Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions.

CONTENTS: Summary 28 I. Historic background and introduction 29 II. Diversity of cardenolide forms 29 III. Biosynthesis 30 IV. Cardenolide variation among plant parts 31 V. Phylogenetic distribution of cardenolides 32 VI. Geographic distribution of cardenolides 34 VII. Ecological genetics of cardenolide production 34 VIII. Environmental regulation of cardenolide production 34 IX. Biotic induction of cardenolides 36 X. Mode of action and toxicity of cardenolides 38 XI. Direct and indirect effects of cardenolides on specialist and generalist insect herbivores 39 XII. Cardenolides and insect oviposition 39 XIII. Target site insensitivity 40 XIV. Alternative mechanisms of cardenolide resistance 40 XV. Cardenolide sequestration 41 Acknowledgements 42 References 42 SUMMARY: Cardenolides are remarkable steroidal toxins that have become model systems, critical in the development of theories for chemical ecology and coevolution. Because cardenolides inhibit the ubiquitous and essential animal enzyme Na(+) /K(+) -ATPase, most insects that feed on cardenolide-containing plants are highly specialized. With a huge diversity of chemical forms, these secondary metabolites are sporadically distributed across 12 botanical families, but dominate the Apocynaceae where they are found in > 30 genera. Studies over the past decade have demonstrated patterns in the distribution of cardenolides among plant organs, including all tissue types, and across broad geographic gradients within and across species. Cardenolide production has a genetic basis and is subject to natural selection by herbivores. In addition, there is strong evidence for phenotypic plasticity, with the biotic and abiotic environment predictably impacting cardenolide production. Mounting evidence indicates a high degree of specificity in herbivore-induced cardenolides in Asclepias. While herbivores of cardenolide-containing plants often sequester the toxins, are aposematic, and possess several physiological adaptations (including target site insensitivity), there is strong evidence that these specialists are nonetheless negatively impacted by cardenolides. While reviewing both the mechanisms and evolutionary ecology of cardenolide-mediated interactions, we advance novel hypotheses and suggest directions for future work.

Structural analysis of TCR-ligand interactions studied on H-2Kd-restricted cloned CTL specific for a photoreactive peptide derivative.

To study the interaction of the TCR with its ligand, the complex of a MHC molecule and an antigenic peptide, we modified a TCR contact residue of a H-2Kd-restricted antigenic peptide with photoreactive 4-azidobenzoic acid. The photoreactive group was a critical component of the epitope recognized by CTL clones derived from mice immunized with such a peptide derivative. The majority of these clones expressed V beta 1-encoded beta chains that were paired with J alpha TA28-encoded alpha chains. For one of these TCR, the photoaffinity labeled sites were mapped on the alpha chain as a J alpha TA28-encoded tryptophan and on the beta chain as a residue of the C' strand of V beta 1. Molecular modeling of this TCR suggested the presence of a hydrophobic pocket that harbors this tryptophan as well as a tyrosine on the C' strand of V beta 1 between which the photoreactive side chain inserts. It is concluded that this avid binding principle may account for the preferential selection of V beta 1 and J alpha TA28-encoded TCR.

Involvement of microglia-neuron interactions in the tumor necrosis factor-alpha release, microglial activation, and neurodegeneration induced by trimethyltin.

Trimethyltin (TMT) is a neurotoxicant known to induce early microglial activation. The present study was undertaken to investigate the role played by these microglial cells in the TMT-induced neurotoxicity. The effects of TMT were investigated in monolayer cultures of isolated microglia or in neuron-enriched cultures and in neuron-microglia and astrocyte-microglia cocultures. The end points used were morphological criteria; evaluation of cell death and cell proliferation; and measurements of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), interleukin-6 (IL-6), and nitric oxide (NO) release in culture supernatant. The results showed that, in cultures of microglia, TMT (10(-6) M) caused, after a 5-day treatment, an increased release of TNF-alpha, without affecting microglial shape or cell viability. When microglia were cocultured with astrocytes, TNF-alpha release was decreased to undetectable levels. In contrast, in neuron-microglia cocultures, TNF-alpha levels were found to increase at lower concentrations of TMT (i.e., 10(-8) M). Moreover, at 10(-6) M of TMT, microglia displayed further morphological activation, as suggested by process retraction and by decrease in cell size. No morphological activation was observed in cultures of isolated microglial cells and in astrocyte-microglia cocultures. With regard to neurons, 10(-6) M of TMT induced about 30% of cell death, when applied to neuron-enriched cultures, whereas close to 100% of neuronal death was observed in neuron-microglia cocultures. In conclusion, whereas astrocytes may rather dampen the microglial activation by decreasing microglial TNF-alpha production, neuronal-microglial interactions lead to enhanced microglial activation. This microglial activation, in turn, exacerbates the neurotoxic effects of TMT. TNF-alpha may play a major role in such cell-cell communications.

