de la toxicité de dma1, des supresseurs en copies multiples ont été identifiés. Un de ces supresseurs, ubc8, constitue le deuxième sujet de cette thèse. Les études génétiques et moléculaires suggèrent un rôle inhibiteur du SIN par ubc8. Ubc8p est une protéine nucléaire, non essentielle, mais en son absence les cellules ne peuvent pas restreindre la fomation du septum, lorsque la progression de la mitose est perturbée. Les données suggèrent que ubc8 pourrait être un effecteur de point de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. Prises dans leur ensemble, ces données apportent un nouvel éclairage sur les mécanismes de régulation de la cytokinèse dans S. pombe.

Construction and analysis of a new conditional ferritin H knockout mouse strain/

Résumé Le fer joue un rôle important dans la plupart des fonctions biologiques mais sa présence excessive provoque la production de molécules réactives d'oxygène (ROS) qui peuvent contribuer à diverses maladies. La protéine de stockage du fer, la ferritine H, capte l'excès en fer et le stocke sous forme non-toxique, ce qui empêche des dommages potentiels. La délétion de la ferritine H dans des souris knock-out a été essayée antérieurement, mais ces souris mouraient au stade précoce du développement embryonnaire. Pour étudier l'importance du fer, et en particulier son stockage dans la ferritine, et pour pouvoir mieux comprendre les fonctions de la ferritine H, nous avons créé un modèle de souris knock-out conditionnelles de la ferritine H, selon le système classique de Cre-LoxP. Le premier exon et la région du promoteur du gène de la ferritine H ont été entourés de sites loxP. La mortalité embryonnaire provoquée par la délétion constitutive du gène de la ferritine H a été confirmée en croisant nos souris avec des souris exprimant nestin-Cre1. En croisant nos souris avec des souris transgéniques Mx-Cre, nous avons observé que l'induction de Cre par injection de polyI-polyC provoque la délétion presque complète de la ferritine H dans le foie (> 99%) et la rate (> 88%). Ces tissus ont également perdu une grande partie de leur réserve de fer. Cette observation apporte pour la première fois la preuve in vivo que la ferritine H est indispensable pour le stockage du fer, que les fonctions de la ferritine H et de la ferritine L ne sont pas équivalentes, et que la ferritine L ne peut pas assumer seule la fonction de stockage du fer. Dans le foie des souris knock-out, l'expression de l'ARN messager de l'hepcidine a été induite après 10 jours. En même temps, l'expression de l'ARN messager des gènes codant pour des protéines de l'absorption de fer (DMT1, ferroportin, Dcytb1 et hephaestin) a été réprimée mais dans le duodénum seulement. L'expression d'hepcidine est inversément corrélée avec celle des gènes liés à l'absorption de fer. Cette observation corrobore des études antérieures. Mais, en plus, elle montre également que cette répression se produit seulement dans l'intestin. Nous pouvons ainsi tirer la conclusion suivante : ou bien l'hepcidine a un récepteur spécifique dans le duodénum ou bien les gènes liés à l'absorption de fer dans le duodénum ont un facteur spécifique de transcription sensible à l'hepcidine. Aucune répression de DMT1 et de ferroportin n'a été observée dans les macrophages de la rate après l'induction d'hepcidine. La délétion de ferritine H a entraîné une augmentation du taux de mortalité des cellules hépatiques, ainsi que des altérations dans l'architecture normale du tissu de la rate. Vu par l'immunohistologie, le nombre de lymphocytes B et T était réduit dans la rate, tendant à démontrer que la ferritine H et l'homéostase du fer jouent un rôle dans l'immunité. En conclusion, le modèle de souris knock-out conditionnelles de la ferritine H nous fournit un outil précieux pour l'étude in vivo du rôle joué par la ferritine dans l'homéostase du fer, dans les dommages créés par les ROS, ainsi que dans l'apoptose et l'immunité. Summary Iron plays an important role in most biological functions. However, excess of iron results in production of reactive oxygen species (ROS) which could substantially contribute to pathology of various diseases. Ferritin H scavenges excess of iron and stores it in non-toxic form and potentially prevents the damage. Fenitin H targeting in mice has been attempted before, however, straight knockout was lethal in early embryonic stage. To study the role of iron and its storage protein ferritin and to further elucidate ferritin H functions, we aimed at creating a conditional ferritin H knockout mouse model by classical Cre-LoxP system. First exon along with promoter region of the ferritin H gene was foxed. Embryonic lethality of the constitutive ferritin H deletion was confirmed by crossing the foxed mice with mice expressing nestin Cre-1 as transgene. Almost complete deletion was observed in liver (> 99%) and spleen (>88%) upon induction of Cre by injecting polyI-polyC in Fth Lox/Lox; MxCre mice. These tissues also lost substantial fraction of their iron stores. This provides first in vivo evidence that ferritin H is required for iron storage, ferritin H and L functions are not redundant and that ferritin L cannot perform iron storage function alone. Hepcidin mRNA expression was induced after 10 days in the livers of deleted mice and, simultaneously, mRNA expression of iron absorption related genes (DMT 1, ferroportin, Dcytb1 and hephaestin) was repressed in duodenum only. Hepcidin expression is inversely correlated with that of duodenal iron absorption related genes. This is in agreement with previous studies. However, we also show that this repression happens only in intestine. This leads to the conclusion that either hepcidin has a specific receptor in duodenum or the iron absorption related genes have duodenum specific transcription factor that is responsive to hepcidin. No repression of DMT1 and ferroportin was observed in spleen macrophages upon hepcidin induction. Ferritin H deletion showed increased cell death in liver and disruption of normal architecture of spleen. B lymphocytes were reduced in spleen on immunohistology which point towards a role of ferritin H and iron homeostasis in immunity. In conclusion, ferritin H conditional knockout mouse model provides us with an invaluable tool to study the in vivo role of ferritin H in iron homeostasis, ROS mediated damage, apoptosis and immunity.

