Characterization of cytoplasmic antiviral signaling pathways

Summary Multicellular organisms have evolved the immune system to protect from pathogen such as viruses, bacteria, fungi or parasites. Detection of invading pathogens by the host innate immune system is crucial for mounting protective responses and depends on the recognition of microbial components by specific receptors. The results presented in this manuscript focus on the signaling pathways involved in the detection of viral infection by the sensing of viral nucleic acids. First, we describe a new regulatory mechanism controlling RNA-sensing antiviral pathways. Our results indicate that TRIF and Cardif, the crucial adaptor proteins for endosomal and cytoplasmic RNA detection signaling pathway, are processed and inactivated by caspases. The second aspect investigated here involves a signaling pathway triggered upon cytosolic DNA sensing. The interferon inducible protein DAI was recently described as a DNA sensor able to induce the activation of IRFs and NF-κΒ transcription factors leading to type I interferon production. Here we identify two RIP homotypic interaction motifs (RHIMs) in DAI and demonstrate that they mediate the recruitment of RIP1 and RIP3 and the subsequent NF-κΒ activation. Moreover, we observed that the mouse cytomegalovirus RHIM- containing protein M45 has the potential to block this signaling cascade by interfering with the formation of the DAI-RIP1/3 signaling complex. Finally, we report the generation and the initial characterization of NLRX1-deficient mice. NLRX1 is a member of the NOD-like receptor family localized to the mitochondria. The function of NLRX1 is still controversial: one study proposed that NLRX1 acts as an inhibitor of the RIG-like receptor (RLR) antiviral pathway by binding the adaptor protein Cardif, whereas another report implicated NLRX1 in the generation of reactive oxygen species (ROS) and the amplification of NF-κΒ and JNK triggered by TNF-α, poly(I:C) or Shigella infection. Collectively, our results indicate that NLRX1-deficiency does not affect RLR signaling nor TNF-α induced responses. Proteomics analysis identified UQCRC2, a subunit of the complex III of the mitochondrial respiratory chain, as a NLRX1 binding partner. This observation might reveal a possible functional link between NLRX1 and mitochondrial respiration and/or ROS generation. Résumé Au cours de l'évolution, les organismes multicellulaires ont développé le système immunitaire afin de se protéger contre les pathogènes. Une étape cruciale pour le déclenchement des réponses protectrices est la reconnaissance par les cellules du système immunitaire de molécules propres aux microbes grâce à des récepteurs spécifiques. Les résultats présentés dans cette thèse décrivent des nouveaux aspects concernant les voies de signalisation impliquées dans la détection des virus. Le premier projet décrit un mécanisme de régulation des voies activées par la détection d'ARN virale. Nos résultats montrent que TRIF et Cardif, des protéines adaptatrices des voies déclenchées par la reconnaissance de ces acides nucléiques au niveau des endosomes et du cytoplasme, sont clivés et inactivés par les caspases. Le projet suivant de notre recherche concerne une voie de signalisation activée par la détection d'ADN au niveau du cytoplasme. La protéine DAI a été récemment décrite comme un senseur pour cet ADN capable d'activer les facteurs de transcription IRF et NF-κΒ et d'induire ainsi la production des interférons de type I. Ici on démontre que DAI interagit avec RIP1 et RIP3 par le biais de domaines appelés RHIM et que ce complexe est responsable de l'activation de NF-κΒ. On a aussi identifié une protéine du cytomégalovirus de la souris, M45, qui contient ce même domaine et on a pu démontrer qu'elle a la capacité d'interférer avec la formation du complexe entre DAI et RIP1/RIP3 bloquant ainsi l'activation de NF-κΒ. Enfin on décrit ici la génération de souris déficientes pour le gène qui code pour la protéine NLRX1. Cette protéine fait partie de la famille des récepteurs NOD et est localisée dans la mitochondrie. Une étude a suggéré que NLRX1 agit comme un inhibiteur des voies antivirales activées par les récepteurs du type RIG-I (RLR) en interagissant avec la protéine adaptatrice Cardif. Une autre étude propose par contre que NLRX1 participe à la production des dérivés réactifs de l'oxygène et contribue ainsi à augmenter l'activation de NF- κΒ et JNK induite par le TNF-α ou le poly(I:C). Nos résultats montrent que l'absence de NLRX1 ne modifie ni la voie de signalisation RLR ni les réponses induites par le TNF-α. Des analyses ultérieures ont permis d'identifier comme partenaire d'interaction de NLRX1 la protéine UQCRC2, une des sous-unités qui composent le complexe III de la chaîne respiratoire mitochondriale. Cette observation pourrait indiquer un lien fonctionnel entre NLRX1 et la respiration mitochondriale ou la production des dérivés réactifs de l'oxygène au niveau de cette organelle.

