Tolerogenic dendritic cells and their role in induction of immune tolerance

Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire qui permettent d'instruire les lymphocytes T, autres cellules de ce système, pour mettre en place une réponse immunitaire adaptée afin de combattre et vaincre une infection. Ces cellules dendritiques vont reconnaître des motifs spécifiquement exprimés par des pathogènes par l'intermédiaire de récepteurs exprimés à leur surface. En détectant ces molécules, elles vont s'activer et subir diverses modifications pour pouvoir activer les lymphocytes T. Elles vont alors interagir avec les lymphocytes Τ et transférer les informations nécessaires pour que ces cellules s'activent à leur tour et produisent différentes protéines de façon à éliminer le pathogène. En fonction du type de pathogène, les informations transférées entre les cellules dendritiques et les lymphocytes seront différentes de manière à produire la réponse immunitaire la mieux adaptée pour supprimer l'élément infectieux. Dans le corps, les cellules dendritiques circulent continuellement afin de détecter les éléments étrangers. Quand elles reconnaissent une protéine étrangère, elles la phagocytent, c'est-à-dire qu'elles la mangent afin de pouvoir la présenter aux lymphocytes T. Mais quand elles phagocytent un élément étranger, elles peuvent également prendre des éléments du soi, comme par exemple quand elles phagocytent une cellule infectée par un virus. Les cellules dendritiques doivent alors être capables de différentier les molécules du soi et du non-soi de façon à ne pas induire une réponse en présentant un antigène du soi aux lymphocytes T. D'autant plus que lors de leur développement, les lymphocytes Τ qui sont capables de reconnaître le soi sont éliminés mais ce système n'est pas parfait et donc certains lymphocytes Τ auto-reactifs peuvent se trouver dans le corps. Il existe ainsi d'autres mécanismes en périphérie du site de développement pour inhiber ces lymphocytes Τ auto-reactifs. Ce sont les mécanismes de tolérance. Quand les lymphocytes Τ induisent une réponse aux antigènes du soi, cela résulte à des maladies auto-immunes. Dans mon projet de recherche, nous avons travaillé avec des lignées de cellules dendritiques, c'est-à-dire des cellules dendritiques semblables à celles que l'on peut trouver in vivo mais qui sont immortalisées, elles peuvent donc être cultiver et manipuler in vitro. Nous avons génétiquement modifiées ces lignées cellulaires pour qu'elles expriment des molécules immunosuppressives afin d'étudier comment induire une tolérance immunitaire, c'est-à-dire si l'expression de ces molécules permet d'éviter de générer une réponse immunitaire. Pour cela, nous avons utilisé des modèles murins de tumeurs et de maladies auto-immunes. Nous avons démontré que ces lignées de cellules dendritiques peuvent être un grand outil de recherche pour étudier les bénéfices de différentes molécules immuno-modulatrices afin d'induire une tolérance immunitaire à différents antigènes. - Les cellules dendritiques sont responsables de l'induction des réponses immunitaires adaptatives. Suite à une infection microbienne, les cellules dendritiques s'activent, elles induisent l'expression de molécules de costimulation à leur surface, sécrètent des cytokines et induisent la différentiation des cellules Τ effectrices et mémoires. De plus, les cellules dendritiques ont un rôle important dans l'induction et la maintenance de la tolérance immunitaire au niveau du thymus et en périphérie, en induisant l'anergie, la délétion ou la conversion des cellules Τ naïves en cellules régulatrices. Dans notre groupe, une nouvelle lignée de cellules dendritiques appelée MuTu a été crée par la culture de cellules dendritiques tumorales isolées à partir d'une rate d'une souris transgénique, dans laquelle l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP sont sous le contrôle du promoteur CD1 le, et sont ainsi spécifiquement exprimés dans les cellules dendritiques. Ces nouvelles lignées appartiennent au sous-type des cellules dendritiques conventionnelles exprimant CD8a. Elles ont conservé leur capacité d'augmenter l'expression des marqueurs de costimulation à leur surface ainsi que le production de cytokines en réponse à des ligands des récepteurs Toll, ainsi que leur capacité à présenter des antigènes associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I ou II pour activer la prolifération et la différentiation des lymphocytes T. En utilisant un système de transduction de lentivirus de seconde génération, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques ont été génétiquement modifiées pour sur-exprimer des molécules immunosuppressives (IL-10, TGFP latent, TGFp actif, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC et CTLA4). Ces lignées permettent d'étudier de manière reproductible le rôle de ces molécules potentiellement tolérogènes sur les réponses immunitaires in vitro et in vivo. Ces lignées potentiellement tolérogènes ont été testées, tout d'abord, in vitro, pour leur capacité à inhiber l'activation des cellules dendritiques, à bloquer la prolifération des cellules Τ ou à modifier leur polarisation. Nos résultats démontrent qu'en réponse à une stimulation, la sur-expression des molécules costimulatrices et la sécrétion de molécules pro- inflammatoires est réduite quand les cellules dendritiques sur-expriment l'IL-10. La sur¬expression de TGFp sous sa forme active induit le développement de cellules régulatrices CD4+ CD25+ Foxp3+ et bloque la réponse CD8 cytotoxique tandis que la sur-expression de CTLA4 à la surface des cellules dendritiques inhibe une réponse Thl et induit des lymphocytes Τ anergiques. Ces lignées ont également été utilisées pour étudier l'induction de tolérance in vivo. Tout d'abord, nous avons étudié l'induction de tolérance dans un modèle de développement de tumeurs. En effet, quand les lignées tumorales sont transférées dans les lignées de souris C57BL/6, elles sont reconnues comme du non-soi du à l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP et sont éliminées. Ce mécanisme d'élimination a été étudié en utilisant une lignée de cellules dendritiques modifiée pour exprimer la luciférase et qui a permis de suivre le développement des tumeurs par de l'imagerie in vivo dans des animaux vivants. Ces lignées de cellules dendritiques MuTu sont éliminées dans la souris C57BL/6 par les lymphocytes CD8 et l'action cytotoxique de la perforine. Après plusieurs injections, les cellules dendritiques sur-exprimant CTLA4 ou l'actif TGFp peuvent casser cette réponse immunitaire inhérente aux antigènes de la lignée et induire le développement de la tumeur dans la souris C57BL/6. Le développement tumoral a pu être suivi en mesurant la bioluminescence émise par des cellules dendritiques modifiées pour exprimer à la fois l'actif TGFp et la luciférase. Ces tumeurs ont pu se développer grâce à la mise en place d'un microenvironnement suppressif pour échapper à l'immunité en recrutant des cellules myéloïde suppressives, des lymphocytes CD4 régulateurs et en induisant l'expression d'une molécule inhibitrice PD-1 à la surface des lymphocytes CD8 infiltrant la tumeur. Dans un deuxième temps, ces lignées tolérogènes ont également été testées dans un modèle murin de maladies auto-immunes, appelé l'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE), qui est un modèle pour la sclérose en plaques. L'EAE a été induite dans la souris par le transfert de cellules de ganglions prélevées d'une souris donneuse préalablement immunisée avec une protéine du système nerveux central, la glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG) émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund. La vaccination des souris donneuses et receveuses avec les cellules sur-exprimant l'actif TGFP préalablement chargées avec la protéine MOG bloque l'induction de l'EAE. Nous sommes actuellement en train de définir les mécanismes qui permettent de protéger la souris du développement de la maladie auto-immune. Dans cette étude, nous avons ainsi démontré la possibilité d'induire la tolérance in vivo et in vitro à différents antigènes en utilisant nos nouvelles lignées de cellules dendritiques et en les modifiant pour exprimer des molécules immunosuppressives. En conséquence, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques représentent un outil pour explorer les bénéfices de différentes molécules ayant des propriétés immuno-modulatrices pour manipuler le système immunitaire vers un phénotype tolérogène. - Dendritic cells (DC) are widely recognized as potent inducers of the adaptive immune responses. Importantly, after microbial infections, DC become activated, induce co- stimulation, secrete cytokines and induce effector and memory Τ cells. DC furthermore play an important role in inducing and maintaining central and peripheral tolerance by inducing anergy, deletion or commitment of antigen-specific naïve Τ cells into regulatory Τ cells. In our group, stable MuTu DC lines were generated by culture of splenic DC tumors from transgenic mice expressing the SV40 large Τ oncogene and the GFP under DC-specific CDllc promoter. These transformed DC belong to the CD8a+ conventional DC subtype and have fully conserved their capacity to upregulate co-stimulatory markers and produce cytokines after activation with Toll Like Receptors-ligands, and to present Major Histocompatibility class-I or MHCII-restricted antigens to activate Τ cell expansion and differentiation. Using a second- generation lentiviral transduction system, these newly developed MuTu DC lines were genetically modified to overexpress immunosuppressive molecules (IL-10, latent TGFp, active TGFp, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC and CTLA4). This allows to reproducibly investigate the role of these potentially tolerogenic molecules on in vitro and in vivo immune responses. These potentially tolerogenic DC were tested in vitro for their ability to inhibit DC activation, to prevent Τ cell proliferation and to modify Τ cell polarization. Our results show that the upregulation of costimulatory molecules and the secretion of pro-inflammatory cytokines were reduced upon stimulation of DC overexpressing IL-10. The overexpression of active TGFP induced the development of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and inhibited the cytotoxic CD8 Τ cell response as shown by using the OT-II Τ cell system whereas the surface expression of CTLA-4 on DC prevented the Thl response and prompted an anergic antigen-specific Τ cell response. These MuTu DC lines were also used in vivo in order to study the induction of tolerance. First we addressed the induction of tolerance in a model of tumorogenesis. The adoptively transferred tumor cell lines were cleared in C57BL/6 mice due to the foreign expression of SV40 LargeT and GFP. The mechanism of clearance of MuTu DC line into C57BL/6 mice was investigated by using luciferase-expressing DC line. These DC line allowed to follow, by in vivo imaging, the tumor development in living animals and determined that MuTu DC lines were eliminated in a perforin-mediated CD8 Τ cell dependent and CD4 Τ cell independent response. After multiple injections, DC overexpressing CTLA4 or active TGFp could break the immune response to these inherent antigens and induced DC tumorogenesis in wild type mice. The tumor outgrowth in C57BL/6 mice was nicely observed by double-transduced DC lines to express both luciferase and active TGFp. actTGFp-DC tumor was shown to recruit myeloid-derived suppressor cells, induce CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and induce the expression of the inhibitory receptor PD-1 on tumor- infiltrating CD8+ Τ cells in order to escape tumor immunity. Tolerogenic DC lines were also tested for the induction of tolerance in a murine model of autoimmune disease, the experimental autoimmune encephalitis (EAE) model for human multiple sclerosis. EAE was induced in C57BL/6 mice by the adoptive transfer of lymph node cells isolated from donor mice previously immunized by a protein specific to the central nervous system, the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) emulsified in the complete freund adjuvant. The vaccination of donor and recipient mice with MOG-pulsed actTGFP-DC line prevented EAE induction. We are still investigating how the active TGFP protect mice from EAE development. We generated tolerogenic DC lines inducing tolerance in vitro and in vivo. Thereby these MuTu DC lines represent a great tool to explore the benefits of various immuno-modulatory molecules to manipulate the immune system toward a tolerogenic phenotype.