Remodelage des canaux potassiques dépendants de l'ATP lors de l'hypertrophie et de l'insuffisance cardiaque

RESUME :Introduction. Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité dans les pays développés et l'insuffisance cardiaque (IC) est la plus fréquente. Suite à un infarctus, le coeur des patients subit un remodelage ventriculaire pouvant évoluer vers un état d'IC. L'IC se définit comme un état dans lequel le coeur n'est plus capable d'approvisionner suffisamment les organes et cet état s'accompagne souvent de troubles du rythme cardiaque. Le remodelage ventriculaire touche de nombreux gènes codant à la fois pour les voies métaboliques et pour des canaux ioniques favorisant ainsi l'apparition des arythmies responsables de la mort subite des patients atteints d'IC. Comprendre ce passage entre remodelage et IC est crucial afin de pouvoir un jour prévenir l'IC et les complications médicales qui l'accompagnent. Nous nous sommes intéressés aux canaux potassiques dépendants de l'ATP (KATP) car ces canaux ont la capacité de coupler le métabolisme de la cellule à son activité électrique. En effet, les canaux KATP s'ouvrent quand la charge énergétique (rapport ATP/ ADP) de la cellule chute. Dans les cardiomyocytes, l'ouverture des KATP induit une hyperpolarisation de la membrane cellulaire ce qui diminue indirectement la surcharge calcique et de ce fait préserve la cellule. Les canaux KATp sont formés de 4 sous-unités Kir6.x (Kir6.1 ou Kir6.2) formant le pore du canal associées à 4 sous-unités régulatrices SUR. Les propriétés électrophysiologiques ainsi que la sensibilité pharmacologique des canaux KATP dépendent de leur composition et seuls les canaux KATP formés par la sous-unité Kirô.l sont activés par le diazoxyde.Méthodes et résultats. Nous avons d'abord montré dans un modèle in vivo d'IC chez le rat adulte que les sous-unités Kir6.1 et SUR sont surexprimées dans ces conditions pathologiques. Par ailleurs, les cardiomyocytes issus des coeurs infarcis deviennent sensibles au diazoxyde reflétant la surexpression de Kir6.1. Les potentiels d'action qui sont prolongés dans l'IC et qui sont à l'origine d'arythmies majeures sont normalisés par l'ouverture des canaux KATp induite par le diazoxyde. Ainsi, l'ouverture pharmacologique des canaux KATp contribuerait à la cardio-protection. Dans une seconde partie, nous avons déterminé quels étaient les facteurs de transcription responsables de ce changement d'expression des sous-unités formant les KATP. Dans notre modèle, nous avons pu montrer que la surexpression de Kirô.l est due aux facteurs de transcription Fox03 et FoxF2 qui est aussi responsable de la surexpression des sous-unités SUR. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons mis au point un modèle d'IC in vitro en cultivant les cardiomyocytes de rats adultes en présence d'angiotensine II (Angll) ou de TNFa. Ce modèle expérimental nous a non seulement permis de mettre en relation l'importance de L'AnglI et du TNFa sur le remodelage des canaux KATP mais aussi de développer un modèle in vitro présentant les mêmes caractéristiques que le modèle in vivo concernant le remodelage des KATP lors de l'IC. Ce dernier modèle expérimental ouvre des perspectives