Analyse des modifications de la chromatine impliquées dans l'effet barrière de CTF1 aux télomères humains

Eukaryotic genomes are compartmentalized in different structural domains that can affect positively or negatively gene expression. These regions of euchromatin and heterochromatin are characterized by distinct histones marks which can facilitate or repress gene transcription. The chromatin environment represents thus one of the main problems to control gene expression in biotechnological applications or gene therapy, since its expression is affected by the chromatin neighboring its locus of insertion. Some chromatin regions like telomeres are composed of constitutive heterochromatin which leads to the telomeric position effect (TPE) that silences genes adjacent to the telomere. TPE is known to spread by the selfrecruitment of the SIR histone deacetylase complex from the telomere in S.cerevisiae, but the histone marks that are associated to telomeric chromatin in mammalian cells remain mostly unknown. The transcription factor CTF1 has shown antisilencing properties in mammalian cells and also a boundary activity against TPE in yeast cells when fused to the yeast Gal4 DNA binding domain. In the work presented here, we describe a dual-reporter system to assess the boundary activity of proteins such as CTF1 at human telomeres. When located between the two reporter genes, CTF1 shields the telomere distal gene from TPE, while the telomereproximal gene remains silenced by telomeric heterochromatin. The boundary activity of CTF1 is shown to act regardless its function of transcriptional activator, by opposition to the transcriptional activator VP16 which activates indifferently both transgenes. Moreover, this study shows that CTF1 boundary activity is linked to its H3 binding function, as expected from a chromatin remodeler. ChIP experiments showed that histone deacetylation is the main histone modification involved in gene silencing at mammalian cell telomeres. Distinctly to yeast cells, the histone deacetylation signal in human cells extented over a short range along the chromosome. CTF1 may help to block this propagation and therefore to restore histones acetylation level on telomere protected locus. Surprisingly, other histone marks such as trimethyl-H3K9 or trimethyl-H4K20 were found on telomere protected locus, while in another clone, unsilencing of telomere distal transgene was associated with recruitment of the histone variant H2A.Z. Thus, I conclude that CTF1 displays a chromatin boundary function which is independent of its transcriptional activity and therefore exhibit features required for use as chromatin insulator in biotechnological applications. RESUME Les génomes eucaryotes sont compartementalisés en domaines structurels qui peuvent affecter positivement ou négativement l'expression des gènes avoisinants. Ces régions dites d'euchromatine ou d'hétérochromatine sont caractérisées par des modifications posttraductionnelles des histones qui peuvent faciliter ou au contraire inhiber la transcription des gènes qui s'y trouvent. Ainsi, isoler un gène de son environnement chromatinien est problème fréquent lorsqu'il s'agit de contrôler son expression dans le cadre d'applications en biotechnologie ou encore en thérapie génique. Certaines régions de chromatine telles que les télomères sont composées d'hétérochromatine constitutive qui mène au silençage des gènes avoisinants. Cet effet de position télomérique (TPE) est connu dans la levure S.cerevisiae comme se propageant par auto-recrutement du complexe de déacétylation d'histone SIR, alors que peu de modifications de chromatine ont pu être associées à ce phénomène dans les cellules de mammifères. Le facteur de transcription CTF1 a montré des propriétés d'anti-silençage dans les cellules de mammifères, ainsi qu'une activité barrière contre le silençage télomérique dans les cellules de levures lorsqu'il est fusionné au domaine de liaison à l'ADN de la protéine de levure Gal4. Dans le travail présenté ci-après est décrit un système à deux gènes rapporteurs permettant de mesurer l'activité barrière de protéines telles que CTF1 aux télomères humains, et les modifications de chromatine qui y sont associées. Lorsque CTF1 est placé entre les deux gènes rapporteurs, le gène distant du télomère est protégé du silençage qui lui est associé, alors que le gène proche du télomère reste soumis à ce silençage induit par l'hétérochromatine télomérique. L'activité barrière de CTF1 est montrée ici comme agissant indépendamment de son activité transcriptionnelle, par opposition à l'activateur transcriptionnel VP16 qui active indifféremment les deux transgènes. En outre, cette étude appuie l'hypothèse stipulant que CTF1 agisse comme remodeleur chromatinien puisqu'elle démontre que son activité barrière est directement dépendante de son activité de liaison avec l'histone H3. De plus, des expériences d'immuno-précipitation de la chromatine démontrent que la déacétylation des histones est le majeur phénomène intervenant dans le silençage télomérique. Par opposition à la levure, ce signal de déacétylation ne se propage dans les cellules humaines que sur une courte distance le long du chromosome. CTF1 agit ainsi en bloquant cette propagation et en restaurant le niveau d'acétylation des histones sur le locus protégé du télomère. De manière surprenante et inattendue, d'autres modifications d'histones telles que 4 les H3K9 et H4K20 triméthylées sont aussi observées à ce locus, tandis le recrutement du variant H2A.Z peut aussi être suffisant à restaurer l'expression du gène distant du télomère. En terme de cette analyse, CTF1 exhibe ainsi une fonction de barrière chromatinienne qui exclue une activité transcriptionnelle non désirée - propriété qui est requise dans l'établissement des isolateurs visant à permettre le contrôle d'un transgène dans le cadre d'applications en biotechnologies.