ACID-SENSING ION CHANNELS: functional and molecular characterization in putative nociceptors, and modulation by nerve injury and serine protease

Résumé Les canaux ioniques ASICs (acid-sensing ion channels) appartiennent à la famille des canaux ENaC/Degenerin. Pour l'instant, quatre gènes (1 à 4) ont été clonés dont certains présentent des variants d'épissage. Leur activation par une acidification rapide du milieu extracellulaire génère un courant entrant transitoire essentiellement sodique accompagné pour certains types d'ASICs d'une phase soutenue. Les ASICs sont exprimés dans le système nerveux, central (SNC) et périphérique (SNP). On leur attribue un rôle dans l'apprentissage, la mémoire et l'ischémie cérébrale au niveau central ainsi que dans la nociception (douleur aiguë et inflammatoire) et la méchanotransduction au niveau périphérique. Toutefois, les données sont parfois contradictoires. Certaines études suggèrent qu'ils sont des senseurs primordiaux impliqués dans la détection de l'acidification et la douleur. D'autres études suggèrent plutôt qu'ils ont un rôle modulateur inhibiteur dans la douleur. De plus, le fait que leur activation génère majoritairement un courant transitoire alors que les fibres nerveuses impliquées dans la douleur répondent à un stimulus nocif avec une adaptation lente suggère que leurs propriétés doivent être modulés par des molécules endogènes. Dans une première partie de ma thèse, nous avons abordé la question de l'expression fonctionnelle des ASICs dans les neurones sensoriels primaires afférents du rat adulte pour clarifier le rôle des ASICs dans les neurones sensoriels. Nous avons caractérisé leurs propriétés biophysiques et pharmacologiques par la technique du patch-clamp en configuration « whole-cell ». Nous avons pu démontrer que près de 60% des neurones sensoriels de petit diamètre expriment des courants ASICs. Nous avons mis en évidence trois types de courant ASIC dans ces neurones. Les types 1 et 3 ont des propriétés compatibles avec un rôle de senseur du pH alors que le type 2 est majoritairement activé par des pH inférieurs à pH6. Le type 1 est médié par des homomers de la sous-unité ASIC1 a qui sont perméables aux Ca2+. Nous avons étudié leur co-expression avec des marqueurs des nocicepteurs ainsi que la possibilité d'induire une activité neuronale suite à une acidification qui soit dépendante des ASICs. Le but était d'associer un type de courant ASIC avec une fonction potentielle dans les neurones sensoriels. Une majorité des neurones exprimant les courants ASIC co-expriment des marqueurs des nocicepteurs. Toutefois, une plus grande proportion des neurones exprimant le type 1 n'est pas associée à la nociception par rapport aux types 2 et 3. Nous avons montré qu'il est possible d'induire des potentiels d'actions suite à une acidification. La probabilité d'induction est proportionnelle à la densité des courants ASIC et à l'acidité de la stimulation. Puis, nous avons utilisé cette classification comme un outil pour appréhender les potentielles modulations fonctionnelles des ASICs dans un model de neuropathie (spared nerve injury). Cette approche fut complétée par des expériences de «quantitative RT-PCR ». En situation de neuropathie, les courants ASIC sont dramatiquement changés au niveau de leur expression fonctionnelle et transcriptionnelle dans les neurones lésés ainsi que non-lésés. Dans une deuxième partie de ma thèse, suite au test de différentes substances sécrétées lors de l'inflammation et l'ischémie sur les propriétés des ASICs, nous avons caractérisé en détail la modulation des propriétés des courants ASICs notamment ASIC1 par les sérines protéases dans des systèmes d'expression recombinants ainsi que dans des neurones d'hippocampe. Nous avons montré que l'exposition aux sérine-protéases décale la dépendance au pH de l'activation ainsi que la « steady-state inactivation »des ASICs -1a et -1b vers des valeurs plus acidiques. Ainsi, l'exposition aux serine protéases conduit à une diminution du courant quand l'acidification a lieu à partir d'un pH7.4 et conduit à une augmentation du courant quand l'acidification alleu à partir d'un pH7. Nous avons aussi montré que cette régulation a lieu des les neurones d'hippocampe. Nos résultats dans les neurones sensoriels suggèrent que certains courants ASICs sont impliqués dans la transduction de l'acidification et de la douleur ainsi que dans une des phases du processus conduisant à la neuropathie. Une partie des courants de type 1 perméables au Ca 2+ peuvent être impliqués dans la neurosécrétion. La modulation par les sérines protéases pourrait expliquer qu'en situation d'acidose les canaux ASICs soient toujours activables. Résumé grand publique Les neurones sont les principales cellules du système nerveux. Le système nerveux est formé par le système nerveux central - principalement le cerveau, le cervelet et la moelle épinière - et le système nerveux périphérique -principalement les nerfs et les neurones sensoriels. Grâce à leur nombreux "bras" (les neurites), les neurones sont connectés entre eux, formant un véritable réseau de communication qui s'étend dans tout le corps. L'information se propage sous forme d'un phénomène électrique, l'influx nerveux (ou potentiels d'actions). A la base des phénomènes électriques dans les neurones il y a ce que l'on appelle les canaux ioniques. Un canal ionique est une sorte de tunnel qui traverse l'enveloppe qui entoure les cellules (la membrane) et par lequel passent les ions. La plupart de ces canaux sont normalement fermés et nécessitent d'être activés pour s'ouvrire et générer un influx nerveux. Les canaux ASICs sont activés par l'acidification et sont exprimés dans tout le système nerveux. Cette acidification a lieu notamment lors d'une attaque cérébrale (ischémie cérébrale) ou lors de l'inflammation. Les expériences sur les animaux ont montré que les canaux ASICs avaient entre autre un rôle dans la mort des neurones lors d'une attaque cérébrale et dans la douleur inflammatoire. Lors de ma thèse je me suis intéressé au rôle des ASICs dans la douleur et à l'influence des substances produites pendant l'inflammation sur leur activation par l'acidification. J'ai ainsi pu montrer chez le rat que la majorité des neurones sensoriels impliqués dans la douleur ont des canaux ASICs et que l'activation de ces canaux induit des potentiels d'action. Nous avons opéré des rats pour qu'ils présentent les symptômes d'une maladie chronique appelée neuropathie. La neuropathie se caractérise par une plus grande sensibilité à la douleur. Les rats neuropathiques présentent des changements de leurs canaux ASICs suggérant que ces canaux ont une peut-être un rôle dans la genèse ou les symptômes de cette maladie. J'ai aussi montré in vitro qu'un type d'enryme produit lors de l'inflammation et l'ischémie change les propriétés des ASICs. Ces résultats confirment un rôle des ASICs dans la douleur suggérant notamment un rôle jusque là encore non étudié dans la douleur neuropathique. De plus, ces résultats mettent en évidence une régulation des ASICs qui pourrait être importante si elle se confirmait in vivo de part les différents rôles des ASICs. Abstract Acid-sensing ion channels (ASICs) are members of the ENaC/Degenerin superfamily of ion channels. Their activation by a rapid extracellular acidification generates a transient and for some ASIC types also a sustained current mainly mediated by Na+. ASICs are expressed in the central (CNS) and in the peripheral (PNS) nervous system. In the CNS, ASICs have a putative role in learning, memory and in neuronal death after cerebral ischemia. In the PNS, ASICs have a putative role in nociception (acute and inflammatory pain) and in mechanotransduction. However, studies on ASIC function are somewhat controversial. Some studies suggest a crucial role of ASICs in transduction of acidification and in pain whereas other studies suggest rather a modulatory inhibitory role of ASICs in pain. Moreover, the basic property of ASICs, that they are activated only transiently is irreconcilable with the well-known property of nociception that the firing of nociceptive fibers demonstrated very little adaptation. Endogenous molecules may exist that can modulate ASIC properties. In a first part of my thesis, we addressed the question of the functional expression of ASICs in adult rat dorsal root ganglion (DRG) neurons. Our goal was to elucidate ASIC roles in DRG neurons. We characterized biophysical and pharmacological properties of ASIC currents using the patch-clamp technique in the whole-cell configuration. We observed that around 60% of small-diameter sensory neurons express ASICs currents. We described in these neurons three ASIC current types. Types 1 and 3 have properties compatible with a role of pH-sensor whereas type 2 is mainly activated by pH lower than pH6. Type 1 is mediated by ASIC1a homomultimers which are permeable to Ca 2+. We studied ASIC co-expression with nociceptor markers. The goal was to associate an ASIC current type with a potential function in sensory neurons. Most neurons expressing ASIC currents co-expressed nociceptor markers. However, a higher proportion of the neurons expressing type 1 was not associated with nociception compared to type 2 and -3. We completed this approach with current-clamp measurements of acidification-induced action potentials (APs). We showed that activation of ASICs in small-diameter neurons can induce APs. The probability of AP induction is positively correlated with the ASIC current density and the acidity of stimulation. Then, we used this classification as a tool to characterize the potential functional modulation of ASICs in the spared nerve injury model of neuropathy. This approach was completed by quantitative RT-PCR experiments. ASICs current expression was dramatically changed at the functional and transcriptional level in injured and non-injured small-diameter DRG neurons. In a second part of my thesis, following an initial screening of the effect of various substances secreted during inflammation and ischemia on ASIC current properties, we characterized in detail the modulation of ASICs, in particular of ASIC1 by serine proteases in a recombinant expression system as well as in hippocampal neurons. We showed that protease exposure shifts the pH dependence of ASIC1 activation and steady-state inactivation to more acidic pH. As a consequence, protease exposure leads to a decrease in the current response if ASIC1 is activated by a pH drop from pH 7.4. If, however, acidification occurs from a basal pH of 7, protease-exposed ASIC1a shows higher activity than untreated ASIC1a. We provided evidence that this bi-directional regulation of ASIC1a function also occurs in hippocampal neurons. Our results in DRG neurons suggest that some ASIC currents are involved in the transduction of peripheral acidification and pain. Furthermore, ASICs may participate to the processes leading to neuropathy. Some Ca 2+-permeable type 1 currents may be involved in neurosecretion. ASIC modulation by serine proteases may be physiologically relevant, allowing ASIC activation under sustained slightly acidic conditions.