afin de mieux caractériser les voies de signalisation impliquées dans le remodelage des canaux KATp lors de l'IC.Conclusion. Les canaux KATp subissent un remodelage lors de l'IC et les résultats obtenus montrent le potentiel cardio-protecteur de ces canaux.ABSTRACT :Background and aim. Cardiovascular disease is the leading cause of death in developed countries and heart failure (HF) is the most common. Following myocardial infarction, the heart of the patient undergoes ventricular remodeling which may evolve toward a state of HF. HF is defined as a state in which heart is unable to supply enough blood to organs and this state is often accompanied by cardiac arrhythmias. Ventricular remodeling involves many genes coding for both metabolic enzymes and ion channels. Changes in ion channel expression can promote arrhythmias responsible for sudden death in patients with HF. A better understanding of the transition between remodeling and HF is crucial in order to prevent the complications associated to HF We were interested in ATP-dependent potassium channels (KATp) because they couple cell metabolism to electrical activity of the cell. Indeed, KATP channels open when the energy charge (ratio of ATP / ADP) of the cell collapses. In cardiomyocytes, the opening of KATP channels induces hyper- polanzation of the cell membrane which reduces calcium overload and thereby protects the cell. KATp channels are composed by 4 Kir6.x subumts (Kir6.1 or Kir6.2) forming the pore channel associated with 4 regulatory subunits SUR. The electrophysiological properties as well as pharmacological sensitivity of KATp channels depend on their composition and only KATP channels formed by Kir6.1 subunit are activated by diazoxide.Methods and results. Firstly, using an in vivo model of HF in adult rats, we showed that Kir6.1 and SUR subunits are overexpressed in HF. In addition, cardiomyocytes from post-infarction hearts became sensitive to diazoxide reflecting the overexpression of the Kir6.1 subunit. The opening of KATP by diazoxide tended to reduce the action potential duration (APD) which is extended in HF. This increase in APD is known to be a major source of arrhythmias during HF. Therefore, the opening of KATP channels by diazoxide would be cardio-protective. Secondly, we wanted to determine which transcription factors were responsible for this KATP remodeling. In our model of HF, we showed that overexpression of Kir6.1 is due to the transcription factors Fox03 and FOXF2 which is also responsible for SUR subunits overexpression. Thirdly, we developed an in vitro model of HF by cultivation of adult rat cardiomyocytes in the presence of angiotensin II (Angll) or TNFa. This model is very interesting not only because it underlines the importance of Angll and TNFa in KATp remodeling but also because this in vitro model presents the same KATP remodeling as the in vivo model of HF. These findings show that our in vitro model of HF opens up many possibilities to investigate more precisely the signaling pathways involved in remodeling of the KATP channels in HF.Conclusion. KATP channels undergo remodeling during HF and our results show the cardio¬protective potential of KATP channels in this disease.