Impact of antiviral preventive strategies on the incidence and outcomes of cytomegalovirus disease in solid organ transplant recipients.

We assessed the impact of antiviral prophylaxis and preemptive therapy on the incidence and outcomes of cytomegalovirus (CMV) disease in a nationwide prospective cohort of solid organ transplant recipients. Risk factors associated with CMV disease and graft failure-free survival were analyzed using Cox regression models. One thousand two hundred thirty-nine patients transplanted from May 2008 until March 2011 were included; 466 (38%) patients received CMV prophylaxis and 522 (42%) patients were managed preemptively. Overall incidence of CMV disease was 6.05% and was linked to CMV serostatus (D+/R- vs. R+, hazard ratio [HR] 5.36 [95% CI 3.14-9.14], pâeuro0/00<âeuro0/000.001). No difference in the incidence of CMV disease was observed in patients receiving antiviral prophylaxis as compared to the preemptive approach (HR 1.16 [95% CI 0.63-2.17], pâeuro0/00=âeuro0/000.63). CMV disease was not associated with a lower graft failure-free survival (HR 1.27 [95% CI 0.64-2.53], pâeuro0/00=âeuro0/000.50). Nevertheless, patients followed by the preemptive approach had an inferior graft failure-free survival after a median of 1.05 years of follow-up (HR 1.63 [95% CI 1.01-2.64], pâeuro0/00=âeuro0/000.044). The incidence of CMV disease in this cohort was low and not influenced by the preventive strategy used. However, patients on CMV prophylaxis were more likely to be free from graft failure.

Lack of association between beta-herpesvirus infection and bronchiolitis obliterans syndrome in lung transplant recipients in the era of antiviral prophylaxis.