Evolution and functional characterisation of the IR chemosensory receptors in the Drosophila larval gustatory system

Chemosensory receptor gene families encode divergent proteins capable of detecting a huge diversity of environmental stimuli that are constantly changing over evolutionary time as organisms adapt to distinct ecological niches. While olfaction is dedicated to the detection of volatile compounds, taste is key to assess food quality for nutritional value and presence of toxic substances. The sense of taste also provides initial signals to mediate endocrine regulation of appetite and food metabolism and plays a role in kin recognition. The fruit fly Drosophila melanogaster is a very good model for studying smell and taste because these senses are very important in insects and because a broad variety of genetic tools are available in Drosophila. Recently, a family of 66 chemosensory receptors, the Ionotropic Receptors (IRs) was described in fruit flies. IRs are distantly related to ionotropic glutamate receptors (iGluRs), but their evolutionary origin from these synaptic receptors is unclear. While 16 IRs are expressed in the olfactory system, nothing is known about the other members of this repertoire. In this thesis, I describe bioinformatic, expression and functional analyses of the IRs aimed at understanding how these receptors have evolved, and at characterising the role of the non-olfactory IRs. I show that these have emerged at the basis of the protostome lineage and probably have acquired their sensory function very early. Moreover, although several IRs are conserved across insects, there are rapid and dramatic changes in the size and divergence of IR repertoires across species. I then performed a comprehensive analysis of IR expression in the larva of Drosophila melanogaster, which is a good model to study taste and feeding mechanisms as it spends most of its time eating or foraging. I found that most of the divergent members of the IR repertoire are expressed in both peripheral and internal gustatory neurons, suggesting that these are involved in taste perception. Finally, through the establishment of a new neurophysiological assay in larvae, I identified for the first time subsets of IR neurons that preferentially detect sugars and amino acids, indicating that IRs might be involved in sensing these compounds. Together, my results indicate that IRs are an evolutionarily dynamic and functionally versatile family of receptors. In contrast to the olfactory IRs that are well-conserved, gustatory IRs are rapidly evolving species-specific receptors that are likely to be involved in detecting a wide variety of tastants. - La plupart des animaux possèdent de grandes familles de récepteurs chimiosensoriels dont la fonction est de détecter l'immense diversité de composés chimiques présents dans l'environnement. Ces récepteurs évoluent en même temps que les organismes s'adaptent à leur écosystème. Il existe deux manières de percevoir ces signaux chimiques : l'olfaction et le goût. Alors que le système olfactif perçoit les composés volatiles, le sens du goût permet d'évaluer, par contact, la qualité de la nourriture, de détecter des substances toxiques et de réguler l'appétit et le métabolisme. L'un des organismes modèles les plus pertinents pour étudier le sens du goût est le stade larvaire de la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster. En effet, la principale fonction du stade larvaire est de trouver de la nourriture et de manger. De plus, il est possible d'utiliser tous les outils génétiques développés chez la drosophile. Récemment, une nouvelle famille de 66 récepteurs chimiosensoriels appelés Récepteurs Ionotropiques (IRs) a été découverte chez la drosophile. Bien que leur orogine soit peu claire, ces récepteurs sont similaires aux récepteurs ionotropiques glutamatergiques impliqués dans la transmission synaptique. 16 IRs sont exprimés dans le système olfactif de la mouche adulte, mais pour l'instant on ne connaît rien des autres membres de cette famille. Durant ma thèse, j'ai effectué des recherches sur l'évolution de ces récepteurs ainsi que sur l'expression et la fonction des IRs non olfactifs. Je démontre que les IRs sont apparus chez l'ancêtre commun des protostomiens et ont probablement acquis leur fonction sensorielle très rapidement. De plus, bien qu'un certain nombre d'IRs olfactifs soient conservés chez les insectes, d'importantes variations dans la taille et la divergence des répertoires d'IRs entre les espèces ont été constatées. J'ai également découvert qu'un grand nombre d'IRs non olfactifs sont exprimés dans différents organes gustatifs, ce qui leur confère probablement une fonction dans la perception des goûts. Finalement, pour la première fois, des neurones exprimant des IRs ont été identifiés pour leur fonction dans la perception de sucres et d'acides aminés chez la larve. Mes résultats présentent les IRs comme une famille très dynamique, aux fonctions très variées, qui joue un rôle tant dans l'odorat que dans le goût, et dont la fonction est restée importante tout au long de l'évolution. De plus, l'identification de neurones spécialisés dans la perception de certains composés permettra l'étude des circuits neuronaux impliqués dans le traitement de ces informations.

The Hydrophobic interaction: modeling hydrophobic interactions and aggregation of non-polar particles in aqueous solutions

Malgré son importance dans notre vie de tous les jours, certaines propriétés de l?eau restent inexpliquées. L'étude des interactions entre l'eau et les particules organiques occupe des groupes de recherche dans le monde entier et est loin d'être finie. Dans mon travail j'ai essayé de comprendre, au niveau moléculaire, ces interactions importantes pour la vie. J'ai utilisé pour cela un modèle simple de l'eau pour décrire des solutions aqueuses de différentes particules. Récemment, l?eau liquide a été décrite comme une structure formée d?un réseau aléatoire de liaisons hydrogènes. En introduisant une particule hydrophobe dans cette structure à basse température, certaines liaisons hydrogènes sont détruites ce qui est énergétiquement défavorable. Les molécules d?eau s?arrangent alors autour de cette particule en formant une cage qui permet de récupérer des liaisons hydrogènes (entre molécules d?eau) encore plus fortes : les particules sont alors solubles dans l?eau. A des températures plus élevées, l?agitation thermique des molécules devient importante et brise les liaisons hydrogènes. Maintenant, la dissolution des particules devient énergétiquement défavorable, et les particules se séparent de l?eau en formant des agrégats qui minimisent leur surface exposée à l?eau. Pourtant, à très haute température, les effets entropiques deviennent tellement forts que les particules se mélangent de nouveau avec les molécules d?eau. En utilisant un modèle basé sur ces changements de structure formée par des liaisons hydrogènes j?ai pu reproduire les phénomènes principaux liés à l?hydrophobicité. J?ai trouvé une région de coexistence de deux phases entre les températures critiques inférieure et supérieure de solubilité, dans laquelle les particules hydrophobes s?agrègent. En dehors de cette région, les particules sont dissoutes dans l?eau. J?ai démontré que l?interaction hydrophobe est décrite par un modèle qui prend uniquement en compte les changements de structure de l?eau liquide en présence d?une particule hydrophobe, plutôt que les interactions directes entre les particules. Encouragée par ces résultats prometteurs, j?ai étudié des solutions aqueuses de particules hydrophobes en présence de co-solvants cosmotropiques et chaotropiques. Ce sont des substances qui stabilisent ou déstabilisent les agrégats de particules hydrophobes. La présence de ces substances peut être incluse dans le modèle en décrivant leur effet sur la structure de l?eau. J?ai pu reproduire la concentration élevée de co-solvants chaotropiques dans le voisinage immédiat de la particule, et l?effet inverse dans le cas de co-solvants cosmotropiques. Ce changement de concentration du co-solvant à proximité de particules hydrophobes est la cause principale de son effet sur la solubilité des particules hydrophobes. J?ai démontré que le modèle adapté prédit correctement les effets implicites des co-solvants sur les interactions de plusieurs corps entre les particules hydrophobes. En outre, j?ai étendu le modèle à la description de particules amphiphiles comme des lipides. J?ai trouvé la formation de différents types de micelles en fonction de la distribution des regions hydrophobes à la surface des particules. L?hydrophobicité reste également un sujet controversé en science des protéines. J?ai défini une nouvelle échelle d?hydrophobicité pour les acides aminés qui forment des protéines, basée sur leurs surfaces exposées à l?eau dans des protéines natives. Cette échelle permet une comparaison meilleure entre les expériences et les résultats théoriques. Ainsi, le modèle développé dans mon travail contribue à mieux comprendre les solutions aqueuses de particules hydrophobes. Je pense que les résultats analytiques et numériques obtenus éclaircissent en partie les processus physiques qui sont à la base de l?interaction hydrophobe.<br/><br/>Despite the importance of water in our daily lives, some of its properties remain unexplained. Indeed, the interactions of water with organic particles are investigated in research groups all over the world, but controversy still surrounds many aspects of their description. In my work I have tried to understand these interactions on a molecular level using both analytical and numerical methods. Recent investigations describe liquid water as random network formed by hydrogen bonds. The insertion of a hydrophobic particle at low temperature breaks some of the hydrogen bonds, which is energetically unfavorable. The water molecules, however, rearrange in a cage-like structure around the solute particle. Even stronger hydrogen bonds are formed between water molecules, and thus the solute particles are soluble. At higher temperatures, this strict ordering is disrupted by thermal movements, and the solution of particles becomes unfavorable. They minimize their exposed surface to water by aggregating. At even higher temperatures, entropy effects become dominant and water and solute particles mix again. Using a model based on these changes in water structure I have reproduced the essential phenomena connected to hydrophobicity. These include an upper and a lower critical solution temperature, which define temperature and density ranges in which aggregation occurs. Outside of this region the solute particles are soluble in water. Because I was able to demonstrate that the simple mixture model contains implicitly many-body interactions between the solute molecules, I feel that the study contributes to an important advance in the qualitative understanding of the hydrophobic effect. I have also studied the aggregation of hydrophobic particles in aqueous solutions in the presence of cosolvents. Here I have demonstrated that the important features of the destabilizing effect of chaotropic cosolvents on hydrophobic aggregates may be described within the same two-state model, with adaptations to focus on the ability of such substances to alter the structure of water. The relevant phenomena include a significant enhancement of the solubility of non-polar solute particles and preferential binding of chaotropic substances to solute molecules. In a similar fashion, I have analyzed the stabilizing effect of kosmotropic cosolvents in these solutions. Including the ability of kosmotropic substances to enhance the structure of liquid water, leads to reduced solubility, larger aggregation regime and the preferential exclusion of the cosolvent from the hydration shell of hydrophobic solute particles. I have further adapted the MLG model to include the solvation of amphiphilic solute particles in water, by allowing different distributions of hydrophobic regions at the molecular surface, I have found aggregation of the amphiphiles, and formation of various types of micelle as a function of the hydrophobicity pattern. I have demonstrated that certain features of micelle formation may be reproduced by the adapted model to describe alterations of water structure near different surface regions of the dissolved amphiphiles. Hydrophobicity remains a controversial quantity also in protein science. Based on the surface exposure of the 20 amino-acids in native proteins I have defined the a new hydrophobicity scale, which may lead to an improvement in the comparison of experimental data with the results from theoretical HP models. Overall, I have shown that the primary features of the hydrophobic interaction in aqueous solutions may be captured within a model which focuses on alterations in water structure around non-polar solute particles. The results obtained within this model may illuminate the processes underlying the hydrophobic interaction.<br/><br/>La vie sur notre planète a commencé dans l'eau et ne pourrait pas exister en son absence : les cellules des animaux et des plantes contiennent jusqu'à 95% d'eau. Malgré son importance dans notre vie de tous les jours, certaines propriétés de l?eau restent inexpliquées. En particulier, l'étude des interactions entre l'eau et les particules organiques occupe des groupes de recherche dans le monde entier et est loin d'être finie. Dans mon travail j'ai essayé de comprendre, au niveau moléculaire, ces interactions importantes pour la vie. J'ai utilisé pour cela un modèle simple de l'eau pour décrire des solutions aqueuses de différentes particules. Bien que l?eau soit généralement un bon solvant, un grand groupe de molécules, appelées molécules hydrophobes (du grecque "hydro"="eau" et "phobia"="peur"), n'est pas facilement soluble dans l'eau. Ces particules hydrophobes essayent d'éviter le contact avec l'eau, et forment donc un agrégat pour minimiser leur surface exposée à l'eau. Cette force entre les particules est appelée interaction hydrophobe, et les mécanismes physiques qui conduisent à ces interactions ne sont pas bien compris à l'heure actuelle. Dans mon étude j'ai décrit l'effet des particules hydrophobes sur l'eau liquide. L'objectif était d'éclaircir le mécanisme de l'interaction hydrophobe qui est fondamentale pour la formation des membranes et le fonctionnement des processus biologiques dans notre corps. Récemment, l'eau liquide a été décrite comme un réseau aléatoire formé par des liaisons hydrogènes. En introduisant une particule hydrophobe dans cette structure, certaines liaisons hydrogènes sont détruites tandis que les molécules d'eau s'arrangent autour de cette particule en formant une cage qui permet de récupérer des liaisons hydrogènes (entre molécules d?eau) encore plus fortes : les particules sont alors solubles dans l'eau. A des températures plus élevées, l?agitation thermique des molécules devient importante et brise la structure de cage autour des particules hydrophobes. Maintenant, la dissolution des particules devient défavorable, et les particules se séparent de l'eau en formant deux phases. A très haute température, les mouvements thermiques dans le système deviennent tellement forts que les particules se mélangent de nouveau avec les molécules d'eau. A l'aide d'un modèle qui décrit le système en termes de restructuration dans l'eau liquide, j'ai réussi à reproduire les phénomènes physiques liés à l?hydrophobicité. J'ai démontré que les interactions hydrophobes entre plusieurs particules peuvent être exprimées dans un modèle qui prend uniquement en compte les liaisons hydrogènes entre les molécules d'eau. Encouragée par ces résultats prometteurs, j'ai inclus dans mon modèle des substances fréquemment utilisées pour stabiliser ou déstabiliser des solutions aqueuses de particules hydrophobes. J'ai réussi à reproduire les effets dûs à la présence de ces substances. De plus, j'ai pu décrire la formation de micelles par des particules amphiphiles comme des lipides dont la surface est partiellement hydrophobe et partiellement hydrophile ("hydro-phile"="aime l'eau"), ainsi que le repliement des protéines dû à l'hydrophobicité, qui garantit le fonctionnement correct des processus biologiques de notre corps. Dans mes études futures je poursuivrai l'étude des solutions aqueuses de différentes particules en utilisant les techniques acquises pendant mon travail de thèse, et en essayant de comprendre les propriétés physiques du liquide le plus important pour notre vie : l'eau.