Neuroprotection in cerebral ischemia with XG-102, a new peptide inhibitor of JNK

Abstract Stroke or cerebrovascular accident, whose great majority is of ischemic nature, is the third leading cause of mortality and long lasting disability in industrialised countries. Resulting from the loss of blood supply to the brain depriving cerebral tissues of oxygen and glucose, it induces irreversible neuronal damages. Despite the large amount of research carried out into the causes and pathogenic features of cerebral ischemia the progress toward effective treatments has been poor. Apart the clot-busting drug tissue-type plasminogen activator (tPA) as effective therapy for acute stroke (reperfusion by thrombolysis) but limited to a low percentage of patients, there are currently no other approved medical treatments. The need for new therapy strategies is therefore imperative. Neuronal death in cerebral ischemia is among others due to excitotoxic mechanisms very early after stroke onset. One of the main involved molecular pathways leading to excitotoxic cell death is the c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) pathway. Several studies have already shown the efficacy of a neuroprotective agent of a new type, a dextrogyre peptide synthesized in the retro inverso form (XG102, formerly D-JNKI1), which is protease-resistant and cell-penetrating and that selectively and strongly blocks the access of JNK to many of its targets. A powerful protection was observed with this compound in several models of ischemia (Borsello et al. 2003;Hirt et al. 2004). This chimeric compound, made up of a 10 amino acid TAT transporter sequence followed by a 20 amino acids JNK binding domain (JBD) sequence from JNK inhibitor protein (JIP) molecule, induced both a major reduction in lesion size and improved functional outcome. Moreover it presents a wide therapeutic window. XG-102 has proved its powerful efficacy in an occlusion model of middle cerebral artery in mice with intracérebroventricular (i.c.v.) injection but in order to be able to consider the development of this drug for human ischemic stroke it was therefore necessary to determine the feasibility of its systemic administration. The studies being the subject of this thesis made it possible to show a successful neuroprotection with XG-102 administered systemically after transient mouse middle cerebral artery occlusion (MCAo). Moreover our data. provided information about the feasibility to combine XG-102 with tPA without detrimental action on cell survival. By combining the benefits from a reperfusion treatment with the effects of a neuroprotective compound, it would represent the advantage of bringing better chances to protect the cerebral tissue. Résumé L'attaque cérébrale ou accident vasculaire cérébral, dont la grande majorité est de nature ischémique, constitue la troisième cause de mortalité et d'infirmité dans les pays industrialisés. Résultant de la perte d'approvisionnement de sang au cerveau privant les tissus cérébraux d'oxygène et de glucose, elle induit des dommages neuronaux irréversibles. En dépit du nombre élevé de recherches effectuées pour caractériser les mécanismes pathogènes de l'ischémie. cérébrale, les progrès vers des traitements efficaces restent pauvres. Excepté l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dont le rôle est de désagréger les caillots sanguins et employé comme thérapie efficace contre l'attaque cérébrale aiguë (reperfusion par thrombolyse) mais limité à un faible pourcentage de patients, il n'y a actuellement aucun autre traitement médical approuvé. Le besoin de nouvelles stratégies thérapeutiques est par conséquent impératif. La mort neuronale dans l'ischémie cérébrale est entre autres due à des mécanismes excitotoxiques survenant rapidement après le début de l'attaque cérébrale. Une des principales voies moléculaires impliquée conduisant à la mort excitotoxique des cellules est la voie de la c-Jun NH2terminal kinase (JNK). Plusieurs études ont déjà montré l'efficacité d'un agent neuroprotecteur d'un nouveau type, un peptide dextrogyre synthétisé sous la forme retro inverso (XG-102, précédemment D-JNKI1) résistant aux protéases, capable de pénétrer dans les cellules et de bloquer sélectivement et fortement l'accès de JNK à plusieurs de ses cibles. Une puissante protection a été observée avec ce composé dans plusieurs modèles d'ischémie (Borsello et al. 2003;Hirt et al. 2004). Ce composé chimérique, construit à partir d'une séquence TAT de 10 acides aminés suivie par une séquence de 20 acides aminés d'un domaine liant JNK (JBD) issu de la molécule JNK protéine inhibitrice. (JIP), induit à la fois une réduction importante de la taille de lésion et un comportement fonctionnel amélioré. De plus il présente une fenêtre thérapeutique étendue. XG-102 a prouvé sa puissante efficacité dans un modèle d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne chez la souris avec injection intracerebroventriculaire (i.c.v.) mais afin de pouvoir envisager le développement de ce composé pour l'attaque cérébrale chez l'homme, il était donc nécessaire de déterminer la faisabilité de son administration systémique. Les études faisant l'objet de cette thèse ont permis de montrer une neuroprotection importante avec XG-102 administré de façon systémique après l'occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne chez la souris (MCAo). De plus nos données ont fourni des informations quant à la faisabilité de combiner XG-102 et tPA, démontrant une protection efficace par XG-102 malgré l'action nuisible du tPA sur la survie des cellules. En combinant les bénéfices de la reperfusion avec les effets d'un composé neurooprotecteur, cela représenterait l'avantage d'apporter des meilleures chances de protéger le tissu cérébral.

Du vieillissement cérébral à la maladie d'Alzheimer : vulnérabilité et plasticité

Sens de la mémoire... mémoire du sens chez l'adulte vieillissant - Les ressources adaptatives : de l'anticipation involontaire aux stratégies conscientes - Les ressources adaptatives : l'épreuve du vieillissement - Plasticité et dégénérescence des circuits cérébraux dans le vieillissement et la maladie d'Alzheimer - Facteurs de risque génétiques et mécanismes moléculaires dans la maladie d'Alzheimer - La mort neuronale : mécanismes d'un phénomène naturel ou pathologique - Facteurs de risque et de protection - Vieillissement cérébral pathologique : les pathologies démentielles - Prise en charge globale et thérapies actuelles de la démence de type Alzheimer - Regard anthropologique sur le veillissement cérébral et la maladie d'Alzheimer