BACKGROUND: Cytomegalovirus (CMV), human herpesvirus-6 and -7 (HHV-6 and -7) are beta-herpesviruses that commonly reactivate and have been proposed to trigger acute rejection and chronic allograft injury. We assessed the contribution of these viruses in the development of bronchiolitis obliterans syndrome (BOS) after lung transplantation. METHODS: Quantitative real-time polymerase chain reaction of bronchoalveolar lavage samples were performed for CMV, HHV-6 and -7 in a prospective cohort of lung transplant recipients. A time-dependent Cox regression analysis was used to correlate the risk of BOS and acute rejection in patients with and without beta-herpesviruses infection. RESULTS: Ninety-three patients were included in the study over a period of 3 years. A total of 581 samples from bronchoalveolar lavage were obtained. Sixty-one patients (65.6%) had at least one positive result for one of the beta-herpesviruses: 48 patients (51.6%) for CMV and 19 patients (20.4%) for both HHV-6 and -7. Median peak viral load was 3419 copies/mL for CMV, 258 copies/mL for HHV-6, and 665 copies/mL for HHV-7. Acute rejection (>or=grade 2) occurred in 46.2% and BOS (>or=stage 1) in 19.4% of the patients. In the Cox regression model the relative risk of acute rejection or BOS was not increased in patients with any beta-herpesviruses reactivation. Acute rejection was the only independently associated risk factor for BOS. CONCLUSIONS: In lung transplant recipients receiving prolonged antiviral prophylaxis, reactivation of beta-herpesviruses within the allograft was common. However, despite high viral loads in many patients, virus replication was not associated with the development of rejection or BOS.

Insight in the factors associated with the presence of protective antiviral T-cell response.

T cells play a primordial role in antiviral immunity. Virus-specific T-cell responses can be characterized by a number of independent variables. These include the magnitude of the response; the functional quality of the response, i.e. the types of cytokines secreted after stimulation and the proliferative or lytic potential; the tissue distribution of the T cells; the breadth of the response; and the avidity of the response. All of these together constitute the T-cell response to antigen (Ag) and comprise potential variables that may correlate with antiviral protective immunity. Substantial advances have recently been obtained in the characterization of virus-specific T-cell responses. These studies have shown that the quality (in term of functional profile) rather than the quantity of Ag-specific T cells was associated with protection. Recently, the term polyfunctional has been used to define T-cell responses that, in addition to typical effector functions such as secretion of IFN-g, TNF-a and MIP-1b and cytotoxic activity, comprise distinct T-cell populations, also able to secrete IL-2 and retaining Ag-specific proliferation capacity. The term \only effector" defines T-cell responses/ populations able to secrete cytokines such as IFN-g, TNF-a and MIP-1b and endowed with cytotoxic activity but lacking IL-2 and proliferation capacity. Several models of virus infections (HIV-1, cytomegalovirus [CMV], Epstein Barr virus [EBV], influenza [Flu] and Herpes Simplex virus) exclusively differentiated on the basis of Ag exposure and persistence, were investigated: 1) antigen clearance, 2) protracted Ag exposure and persistence and low Ag levels, 3) Ag persistence and high Ag levels, and 4) acute Ag exposure/re-exposure. These analyses have demonstrated that polyfunctional and not \only effector" T-cell responses were associated with protective antiviral immunity. However, the factors and mechanisms governing the generation of functionally distinct T-cell populations remain to be elucidated. Recently, several studies have shown a major influence of HLA genotype in the evolution of HIV and the progression of HIV-associated disease. In particular, certain HLA-B alleles were most closely associated with non-progressive disease and low viral load or disease and had a dominant involvement on the clinical course of HIV-associated diseases. In this study, we have investigated the relationship between HLA restriction and the functional profile of Tcell responses in order to determine whether HLA-B influenced the generation of polyfunctional CD8 T-cell responses. To be able to address this issue, we studied CD8 T-cell responses against HIV-1, CMV, EBV and Flu in 128 subjects. These analyses enabled us to demonstrate that HLA-Arestricted epitopes were mostly associated with \only effector" T-cell responses while, in contrast, polyfunctional CD8 T-cell responses were predominantly driven by virus epitopes restricted by HLA-B alleles. We then characterized eventual differences in the responsiveness of CD8 T-cell populations restricted by different HLA-A and HLA-B alleles. For this purpose, we investigated the T-cell receptor (TCR) avidity for the cognate epitope of polyfunctional and \only effector" CD8 T-cell populations. Our results indicated that overall virus-specific CD8 T-cell populations recognizing virus epitopes restricted by HLA-B alleles were equipped with lower avidity TCR for the cognate epitopes when compared to those recognizing epitopes restricted by HLA-A alleles. In conclusion, these results provide the rationale for the observed protective role of HLA-B genotypes in HIV-1- infection and new insights into the relationship between TCR avidity and functional profile of virus-specific CD8 Tcells.