Le pergélisol dans les terrains sédimentaires à forte déclivité: distribution, régime thermique et instabilités

Résumé: Dans le contexte d'un climat de plus en plus chaud, la localisation du pergélisol dans les terrains sédimentaires à forte déclivité et l'évaluation des mouvements de terrain qui y ont cours s'avèrent primordiales. S'insérant dans cette problématique, ce travail de thèse s'articule autour de deux axes de recherche différents. D'un point de vue statique, cette recherche propose une étude de la distribution et des caractéristiques du pergélisol dans les éboulis de la zone périglaciaire alpine. D'un point de vue dynamique, une analyse de l'influence des caractéristiques du pergélisol (teneur en glace, température du pergélisol, etc.) et des variations des températures de l'air et du sol sur les vitesses de fluage des corps sédimentaires gelés est effectuée. Afin de répondre à ce double objectif, l'approche "terrain" a été privilégiée. Pour déterminer la répartition et les caractéristiques du pergélisol, les méthodes traditionnelles de prospection du pergélisol ont été utilisées, à savoir la mesure de la température du sol à la base du manteau neigeux (BTS), la mesure de la température du sol en continu ainsi que la méthode géoélectrique. Les mouvements de terrain ont pour leur part été mesurés à l'aide d'un GPS différentiel. L'étude de la distribution du pergélisol a été effectuée dans une quinzaine d'éboulis situés dans les régions du Mont Gelé (Verbier-Nendaz) et d'Arolla principalement. Dans la plupart des cas, un pergélisol a pu être mis en évidence dans la partie inférieure des accumulations sédimentaires, alors que la partie médiane des éboulis n'est, le plus souvent, pas gelée. Si cette absence de pergélisol se prolonge parfois dans les portions sommitales des pentes, les mesures réalisées montrent que dans d'autres cas des sédiments gelés y sont à nouveau présents. Les résistivités électriques mesurées dans les portions gelées des éboulis étudiés sont dans la plupart des cas nettement inférieures à celles mesurées sur les glaciers rocheux. Des études préalables ont montré que des circulations d'air internes sont responsables de l'anomalie thermique négative et, lorsqu'il existe, du pergélisol que l'on trouve dans la partie inférieure d'éboulis situés plus de 1000 m plus bas que la limite inférieure régionale du pergélisol discontinu. L'étude de quatre sites de basse altitude (1400-1900 m), et notamment l'équipement du site de Dreveneuse (Préalpes Valaisannes) avec deux forages, des capteurs de température de surface et un anémomètre a permis de vérifier et de préciser le mécanisme de ventilation actif au sein des éboulis froids de basse altitude. Ce mécanisme fonctionne de la manière suivante: en hiver, l'air contenu dans l'éboulis, plus chaud et plus léger que l'air extérieur, monte à l'intérieur de l'accumulation sédimentaire et est expulsé dans ses parties sommitales. Cet effet de cheminée provoque une aspiration d'air froid à l'intérieur de la partie inférieure de l'éboulis, causant ainsi un sur-refroidissement marqué du terrain. En été, le mécanisme s'inverse, l'éboulis étant plus froid que l'air environnant. De l'air froid est alors expulsé au bas de la pente. Une ventilation ascendante hivernale a pu être mise en évidence dans certains des éboulis de haute altitude étudiés. Elle est probablement en grande partie responsable de la configuration particulière des zones gelées observées. Même si l'existence d'un effet de cheminée n'a pu être démontrée dans tous les cas, du fait notamment de la glace interstitielle qui entrave le cheminement de l'air, des indices laissant présager son possible fonctionnement existent dans la quasi totalité des éboulis étudiés. L'absence de pergélisol à des altitudes qui lui sont favorables pourrait en tous les cas s'expliquer par un réchauffement du terrain lié à des expulsions d'air relativement chaud. L'étude des mouvements de terrain a été effectuée sur une dizaine de sites, principalement sur des glaciers rocheux, mais également sur une moraine de poussée et - II - Résumé ? abstract quelques éboulis. Plusieurs glaciers rocheux présentent des formes de déstabilisation récente (niches d'arrachement, blocs basculés, apparition de la matrice fine à la surface, etc.), ce qui témoigne d'une récente accélération des vitesses de déplacement. Ce phénomène, qui semble général à l'échelle alpine, est probablement à mettre sur le compte du réchauffement du pergélisol depuis une vingtaine d'années. Les vitesses mesurées sur ces formations sont souvent plus élevées que les valeurs habituellement proposées dans la littérature. On note par ailleurs une forte variabilité inter-annuelle des vitesses, qui semblent dépendre de la variation de la température moyenne annuelle de surface. Abstract: In the context of a warmer climate, the localisation of permafrost in steep sedimentary terrain and the measurement of terrain movements that occur in these areas is of great importance. With respect to these problems, this PhD thesis follows two different research axes. From a static point of view, the research presents a study of the permafrost distribution and characteristics in the talus slopes of the alpine periglacial belt. From a dynamic point of view, an analysis of the influence of the permafrost characteristics (ice content, permafrost temperature, etc.) and air and soil temperature variations on the creep velocities of frozen sedimentary bodies is carried out. In order to attain this double objective, the "field" approach was favoured. To determine the distribution and the characteristics of permafrost, the traditional methods of permafrost prospecting were used, i.e. ground surface temperature measurements at the base of the snow cover (BTS), year-round ground temperature measurements and DC-resistivity prospecting. The terrain movements were measured using a differential GPS. The permafrost distribution study was carried out on 15 talus slopes located mainly in the Mont Gelé (Verbier-Nendaz) and Arolla areas (Swiss Alps). In most cases, permafrost was found in the lower part of the talus slope, whereas the medium part was free of ice. In some cases, the upper part of the talus is also free of permafrost, whereas in other cases permafrost is present. Electrical resistivities measured in the frozen parts of the studied talus are in most cases clearly lower than those measured on rock glaciers. Former studies have shown that internal air circulation is responsible for the negative thermal anomaly and, when it exists, the permafrost present in the lower part of talus slopes located more than 1000 m below the regional lower limit of discontinuous permafrost. The study of four low-altitude talus slopes (1400-1900 m), and notably the equipment of Dreveneuse field site (Valais Prealps) with two boreholes, surface temperature sensors and an anemometer permitted to verify and to detail the ventilation mechanism active in low altitude talus slopes. This mechanism works in the following way: in winter, the air contained in the block accumulation is warmer and lighter than the surrounding air and therefore moves upward in the talus and is expelled in its upper part. This chimney effect induces an aspiration of cold air in the interior of the lower part of talus, that causes a strong overcooling of the ground. In summer, the mechanism is reversed because the talus slope is colder than the surrounding air. Cold air is then expelled in the lower part of the slope. Evidence of ascending ventilation in wintertime could also be found in some of the studied high-altitude talus slopes. It is probably mainly responsible for the particular configuration of the observed frozen areas. Even if the existence of a chimney effect could not be demonstrated in all cases, notably because of interstitial ice that obstructs Résumé ? abstract - III - the air circulation, indices of its presence exist in nearly all the studied talus. The absence of permafrost at altitudes favourable to its presence could be explained, for example, by the terrain warming caused by expulsion of relatively warm air. Terrain movements were measured at about ten sites, mainly on rock glaciers, but also on a push moraine and some talus slopes. Field observations reveal that many rock glaciers display recent destabilization features (landslide scars, tilted blocks, presence of fine grained sediments at the surface, etc.) that indicate a probable recent acceleration of the creep velocities. This phenomenon, which seems to be widespread at the alpine scale, is probably linked to the permafrost warming during the last decades. The measured velocities are often higher than values usually proposed in the literature. In addition, strong inter-annual variations of the velocities were observed, which seems to depend on the mean annual ground temperature variations.

Dysregulated activation of the CXCR4/CXCL12 Axisand its role in the malignant phenotype of neural crest-derived neuroblastoma tumours

Résumé: Le neuroblastome (NB) est un néoplasme dévastateur de la petite enfance, pour lequel il n'existe pas encore de traitement efficace. Les chimiokines et leurs récepteurs ont été impliqués dans la croissance des tumeurs et la formation de métastases, et en particulier, il a été rapporté que l'axe CXCR4/CXCL12 dirigeait le guidage, ainsi que l'invasion des cellules cancéreuses vers des organes spécifiques. Notre étude avait pour objectif d'analyser le rôle de CxCR4 exogène dans le comportement malin du NB, en étudiant la croissance des cellules tumorales, leur capacité de survie, de migration et d'invasion in vitro et en validant ces résultats grâce à un modèle orthotopique murin de la progression tumorale du NB in vivo. La surexpression de CXCR4 dans les cellules faiblement métastatiques IGR-NB8 n'exprimant pas CXCR4, a augmenté la mobilité des cellules vers CXCL12 in vitro. De plus, les cellules surexprimant CXCR4 ont été moins affectées par la privation de sérum que les cellules contrôles. Le volume des tumeurs chez les animaux greffés de manière orthotopique avec les cellules NB8-CXCR4-C3 était significativement plus élevé que celui des tumeurs issues des cellules contrôles NB8-E6 au moment du sacrifice des animaux. Cependant, aucune induction des métastases n'a été observée. La lignée cellulaire IGR-N91, aux propriétés invasives et métastatiques in vivo, exprime constitutivement des quantités modérées de CXCR4. La surexpression du récepteur dans cette lignée a accéléré la croissance tumorale in vivo, mais n'a pas augmenté pas l'occurrence des métastases. Les cellules IGR-N91, dans lesquelles l'expression de CXCR4 a été éteinte, suite à l'introduction de shRNA stable contre CXCR4, a présenté une croissance cellulaire plus lente, in vitro et in vivo. Afin d'identifier les gènes et les voies de signalisation impliqués dans les effets dépendants de CXCR4-CXCL12 dans le NB, des analyses du profil d'expression des gènes ont été effectuées sur les lignées cellulaires transfectées ou non (contrôle). Trois clones contrôles ont été comparés à 3 clones surexprimant CXCR4 pour chacune des lignées (IGR-NB8 et IGR-N91). Les analyses biostatiques ont identifié 10 gènes induits, dont CXCR4, et 31 gènes réprimés, communs entre tous les clones surexprimant CXCR4. Ces observations démontrent que la surexpression de CXCR4 dans le NB stimule la croissance, la survie et la migration chémotactique des cellules tumorales, mais est insuffisante pour induire ou augmenter leurs capacités invasives et métastatiques. Les voies de signalisation activées suite à la surexpression de CXCR4 et identifiées à travers le profil global de l'expression des gènes pourraient être des cibles intéressantes pour le développement de drogues capables d'inhiber la croissance tumorale. Abstact: Neuroblastoma (NB) is a devastating childhood neoplasm for which there is not yet an efficient treatment. Chemokines and their receptors have been involved in tumour growth and metastasis, and in particular the CXCR4/CXCL12 axis has been reported to mediate organ-specific cancer cells homing and invasion. The purpose of the study was to investigate the role of ectopic CXCR4 in the malignant behaviour of NB by studying tumour cell growth, survival, migration, and invasion in vitro and by validating these results using a murine orthotopic model of NB tumour progression in vivo. CXCR4 overexpression in the low metastatic, CXCR4-negative IGR-NB8 cells resulted in CXCL12-mediated chemotaxis in vitro. Furthermore, CXCR4 overexpressing cells were less affected by serum deprivation than mock-transduced cells. In vivo studies revealed that, at sacrifice, volumes of tumours developing in mice with orthotopically implanted NB8-CXCR4-C3 cells, were significantly increased compared to NB8-E6 control tumours. However, no induction of metastases was observed. The in vivo invasive and metastatic cell line IGR-N91 cell line constitutively expresses moderate levels of CXCR4. Overexpression of CXCR4 enhanced in vivo tumour growth but did not increase the occurrence of metastases. IGR-N91 cells where CXCR4 has been knocked-down by stable shRNA grew slower in vitro and in vivo. To identify genes and pathways involved in the CXCR4/CXCL12-mediated effects in NB expression, profiles analyses (Affymetrix) were performed on transduced and control cell lines. Three mock-transduced clones were compared to three CXCR4 overexpressing clones of either cell line IGR-NB8 and IGR-N91. Biostatistical analysis identified 10 commonly upregulated genes (including CXCR4) and 31 downregulated genes common to all CXCR4 overexpressing clones. These observations demonstrate that overexpression of CXCR4 in NB stimulates tumour cell growth, survival, and chemotactic migration but is not sufficient to induce or enhance invasive and metastatic capacities. Activated pathways upon CXCR4 overexpression, identified through global gene expression profiling may be interesting targets for drugs inhibiting tumour growth.

Le réalisme des relations : étude des réponses apportées au problème de la différence entre la relation et son fondement (1250-1350)

La question de savoir si la relation est différente réellement de son fondement se rencontre fréquemment dans les textes médiévaux à partir du milieu du treizième siècle. Elle se pose avant tout dans un cadre aristotélicien de discussion des catégories et revient à se demander si la catégorie de relation ajoute véritablement une chose supplémentaire, la relation, dans la réalité. Cette question s'inscrit dans une représentation réaliste des relations : pour la plupart des auteurs du treizième et du quatorzième siècle, le fait que des choses soient réellement reliées entre elles ne fait pas de doute. Deux hommes de même taille sont bel et bien égaux, c'est-à-dire réellement reliés entre eux par une relation d'égalité. La difficulté est alors de comprendre comment ces choses sont reliées entre elles, ou encore, ce qu'est exactement cette relation dont il est alors question. Faut-il dire que l'égalité dans chacun des hommes de même taille est une nouvelle chose qui s'ajoute à la substance de chacun d'eux et aux accidents de taille, appartenant à la catégorie de quantité, sur lesquels ces relations d'égalité sont fondées ? Ou faut-il dire que l'égalité est réelle d'une autre manière, c'est-à-dire sans pour autant ajouter une nouvelle chose à ce à quoi elle advient ? Ce problème, qui se rencontre déjà dans les tensions existant entre les différents exposés qu'Aristote a consacrés à cette catégorie, a reçu de multiples réponses. Celles-ci nous éclairent sur la manière dont le réel est appréhendé au Moyen-Âge et sur les débats ontologiques de l'époque. Le travail ici résumé entreprend de délimiter précisément ces réponses et propose une manière de les classer. -- Realism about relations: study of the answers given to the problem of the difference between a relation and its foundation (1250-1350) Summary Whether relation is really distinct from its foundation or not is a question that can easily be found in medieval texts from the mid-thirteenth century onwards. It comes from an aristotelian background, the discussion about the categories, and asks if the category of relation really posits another thing, i.e. a relation, in reality. It results from a realist perspective on relations. In fact, most thirteenth and fourteenth century thinkers held without doubt that things outside the mind are really connected between them. Two men sharing the same height are really equal, that is, really linked to each other by a relation of equality. What is then left to understand is how these things are linked between them, or the exact nature of the aforementioned relation. Should we say that the equality in each of the equally sized men is a new thing that adds to the substance of each of them and to the accidents of height, belonging tho the category of quantity, on which these relations are founded? Or should we say that equality is real in another way, that is, without adding a new thing to the subject acquiring it? We can already find this issue in Aristotle himself, emerging from disagreeing texts devoted to this category. It received various answers that enable us to understand better how reality was defined in the Middle Age and some of the ontological debates of the time. The work that is here summed up attempts to precisely delineate these various answers and to provide a way of classifying them.

The role of the microRNAs in the age-associated oancreatic β-cell dysfunction

Le corps humain emploie le glucose comme source principale d'énergie. L'insuline, sécrétée par les cellules ß-pancreatiques situées dans les îlots de Langerhans, est l'hormone principale assurant un maintien constant du taux de glucose sanguin (glycémie). Les prédispositions génétiques, le manque d'activité physique et un régime déséquilibré peuvent entraîner une perte de sensibilité à l'insuline et des taux de glucose dans le sang élevé (hyperglycémie), une condition nommée diabète de type 2. Cette maladie est initiée par une sensibilité diminuée à l'insuline dans les tissus périphériques, entraînant une demande accrue en insuline. Cette pression continue finie par épuiser les cellules ß-pancreatiques, qui sécrètent alors des niveaux d'insuline insuffisant en trainant l'apparition du diabète. Le vieillissement est un facteur de risque important pour les maladies métaboliques dont le diabète de type 2 faits partis. En effet la majeure partie des diabétiques de type 2 ont plus de 45 ans. Il est connu que le vieillissement entraine une perte de sensibilité à l'insuline, une sécrétion altérée d'insuline, une baisse de réplication et une plus grande mort des ß-cellules pancréatiques. Le but de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes contribuante au dysfonctionnement des cellules ß- pancréatiques lors du vieillissement. Les travaux du « Human Genome Project » ont révélés que seulement 2% de notre génome code pour des protéines. Le reste non-codant fut alors désigné sous le nom de « ADN déchets ». Cependant, l'étude approfondie de cet ADN non-codant ces dernières deux décennies a démontré qu'une grande partie code pour des «MicroARNs », des ARNs courts (20-22 nucleotides) découverts en 1997 chez le vers C.elegans. Depuis lors ces molécules ont été intensivement étudiées, révélant un rôle crucial de ces molécules dans la fonction et la survie des cellules en conditions normales et pathologiques. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Nos données suggèrent qu'ils peuvent jouer un rôle tantôt salutaire, tantôt nocif sur les cellules ß. Par exemple, certains microARNs réduisent la capacité des cellules ß à se multiplier ou réduisent leur survie, alors que d'autres protègent ces cellules contre la mort. Pour conclure, nous avons démontré les microARNs jouent un rôle important dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Ces nouvelles découvertes préparent le terrain pour la conception de futures stratégies visant à améliorer la résistance des cellules ß pancréatiques afin de trouver de nouveaux traitements du diabète de type 2. -- Le diabète de type 2 est une maladie métabolique due à la résistance à l'action de l'insuline des tissus cibles combinée à l'incapacité des cellules ß pancréatiques à sécréter les niveaux adéquats d'insuline. Le vieillissement est associé à un déclin global des fonctions de l'organisme incluant une diminution de la fonction et du renouvellement des cellules ß pancréatiques. Il constitue ainsi un risque majeur de développement des maladies métaboliques dont le diabète de type 2. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs (une classe d'ARN non- codants) dans le dysfonctionnement lié au vieillissement des cellules ß. L'analyse par microarray des niveaux d'expression des microARN dans les îlots pancréatiques de rats Wistar mâles âgés de 3 et 12 mois nous a permis d'identifier de nombreux changements d'expression de microARNs associés au vieillissement. Afin d'étudier les liens entre ces modifications et le déclin des cellules ß, les changements observés lors du vieillissement ont été reproduits spécifiquement dans une lignée cellulaire, dans des cellules ß primaires de jeune rats ou de donneurs humains sains. La diminution du miR-181a réduit la prolifération des cellules ß, tandis que la diminution du miR-130b ou l'augmentation du miR-383 protège contre l'apoptose induite par les cytokines. L'augmentation du miR-34a induit l'apoptose et inhibe la prolifération des cellules ß en réponse aux hormones Exendin-4 et prolactine et au facteur de croissance PDGF-AA. Cette perte de capacité réplicative est similaire à celle observée dans des cellules ß de rats âgés de 12 mois. Dans la littérature, la perte du récepteur au PDGF-r-a est associée à la diminution de la capacité proliférative des cellules ß observée lors du vieillissement. Nous avons pu démontrer que PDGF-r-a est une cible directe de miR- 34a, suggérant que l'effet néfaste de miR-34a sur la prolifération des cellules ß est, du moins en partie, lié à l'inhibition de l'expression de PDGF-r-a. L'expression de ce miR est aussi plus élevée dans le foie et le cerveau des animaux de 1 an et augmente avec l'âge dans les ilôts de donneurs non-diabétiques. Ces résultats suggèrent que miR-34a pourrait être non seulement impliqué dans l'affaiblissement des fonctions pancréatiques associé à l'âge, mais également jouer un rôle dans les tissus cibles de l'insuline et ainsi contribuer au vieillissement de l'organisme en général. Pour conclure, les travaux obtenus durant cette thèse suggèrent que des microARNs sont impliqués dans le dysfonctionnement des cellules ß pancréatiques durant le vieillissement. -- Type 2 diabetes is a metabolic disease characterized by impaired glucose tolerance, of the insulin sensitive tissues and insufficient insulin secretion from the pancreatic ß-cells to sustain the organism demand. Aging is a risk factor for the majority of the metabolic diseases including type 2 diabetes. With aging is observed a decline in all body function, due to decrease both in cell efficiency and renewal. The aim of this thesis was to investigate the potential role of microRNAs (short non- coding RNAs) in the pancreatic ß-cell dysfunction associated with aging. Microarray analysis of microRNA expression profile in pancreatic islets from 3 and 12 month old Wistar male rats revealed important changes in several microRNAs. To further study the link between those alterations and the decline of ß-cells, the changes observed in old rats were mimicked in immortalized ß-cell lines, primary young rat and human islets. Downregulation of miR-181a inhibited pancreatic ß-cell proliferation in response to proliferative drugs, whereas downregulation of miR-130b and upregulation of miR-383 protected pancreatic ß-cells from cytokine stimulated apoptosis. Interestingly, miR-34a augmented pancreatic ß-cell apoptosis and inhibited ß-cell proliferation in response to the proliferative chemicals Exendin-4, prolactin and PDGF-AA. This loss of replicative capacity is reminiscent of what we observed in pancreatic ß-cells isolated from 12 month old rats. We further observed a correlation between the inhibitory effect of miR-34a on pancreatic ß-cell proliferation and its direct interfering effect of this microRNA on PDGF-r-a, which was previously reported to be involved in the age-associated decline of pancreatic ß-cell proliferation. Interestingly miR-34a was upregulated in the liver and brain of 1 year old animals and positively correlated with age in pancreatic islets of normoglycemic human donors. These results suggest that miR-34a might be not only involved in the age-associated impairment of the pancreatic ß-cell functions, but also play a role in insulin target tissues and contribute to the aging phenotype on the organism level. To conclude, we have demonstrated that microRNAs are indeed involved in the age-associated pancreatic ß-cell dysfunction and they can play both beneficial and harmful roles in the context of pancreatic ß-cell aging.