Performance aux tests d'intelligence : vers une inversion de l'effet Flynn ?

Des nombreuses études ont montré une augmentation des scores aux tests d'aptitudes à travers les générations (« effet Flynn »). Différentes hypothèses d'ordre biologique, social et/ou éducationnels ont été élaborées afin d'expliquer ce phénomène. L'objectif de cette recherche est d'examiner l'évolution des performances aux tests d'aptitudes sur la base d'étalonnages datant de 1991 et de 2002. Les résultats suggèrent une inversion non homogène de l'effet Flynn. La diminution concerne plus particulièrement les tests d'aptitudes scolaires, comme ceux évaluant le facteur verbal et numérique. Cette étude pourrait refléter un changement de l'importance accordée aux différentes aptitudes peu évaluées en orientation scolaire et professionnelle.

Impact of genetic polymorphisms in cytomegalovirus glycoprotein B on outcomes in solid organ transplant recipients with cytomegalovirus disease

Le cytomégalovirus (CMV) est le pathogène viral le plus important après transplantation d'organe. Le risque de développer une maladie à CMV chez les patients transplantés dépend d'une combinaison de facteurs de l'hôte et de facteurs viraux. Par exemple, il est bien établi que le status sérologique à CMV du donneur et du receveur est un facteur de risque très important pour développer une maladie à CMV, notamment chez le sous-groupe de patients donneurs positifs / receveurs négatifs (D+/R-). Par contre, il n'est pas complètement élucidé si des polymorphismes viraux spécifiques peuvent influencer l'évolution en la réponse thérapeutique chez des patients avec une infection à CMV. Nous avons évalué le rôle des différents génotypes de la glycoprotéine Β (gB) du CMV sur l'évolution clinique et virologique de la maladie à CMV chez des patients transplantés d'organe sous traitement antiviral.¦Pour ce faire, nous avons étudié 239 patients transplantés d'organe inclus dans une étude multicentrique évaluant deux médicaments antiviraux utilisés comme traitement de la maladie à CMV. Le génotypage de la gB du CMV a été réalisé en utilisant une PCR quantitative en temps réel au début du traitement antiviral. Les polymorphismes de la gB du CMV permettent la discrimination de quatre génotypes distincts (gBl, gB2, gB3 et gB4). Nous avons défini une infection mixte comme la présence simultanée de plus d'un génotype chez un patient avec maladie à CMV.¦La prévalence des différents génotypes de la gB a été 26% pour la gBl, 10% pour la gB2, 10% pour la gB3, et 5% pour la gB4, alors que les infections mixtes étaient présentes dans 49% des cas. Les patients D+/R+ présentaient plus fréquemment une infection mixte que les patients D+/R- (40% vs 12%, ρ <0.001). Les patients avec une infection mixte présentaient une médiane de la charge virale à CMV plus élevée et un temps d'éradication virale plus long comparé à des patients avec une infection par un génotype unique (p=0.005 et p=0.026, respectivement). Dans un modèle multivarié, les infections mixtes étaient un prédicteur important de l'échec de l'éradication de virus au jour 21 du début du traitement antiviral (rapport de côtes entre l'infection mixte vs. infection par un génotype unique = 2.66, intervalle de confiance à 95%= 1.31 à 5.38, p= 0.007). Aucun effet du génotype gB sur le développement d'une récidive clinique ou virologique de l'infection à CMV a été observé.¦Ces résultats indiquent qu'aucun génotype spécifique de la gB ne semble conférer un avantage de virulence au CMV. Cependant, les infections mixtes avec plusieurs génotypes de la gB sont associées à une charge virale plus élevée et à un retard de l'éradication virale suite au traitement antiviral.