Identification of novel factors during the establishment of the Casparian strip in the endodermis

Multicellular organisms rely on specialized tissues that allow for the controlled exchange of matter with their surrounding. In order to function properly, these tissues need to establish a tight connection between the individual cells to prevent uncontrolled passive diffusion across the extracellular space. In animals, these connections are called tight and adherens junctions and are a critical feature of epithelia. These connections, however, rely on direct protein-protein interaction of plasma membrane proteins of adjacent cells. Such a mechanism is not possible in plants due to the cell wall, which encases the individual cells. In order to absorb nutrients, while simultaneously preventing uncontrolled diffusion between cells, land plants have evolved the root endodermis, which is functionally equivalent to animal epithelia. Its cells are surrounded by a precisely localized and aligned, ring-like lignin deposition, called the Casparian strip, and therefore tightly connected between each other. Very little was known about the development of the endodermis and the Casparian strip until recently. In the meantime, however, we have identified a family of endodermis- specific proteins, the CASPs, which recruits extracellular proteins the specific Casparian strip membrane domain (CSD) to locally synthesize lignin in the cell wall. Yet, we hardly knew any specifics on how the CSD is initially defined and how the critically important CASPs are being recruited to it. We therefore conducted a forward genetic screen on the localization of CASPI-GFP in order to identify novel mutants, which lack a defined CSD. We identified 48 mutants, which fell into 15 different complementation groups. While some of the isolated genes had previously been identified through different approaches, nine novel genes, which had never been implicated in CSD development and maintenance, were identified. One of them, LORD OF THE RINGS 2 (.LOTR2) is described to greater detail in this work. LOTR2 encodes for EX070A1, a protein of the evolutionary conserved exocyst complex. This complex has frequently been implicated in various secretory processes across kingdoms. In Arabidopsis, it transiently defines the positioning of CASPI-GFP. We have performed a detailed analysis of the dynamics of EX070A1 and CASPI-GFP, including studies with other markers and propose a mechanism, by which the cytosolic EX070A1 transiently defines a plasma membrane domain to recruit transmembrane proteins, which then recruit extracellular enzymes for localized cell wall modification. Considering the ubiquitous expression of EX070A1, we think that this mechanism is potentially of importance not only for the endodermis and the Casparian strip but also for many other tissues, in which the cell wall becomes locally modified. In fact, many other tissues with secondary cell wall modifications contain proteins very similar to the CASPs. It will be interesting to see to which degree this mechanism is employed in other tissues. As for the endodermis, we have now identified the first gene, which is not specific to the endodermis but shows endodermis-specific dynamics. This might give us a better insight on how the plant modulates this ubiquitously present factor in a cell- or tissue-type specific manner. Considering the knowledge, mutants and tools, which are available to us for investigating the endodermis, the Casparian strip, the exocyst complex and EX070A1 might be just the right experimental system to address these questions. -- Les organismes multicellulaires dépendent des tissues spécialisé pour l'échange contrôlé entre eux et leur environnement. Pour leur bon fonctionnement, les cellules de ces tissus ont besoin d'être très étroitement assemblés afin de prévenir la diffusion non-contrôlée à travers l'espace extracellulaire. Chez les animaux, ces connexions sont appelées jonctions serrées et jonctions adhérentes. Ces jonctions dépendent des interactions directes entre les protéines des cellules voisines. Ceci n'est pas possible chez les plantes à cause de la paroi cellulaire qui recouvre chaque cellule individuellement. Pour absorber les nutriments et en même temps empêcher la diffusion non-contrôlé entre cellules, les plantes ont évolué 1'endoderme dans la racine, qui est fonctionnellement équivalent aux épithéliums des animaux. Les cellules de l'endoderme sont ceinturées par une déposition de lignine très précisément localisées comme un anneau et alignées entre les cellules, et qui, donc, connecte étroitement les cellules avoisinante: Le cadre de Caspary. Peu était connu sur le développement de l'endoderme et le cadre de Caspaiy jusqu'à il y a quelques années. Récemment, pourtant, nous avons identifié une famille de protéines spécifiques à l'endoderme, les CASPs, qui définissent le domaine membranaire du cadre de Caspaiy (CSD). Les CASPs recrutent les protéines extracellulaires nécessaire à la synthèse du cadre de Caspary vers une région limité dans la paroi cellulaire. Pourtant, on connaît très peu les processus spécifiques concernant la définition initiale du CSD et comment les CASPs, qui ont une importance cruciale, sont recrutées vers ce domaine. Par conséquent nous avons mené un crible génétique sur la localisation du CASPI- GFP, qui sert comme marqueur pour le CSD. Notre but étant d'isoler de nouveaux mutants affectés dans l'établissement du CSD. Nous avons identifié 48 mutants, en 15 groupes de complémentation. Bien que certains des gènes isolés étaient déjà impliqué dans la formation du cadre de Caspary, neuf nouveaux gènes n'ayant jamais été impliqués dans le développement ou la maintenance du CSD ont pu être identifiés. Un de ces gènes, LORD OF THE RINGS2 (LOTR2) sera décrit plus en détail dans cette étude. LOTR2 code pour EX070A1, qui est une protéine, du complexe exocyste. Ce complexe de protéines a très bien été conservé au cours de l'évolution. Il était souvent impliqué dans plusieurs processus de sécrétion dans toutes les branches de la vie. Chez Arabidopsis, EX070A1 définit la position du CSD d'une façon transitoire et recrute CASP1- GFP. Nous avons mené une analyse détaillée des dynamiques d'EX070Al et CASPI-GFP ainsi que, des études avec des autres mutants. Nous proposons un mécanisme, d'après lequel EX070A1, recruté du cytosol, définit un domaine dans la membrane plasmique pour localiser des protéines transmembranaires, ces dernières ensuite recruteront des enzymes extracellulaires pour la modification locale de la paroi cellulaire. Vu qu'EX070A1 est exprimé dans toute dans la plante, nous pensons que ce mécanisme est potentiellement important non seulement pour l'endoderme et le cadre de Caspary, mais aussi pour les autres tissus où la paroi cellulaire doit être localement modifiée. En effet, plusieurs autres tissus contiennent des protéines très similaires aux CASPs. Il serait intéressant de voir à quelle dégrée ce mécanisme est également utilisé dans ces tissues. En ce qui concerne l'endoderme, nous avons maintenant identifié le premier gène qui n'est pas exprimé spécifiquement dans l'endoderme, mais qui montre tout de même une dynamique caractéristique dans ce tissu. Il serait intéressant de voir comment la plante peut moduler ce facteur omniprésent d'une façon spécifique. Vu les connaissances, les mutants et les outils qu'on a maintenant à notre disposition, l'endoderme et son cadre de Caspary, le complexe exocyste et EX070A1 sont probablement des bons systèmes expérimentaux pour étudier ces questions. -- Identification des nouveaux facteurs pendant l'établissement du cadre de Caspary dans l'endoderme. Lothar Kalmbach, Département de Biologie Moléculaire Végétale (DBMV), Université de Lausanne. Comme tous les autres organismes multicellulaires, les plantes terrestres dépendent de tissus spécialisés pour l'échange contrôlé avec leur environnement. Ces tissus sont importants pour l'absorption des nutriments mais également pour éviter l'influx de composés toxiques. Chez les plantes, ce tissu se trouve dans la racine. C'est l'endoderme. Grâce au cadre de Caspary, qui permet une forte connexion entre les cellules au niveau de leur paroi, l'endoderme empêche les éléments toxiques d'entrer dans le système vasculaire. Depuis quelques années, nous comprenons de plus en plus la nature et la biosynthèse, ainsi que les protéines impliquées dans l'ancrage des enzymes à la membrane plasmique. Nous n'avons eu, par contre, aucune idée sur le mécanisme qui d'abord définit cet endroit dans la membrane plasmique. Nous avons mené un crible génétique sur la localisation de CASPI-GFP, une protéine, qui recrute les enzymes extracellulaires pour la synthèse du cadre de Caspary. Nous avons identifié plusieurs nouveaux gènes qui sont impliqués dans l'intégrité du cadre de Caspary. L'un de ces gènes est EX070A1, qui est un facteur ayant un rôle important lors de la sécrétion des protéines dans tous les organismes eukaryotes. Ces mutants sont gravement affectés au niveau du cadre de Caspary, mais surtout ils ne sont plus capables de localiser CASPI-GFP. Nous avons suivi la dynamique d'EX070Al et de CASP1-GFP en combinaison avec d'autres marqueurs. Nous avons pu montrer que l'accumulation d'EX070Al est spécifique pour l'endoderme et essentielle pour bien localiser CASPI-GFP et donc, le cadre de Caspary. Ces résultats nous aident à mieux comprendre le développement de l'endoderme mais peuvent potentiellement aussi être utilisés pour étudier les modifications de la paroi cellulaire dans d'autres cellules de la plante.

Etude de l'évolution des patients porteurs d'une cardiomyopathie hypertrophique obstructive (CMHO) après alcoolisation septale

La cardiomyopathie hypertrophique (CMH) est la maladie cardiaque monogénique la plus fréquente, touchant environ 1 individu sur 500 dans la population (1,2). L'étiologie est familiale dans la majorité des cas avec une transmission de type autosomal dominant à pénétrance variable. Deux gènes principaux sont à l'origine de la maladie chez 70% des patients avec un test génétique positif. Il s'agit des gènes qui codent pour la chaine lourde β de la myosine (MYH7) et la protéine C liant la myosine (MYBPC3) (1-3). La CMH est définie par la présence d'une hypertrophie myocardique « inadéquate » car se développant en l'absence d'une cause d'augmentation de la post-charge (HTA, sténose aortique, membrane sous-aortique), d'une pathologie infiltrative ou d'un entrainement physique (4,5). Le plus souvent asymétrique et affectant préférentiellement le septum, cette hypertrophie s'accompagne dans près de deux tiers des cas d'une obstruction dynamique sous-aortique de la chambre de chasse du ventricule gauche par la valve mitrale (systolic anterior motion ou SAM). Cette obstruction est à la fois la conséquence du rétrécissement de la chambre de chasse par l'hypertrophie septale mais également d'un malpositionnement de la valve mitrale (6-8). On parle alors de Cardiomyopathie Hypertrophique et Obstructive (CMHO). L'obstruction - présente au repos dans 50% des cas et uniquement après manoeuvres de provocation dans l'autre moitié des cas (manoeuvre de Valsalva, test de vasodilatation par nitrite d'amyle) est à l'origine d'un gradient de pression entre le ventricule gauche et l'aorte, et donc d'une surcharge de pression pour le ventricule gauche. Cette surcharge de pression est à l'origine des symptômes classiquement rencontrés soit dyspnée et angor d'effort, présyncope voire syncopes à l'effort. Un gradient sous-aortique de plus de 50 mmHg (mesuré au repos ou après provocation) est considéré comme un gradient à valeur pronostique (6-8) et justifiant un traitement si associé à des symptômes. Le traitement médical des formes obstructives repose sur l'administration de substances inotropes négatives et/ou susceptibles de favoriser la relaxation myocardique tels que les béta-bloqueurs, les antagonistes du calcium et le disopyramide - pris isolément ou en association. Pour les nombreux patients qui deviennent réfractaires ou intolérants à ces traitements, deux interventions peuvent leur être proposées pour lever l'obstruction : une myotomie-myectomie chirurgicale du septum (9,10) ou une alcoolisation du septum par voie percutanée (7,8). Les indications à ces interventions sont les suivantes (7,8,11) : 1. Symptômes (dyspnée de classe fonctionnelle NYHA III ou IV, angor de classe fonctionnelle CCS III ou IV, syncope, ou présyncope) réfractaires au traitement médical ou intolérance du patient au traitement. Une dyspnée de classe II est considérée suffisante dans le cas de jeunes patients. 2. Obstruction sous-aortique avec gradient supérieur ou égal à 50 mmHg, au repos ou après manoeuvre de provocation, associée à une hypertrophie septale et à un mouvement systolique antérieur de la valve mitrale (effet SAM) 3. Anatomiecardiaquefavorableàuntraitementinvasif(épaisseurduseptumde plus de 16 mm) Si la myectomie chirurgicale reste la méthode de référence (12-18), l'alcoolisation septale du myocarde par voie percutanée est devenue un des traitements de choix dans la thérapie de la Cardiomyopathie Hypertrophique Obstructive réfractaire. Elle consiste à repérer par coronarographie l'artère septale nourrissant le septum basal hypertrophié, puis à y introduire un petit ballon pour isoler ce territoire du reste du lit coronaire avant d'y injecter une dose d'alcool à 95% comprise entre 1 et 5 cc. On crée ainsi un infarctus chimique, technique qui fut dans le passé utilisée pour le traitement de certaines tumeurs. Les effets ne sont pas immédiats et nécessitent généralement 2-3 semaines avant de se manifester. On assiste alors à une diminution progressive de l'épaisseur du myocarde nécrosé (7), à la disparition progressive de l'obstruction et à l'amélioration / disparition des symptômes. La question de savoir qui de la chirurgie ou de l'alcoolisation est le plus efficace a été source de nombreux débats (7,11-13,18). Par rapport à la chirurgie, les avantages de la méthode percutanée sont les suivants (11,14,15,18,19) : - Efficacités hémodynamique et fonctionnelle jugées comparable à la chirurgie selon les études - Taux de morbidité et de mortalité très faible et non supérieure à la chirurgie - Absence de sternotomie - Diminution de la durée de l'hospitalisation et surtout de la période de convalescence, le patient pouvant reprendre une activité dès son retour à domicile Certains experts émettent néanmoins des doutes quant à l'innocuité à long terme de la méthode, les zones nécrotiques pouvant servir de terrain arythmogène. Pour ces raisons, la méthode n'est pas recommandée chez les patients de moins de 40 ans (6,8). Le risque majeur de l'alcoolisation du septum proximal réside dans l'induction d'un bloc atrio-ventriculaire complet chimique, le noeud atrio-ventriculaire étant justement situé dans cette région. Ce risque augmente avec la quantité d'alcool administrée et nécessite, si persistance après trois jours, l'implantation d'un pacemaker à demeure. Selon les centres, le taux d'implantation d'un stimulateur varie ainsi entre 7% et 20% (7,14,20). L'efficacité clinique et l'incidence des complications est donc en partie liée à la compétence technique et à l'expérience de l'opérateur (7,14), mais aussi aux choix des patients. Il peut donc varier grandement selon les centres médicaux. L'étude proposée vise à analyser les résultats de l'alcoolisation obtenus à Lausanne, jusqu'à présent pas encore été étudiés, et à les comparer à ceux de la littérature.

UTILITE ET EFFICACITE DU CATHETERISME SELECTIF DES VEINES SURRENALIENNES LORS D'UN HYPERALDOSTERONISME PRIMAIRE, REVUE DES 5 DERNIERES ANNEES AU CHUV

Contexte   L'hyperaldostéronisme primaire (HAP) est actuellement considéré comme la première cause d'hypertension artérielle secondaire. Son diagnostic est capital car il permet d'identifier des patients avec une cause potentiellement réversible d'hypertension. Cependant, le diagnostic et l'attitude thérapeutique (traitement médical vs. chirurgical) ne sont pas toujours évidents. Le cathétérisme sélectif des veines surrénaliennes (CVS) permet la détermination d'une latéralisation de la sécrétion d'aldostérone avec moins de risques de faux négatifs et de faux positifs que l'imagerie par scanner ou par IRM. Contrairement à d'autres pays européens, asiatiques ou américains, il n'existe pour le moment aucune donnée publiée sur le cathétérisme des veines surrénaliennes en Suisse.  Objectifs Déterminer le taux de succès du CVS ainsi que ses déterminants cliniques au cours des 5 dernières années au CHUV, ainsi que démontrer l'utilité d'un cathétérisme des veines surrénaliennes lorsqu'une surrénalectomie est envisagée dans le cadre d'un hyperaldostéronisme primaire  Méthodes Cette étude est rétrospective et monocentrique. La récolte de données s'est faite à partir de dossiers de 68 patients atteints d'hypertension artérielle (HTA) secondaire sur HAP biochimiquement confirmé et ayant eu un CVS au cours des 5 dernières années.  Résultats Au CHUV, le taux de succès du CVS (cathétérisme bilatéral des veines surrénaliennes) s'élève à 60% (41/68). Dans 53% des cas, il y a discordance entre les résultats de l'imagerie standard et ceux du CVS. Une attitude thérapeutique basée sur l'imagerie standard aurait entrainé des traitements inappropriés : 43% des patients auraient subi une chirurgie inadéquate, et 10% n'auraient pas été candidats à une sanction chirurgicale alors qu'elle aurait été indiquée sur la base du CVS.  Conclusions Le CVS doit être considéré comme l'étalon-or dans la prise en charge diagnostique de l'HAP lorsqu'une intervention chirurgicale est possible. En se basant uniquement sur l'imagerie, il en résulterait un taux élevé de traitement inapproprié. Aux vues des difficultés techniques associées à cet examen, de nouvelles procédures doivent être mises en place pour mener à une amélioration de son taux de succès et à l'interprétation des résultats.

Analyse rétrospective de la prise en charge du cancer ovarien au Centre Hospitalier Universitaire Vaudois

Introduction:¦L'incidence annuelle du cancer de l'ovaire en Suisse est de 600 cas, il touche principalement les femmes âgées de plus de 60 ans. Le cancer de l'ovaire est aujourd'hui la 1ère cause de mortalité par cancer gynécologique chez la femme. Le but de notre recherche, est de créer une base de données de toutes les¦patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire et hospitalisées au CHUV pour la prise en charge de leur maladie.¦Cette étude rétrospective monocentrique nous permettra en premier lieu d'analyser les caractéristiques de¦cette tumeur présentées par les patientes, les traitements instaurés pour traiter ce cancer et les taux de¦récidives et de survie des patientes en fonction de ces variables.¦Méthodologie:¦Analyse rétrospective de 147 patientes diagnostiquées d'un cancer de l'ovaire et hospitalisées au CHUV entre¦septembre 2001 et mars 2010 pour la prise en charge de leur tumeur ovarienne. Utilisation du programme informatique ARCHIMED qui contient les dossiers médicaux de toutes les patientes inclues dans l'étude et création de 2 bases des données. La 1ère base de données regroupe l'ensemble des patientes de l'étude y¦compris les tumeurs type borderline, la 2ème base de données concerne uniquement les patientes ayant récidivé de leur tumeur. Les tumeurs bénignes ont été exclues de l'étude.¦Résultats:¦La probabilitéde survie à 1 an chez les patientes avec un cancer de l'ovaire, tous stades FIGO et prises en¦charge confondus, hospitalisées au CHUV est de 88,04% (95% CI = 0.7981-­‐0.9306), à 3 ans la probabilité de survie est de 70,4% (95% CI = 0.5864-­‐0.7936), et à plus de 5 ans, elle est de 60% (95% CI = 0.4315-­‐0.6859).¦Nous avons comparé le taux de survie en fonction du stade FIGO de la tumeur ovarienne et nous avons observé une différence significative de survie entre les stades FIGO précoces et les stades avancés (Pvaleur=¦0.0161).¦En plus d'une intervention chirurgicale, les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire sont normalement traitées par une chimiothérapie. Dans notre étude, 70 patientes ont bénéficié d'une chimiothérapie; un¦traitement adjuvant a été donné dans 78 % des cas (N = 55), un traitement néoadjuvant a été administré chez 22% des patientes (N=15). Le type combiné carboplatine-­‐taxane est la chimiothérapie la plus fréquente (75%). Au total sur l'étude, 66 patientes sur les 147 (44%) ont récidivé de leur tumeur. En ce qui¦concerne leur prise en charge, 46% des patientes ont reçu une chimiothérapie unique comme du gemzar, cealyx ou taxotère après leur récidive. Une cytoréduction secondaire a également été effectuée chez 33% de ces patientes ayant une récidive. Nous avons également étudié l'intervalle de temps entre la date de la¦récidive et celle du décès. Parmi les 28 patientes décédées chez les récidives, 10 d'entre-­‐elles (36%) ont survécu moins d'un an une fois la récidive diagnostiquée, 8 (28%) patientes ont survécu jusqu'à 2 ans, et¦les 10 (36%) autres patientes ont survécu de 2 à 5 ans. En ce qui concerne le taux de mortalité; 39 patientes sur les 147 étudiées sont décédées pendant la période d'observation, soit 26% des cas. La tumeur¦type borderline, présente une prolifération épithéliale atypique sans invasion dans le stroma et représente¦10 à 20% de toutes les tumeurs ovariennes. Dans notre étude, 41 patientes sont porteuses de cette tumeur¦(28%) et la moyenne d'âge est de 49 ans. En ce qui concerne leur prise en charge, l'intervention chirurgicale¦la plus fréquente, soit 23% des cas, est l'annexectomie unilatérale, qui reste une attitude conservative pour¦ces patientes désirant préserver leur fertilité. 6 patientes présentant ce type de tumeur ont récidivé, soit 14% des cas, avec une progression pelvienne, et 3 de ces 6 patientes sont décédées. Dans notre analyse, on observe que la probabilité de vivre plus longtemps que 1an pour les patientes ayant une tumeur borderline est de 93,8% (95% CI= 0.6323-­‐ 0.9910), à 3 ans elle est également de 93,8% (95% CI = 0.6323-­‐0.9910) et à 5 ans elle est de 78,1% (95% CI = 0.3171-­‐0.9483). Nous n'avons pas observé de¦différence de survie dans notre étude entre les patientes présentant une tumeur borderline et le « non‐borderline ». (Pvaleur=0.3301)

AFT3 as a new therapeutic target for skin field cancerization in antagonism with compromised Notch/CSL signaling

Les interactions épithélio-mésenchymateuses jouent un rôle important dans le contrôle du développement normal de la peau, son homéostasie et sa tumorigenèse. Les fibroblastes dermiques (DFs) représentent la catégorie cellulaire la plus abondante dans le stroma et leur rôle est de plus en plus considéré. En ce qui concerne particulièrement la tumorigenèse, des facteurs diffusibles produits par les fibroblastes entourant les tumeurs épithéliales, appelés 'fibroblastes associés au cancer (CAF)', interagissent au niveau de l'inflammation impliquée directement ou indirectement dans la signalisation paracrine, entre le stroma et les cellules épiéliales cancéreuses. Le risque de cancer de la peau augmente de façon exponentielle avec l'âge. Comme un lien probable entre les deux, la sénescence des fibroblastes résulte de la production du sécrétome favorisant la sénescence (SMS), un groupe de facteurs diffusibles induisant une stimulation paracrine de la croissance, l'inflammation et le remodelage de la matrice. De façon fort intéressante, l'induction de ces gènes est aussi une caractéristique des CAFs. Cependant, le lien entre les deux événements cellulaires sénescence et activation des CAFs reste en grande partie inexploré. L'ATF3 (Activating Transcription Factor 3) est un facteur de transcription induit en réponse au stress, dont les fonctions sont hautement spécifiques du type cellulaire. Bien qu'il ait été découvert dans notre laboratoire en tant que promoteur de tumeurs dans les kératinocytes, ses fonctions biologique et biochimique dans le derme n'ont pas encore été étudiées. Récemment, nous avons constaté que, chez la souris, l'abrogation de la voie de signalisation de Notch/CSL dans les DFs, induisait la formation de tumeurs kératinocytaires multifocales. Ces dernières proviennent de la cancérisation en domaine, un phénomène associé à une atrophie du stroma, des altérations de la matrice et de l'inflammation. D'autres études ont montré que CSL agissait comme un régulateur négatif de gènes impliqués dans sénescence des DFs et dans l'activation des CAFs. Ici, nous montrons que la suppression ou l'atténuation de l'expression de ATF3 dans les DFs induit la sénescence et l'expression des gènes liés aux CAFs, de façon similaire à celle déclenchée par la perte de CSL, tandis que la surexpression de ATF3 supprime ces changements. Nous émettons l'hypothèse que ATF3 joue un rôle suppresseur dans l'activation des CAFs et dans la progression des tumeurs kératinocytaires, en surmontant les conséquences de l'abrogation de la voie de signalisation Notch/CSL. En concordance avec cette hypothèse, nous avons constaté que la perte de ATF3 dans les DFs favorisait la tumorigénicité des kératinocytes via le contrôle négatif de cytokines, des enzymes de la matrice de remodelage et de protéines associées au cancer, peut-être par liaison directe des effecteurs de la voie Notch/CSL : IL6 et les gènes Hes. Enfin, dans les échantillons cliniques humains, le stroma sous-jacent aux lésions précancéreuses de kératoses actiniques montre une diminution significative de l'expression de ATF3 par rapport au stroma jouxtant la peau normale. La restauration de l'expression de ATF3 pourrait être utilisée comme un outil thérapeutique en recherche translationnelle pour prévenir ou réprimer le processus de cancérisation en domaine. - Epithelial-mesenchymal interactions play an important role in control of normal skin development, homeostasis and tumorigenesis. The role of dermal fibroblasts (DFs) as the most abundant cell type in stroma is increasingly appreciated. Especially during tumorigenesis, fibroblasts surrounding epithelial tumors, called Cancer Associated Fibroblasts (CAFs), produce diffusible factors (growth factors, inflammatory cytokines, chemokines and enzymes, and matrix metalloproteinases) that mediate inflammation either directly or indirectly through paracrine signaling between stroma and epithelial cancer cells. The risk of skin cancer increases exponentially with age. As a likely link between the two, senescence of fibroblasts results in production of the senescence-messaging-secretome (SMS), a panel of diffusible factors inducing paracrine growth stimulation, inflammation, and matrix remodeling. Interestingly, induction of these genes is also a characteristic of Cancer Associated Fibroblasts (CAFs). However, the link between the two cellular events, senescence and CAF activation is largely unexplored. ATF3 is a key stress response transcription factor with highly cell type specific functions, which has been discovered as a tumor promoter in keratinocytes in our lab. However, the biological and biochemical function of ATF3 in the dermal compartment of the skin has not been studied yet. Recently, we found that compromised Notch/CSL signaling in dermal fibroblasts (DFs) in mice is a primary cause of multifocal keratinocyte tumors called field cancerization associated with stromal atrophy, matrix alterations and inflammation. Further studies showed that CSL functions as a negative regulator of genes involved in DFs senescence and CAF activation. Here, we show that deletion or silencing of the ATF3 gene in DFs activates senescence and CAF-related gene expression similar to that triggered by loss of CSL, while increased ATF3 suppresses these changes. We hypothesize that ATF3 plays a suppressing role in CAF activation and keratinocyte tumor progression, overcoming the consequences of compromised Notch/CSL signaling. In support of this hypothesis, we found that loss of ATF3 in DFs promotes tumorigenic behavior of keratinocytes via negative control of cytokines, matrix-remodeling enzymes and cancer-associated proteins, possibly through direct binding to Notch/CSL targets, IL6 and Hes genes. On the other hand, in human clinical samples, stromal fields underlying premalignant actinic keratosis lesions showed significantly decreased ATF3 expression relative to stroma of flanking normal skin. Restoration of ATF3, which is lost in cancer development, may be used as a therapeutic tool for translational research to prevent or suppress the field cancerization process.

Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal stem cells

SUMMARY : Ewing's sarcoma is a member of Ewing's family tumors (ESPY) and the second most common solid bone and soft tissue malignancy of children and young adults. It is associated in 85% of cases with the t(11;22)(q24:q12) chromosomal translocation that generates fusion of the 5' segment of the EWSR1 gene with the 3' segment of the ETS family gene FLI-1. The EWSR1-FLI-1 fusion protein behaves as an aberrant transcriptional activator and is believed to contribute to ESFT development. However, EWSR1-FLI-1 induces growth arrest and apoptosis in normal fibroblasts, and primary cells that are pemissive for its putative oncogenic properties have not been discovered, hampering basic understanding of ESFT biology. Here, we show that EWSR1-FLI-1 alone can transform mouse primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and generate tumors that display hallmarks of Ewing's sarcoma, including a small round cell phenotype, expression of ESFT-associated markers, insulin like growth factor-I dependence, and induction or repression of numerous EWSR1-FLI-1 target genes. Consistent with this finding, we tested the possibility that human mesenchymal stem cells (hMSC) might also provide a permissive cellular environment for EWSR1-FLI-1, and could represent the first adequate primary human cellular background for the oncogenic properties of the fusion protein. Indeed, expression of EWSR1-FLI-1 in human mesenchymal stem cells (hMSC) was not only stably maintained without inhibiting proliferation, but induced a gene expression profile bearing striking similarity to that of ESFT, including genes that are among the highest ESFT discriminators. Expression of EWSR1-FLI-1 in hMSCs may recapitulate the initial steps of Ewing's sarcoma development, allowing identification of genes that play an important role early in its pathogenesis. Among relevant candidate transcripts induced by EWSR1-FL/-1 in hMSC we found the polycomb group gene EZH2 which we show to play a critical role in Ewing's sarcoma growth. These observations provide the first identification of candidate primary cells from which ESFTs originate and suggest that EWSR1-FLI-1 expression may constitute the initiating event in ESFT pathogenesis. Le sarcome d' Ewing est un membre de la famille des tumeurs Ewing (ESFT) et représente la deuxième tumeur maligne solide de l'os et des tissus mous chez les enfants et les jeunes adultes. Cette tumeur est associée dans 85% des cas avec la translocation chromosomique t(11;22)(g24:g12), qui génère la fusion entre le segment 5' du gène EWSR1 avec le segment 3' du gène FLI-1, appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS. La protéine de fusion EWSR1-FLI-1 qui en dérive joue le rSle d'un facteur de transcription aberrant, et est supposée contribuer de manière décisive au processus de développement des ESFTs. Néanmoins, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des fibroblastes normaux induit un arrêt de croissance et leur apoptose, et les cellules primaires permissives pour les propriétés oncogéniques attribuées à la translocation n'ont pas encore été identifiées, empêchant la compréhension de la biologie de base du sarcome d'Ewing. Dans ce travail on montre que l'expression de EWSR1-FLI-1 uniquement est capable de transformer des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de la souris, pour générer des tumeurs qui présentent les caractéristiques du sarcome d' Ewing humain, et notamment une morphologie de petites cellules bleues et rondes, l'expression de marqueurs associés aux ESFTs, une dépendance du facteur de croissance IGF-1, et l'induction ou la répression de nombreux gènes cibles connus de EWSR1-FLI-1. Sur la base de ces observations, on a testé la possibilité que les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) puissent aussi fournir un environnement cellulaire permissif pour EWSR1-FLI-1 ; et représenter le premier background cellulaire humain adéquat pour la manifestation du pouvoir oncogénique de la protéine de fusion. En effet, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des cellules souches mésenchymateuses humaines s'est révélée non seulement maintenue, mais elle a induit un profil d'expression génétique étonnamment similaire à celui des ESFTs humains, incluant les gènes qui ont été rapportés comme étant les plus discriminatifs pour ces tumeurs. L'expression de EWSR1-FLI-1 dans les hMSCs pourrait récapituler les étapes initiales du développement du sarcome d' Ewing, et de ce fait consentir à identifier les gènes qui jouent un rôle crucial dans sa pathogenèse précoce. Parmi les transcrits relevant indults par EWSR1-FL/-9 dans les hMSCs nous avons découvert le gène du groupe des polycomb EZH2, que nous avons par la suite démontré jouer un rôle essentiel dans la croissance du sarcome de Ewing. Ces observations apportent pour la première fois l'identification d'une cellule primaire candidate pour représenter la cellule d'origine des ESFTs, et en même temps suggèrent que l'expression de EWSR1-FLI-1 peut constituer l'événement initial dans la pathogenèse du sarcome d' Ewing.

Annotating the human genome

2 Abstract2.1 En françaisLe séquençage du génome humain est un pré-requis fondamental à la compréhension de la biologie de l'être humain. Ce projet achevé, les scientifiques ont dû faire face à une tâche aussi importante, comprendre cette suite de 3 milliards de lettres qui compose notre génome. Le consortium ENCODE (ENCyclopedia Of Dna Elements) fût formé comme une suite logique au projet du génome humain. Son rôle est d'identifier tous les éléments fonctionnels de notre génome incluant les régions transcrites, les sites d'attachement des facteurs de transcription, les sites hypersensibles à la DNAse I ainsi que les marqueurs de modification des histones. Dans le cadre de ma thèse doctorale, j'ai participé à 2 sous-projets d'ENCODE. En premier lieu, j'ai eu la tâche de développer et d'optimiser une technique de validation expérimentale à haut rendement de modèles de gènes qui m'a permis d'estimer la qualité de la plus récente annotation manuelle. Ce nouveau processus de validation est bien plus efficace que la technique RNAseq qui est actuellement en train de devenir la norme. Cette technique basée sur la RT-PCR, m'a notamment permis de découvrir de nouveaux exons dans 10% des régions interrogées. En second lieu j'ai participé à une étude ayant pour but d'identifier les extrémités de tous les gènes des chromosomes humains 21 et 22. Cette étude à permis l'identification à large échelle de transcrits chimères comportant des séquences provenant de deux gènes distincts pouvant être à une grande distance l'un de autre.2.2 In EnglishThe completion of the human genome sequence js the prerequisite to fully understand the biology of human beings. This project achieved, scientists had to face another challenging task, understanding the meaning of the 3 billion letters composing this genome. As a logical continuation of the human genome project, the ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) consortium was formed with the aim of annotating all its functional elements. These elements include transcribed regions, transcription binding sites, DNAse I hypersensitive sites and histone modification marks. In the frame of my PhD thesis, I was involved in two sub-projects of ENCODE. Firstly I developed and optimized an high throughput method to validate gene models, which allowed me to assess the quality of the most recent manually-curated annotation. This novel experimental validation pipeline is extremely effective, far more so than transcriptome profiling through RNA sequencing, which is becoming the norm. This RT-PCR-seq targeted-approach is likewise particularly efficient in identifying novel exons, as we discovered about 10% of loci with unannotated exons. Secondly, I participated to a study aiming to identify the gene boundaries of all genes in the human chromosome 21 and 22. This study led to the identification of chimeric transcripts that are composed of sequences coming form two distinct genes that can be map far away from each other.