Analysis of selectin ligands supporting hematologic malignancy cell interactions with their microenvironment : focus on leukemia and multiple myeloma

CONTEXTE: Les sélectines sont une famille de trois protéines qui règlent la capture et le roulement des leucocytes et qui initient la cascade d'adhésion. Elles contrôlent également la migration des leucocytes en réponse à un stimulus physiologique ou inflammatoire pour atteindre un organe cible. Le rôle des sélectines et des leurs ligands est bien connu dans l'adhésion des leucocytes normaux à l'endothélium; en revanche, la nature des ligands des sélectines exprimés par les cellules leucémiques et le myélome multiple est peu connue. La récente découverte que la E- et la P-sélectine sont exprimées par les cellules endothéliales et du stroma de la moelle osseuse, nous a incité à examiner leur rôle dans les interactions des cellules malignes avec leur environnement médullaire. RÉSULTATS: Les analyses ont été conduites sur les cellules du sang ou de la moelle osseuse prélevées à des patients atteints de leucémie aiguë ou de myélome multiple et sur des lignées cellulaires. Les ligands des sélectines qui ont été identifiés sur les blastes leucémiques ou les plasmocytes, sont « P-selectin glycoprotein ligand-1 » (PSGL-1), CD44, CD43 et l'endoglycan (EGC), ainsi que les saccharides fucosylés sLex et CLA. Nous avons vérifié dans des expériences d'adhésion cellulaire effectuées dans des conditions de flux que ces ligands sont fonctionnels, étant porteurs des sucres mentionnés, et qu'ils sont capables de supporter le roulement cellulaire dépendant des sélectines. De plus, nous avons montré que la liaison de ces ligands génère des signaux intracellulaires favorisant la prolifération et la survie des cellules de myélome. CONCLUSION. Les données présentées ici montrent que la E- et la P- sélectine du microenvironnement médullaire interagissent avec les cellules leucémiques et de myélome multiple, et que ces interactions activent des voies de signalisation contrôlant la prolifération et la survie cellulaire. Ces effets protecteurs sont impliqués dans la persistance de clones cellulaires malins résistant aux traitements et peuvent conduire à la récidive de la maladie. L'inhibition de ces interactions pourrait fournir de nouvelles options thérapeutiques pour le traitement de ces maladies de mauvais pronostic. - BACKGROUND: Selectins are a family of glycoproteins involved in the first steps of the adhesion cascade, tethering and rolling, during which leukocytes sense tissue specific signals and commit the cells to enter in a particular organ or inflammation site. While the role of selectins and their ligands is well established in supporting normal leukocyte adhesion to vascular endothelium, our knowledge of selectin ligands in two hematological malignancies, acute leukemia and multiple myeloma, is incomplete. The recent discovery that E- and P- selectin are also expressed on bone marrow (BM) endothelial and stromal cells, prompted us to investigate a potential role in selectin-mediated interaction of malignant cells with its protective BM microenvironment. RESULTS. Using cells obtained from blood or BM of patients affected by acute myeloid or lymphoblastic leukemia, or multiple myeloma, as well as cell lines, we characterized the expression of selectin ligands on blasts and plasma cells and identified P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), CD44, CD43 and endoglycan (EGC), as well as sLex/CLA determinants. Rolling assays under flow conditions allowed us to verify that these ligands are functional, i.e. correctly glycosylated and able to support selectin-mediated rolling. Moreover, we demonstrated that these ligands trigger proliferation and pro-survival signals upon engagement on myeloma cells. CONCLUSIONS. Data presented here demonstrate that E- and P-selectin in the BM microenvironment interact with leukemia and myeloma cells, and suggest that they have an impact on proliferation and survival of malignant plasma cells. These protective effects may induce drug resistance in malignant clones, leading to disease relapse. Interfering with these interactions could provide new therapeutic options. - Le corps humain dépend du système immunitaire pour sa protection face aux agressions, notamment des bactéries ou des virus, ou face à une dysfonction de l'organisme. Ce système est composé de plusieurs types cellulaires, regroupés sous le nom de leucocytes, qui participent à son fonctionnement. Ces cellules se développent à partir d'une cellule souche hématopo'iétique commune qui réside dans la moelle osseuse. Comme c'est le cas dans les autres tissus, les cellules du système immunitaire peuvent aussi développer des cancers, appelés tumeurs hématopoïétiques ou tumeurs du sang. Bien que ces maladies puissent être traitées avec succès grâce à de fortes doses de chimiothérapies ou à d'autres moyens comme les greffes, les patients connaissent un fort taux de rechute. La raison de ces récidives est la survie d'une partie des cellules malignes dans la moelle osseuse, où elles reçoivent une protection au traitement par le biais de l'interaction avec d'autres cellules. Les sélectines (E-, P- et L-sélectine) régulent l'interaction des leucocytes avec l'endothélium (la paroi des vaisseaux sanguins), d'autres leucocytes et les plaquettes ; ces interactions surviennent quand les leucocytes atteignent un site d'inflammation ou un organe cible. Dans la moelle osseuse, la E- et la P-sélectine se trouvent sur les cellules de l'endothélium et sur les macrophages, qui sont d'autres leucocytes faisant partie du stroma de la moelle. Elles pourraient être impliquées dans la protection des cellules cancéreuses évoquée plus haut. Les molécules d'adhésion avec lesquelles les sélectines s'associent, autrement dit les ligands des sélectines, sont des glycoprotéines. Ces protéines ont besoin de sucres spécifiques pour acquérir une telle capacité d'adhésion. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié deux types de cellules extraites du sang et de la moelle osseuse des patients atteints d'une leucémie aiguë (les blastes) ou de myélome multiple (les plasmocytes), et leur capacité à se lier aux sélectines. Nous avons démontré une interaction entre ces cellules malignes et la E- et/ou la P-sélectine, à condition que les ligands soient correctement décorés. De plus, lors que les plasmocytes se lient aux sélectines, une cascade de signaux à l'intérieur des cellules stimule leur prolifération et leur survie. L'ensemble de ces résultats permet l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles de ces hémopathies de mauvais pronostic.

Functional interactions of peroxisome proliferator-activated receptor, retinoid-X receptor, and Sp1 in the transcriptional regulation of the acyl-coenzyme-A oxidase promoter.

Peroxisome proliferator-activated receptor (PPARs) are members of the nuclear receptor superfamily. For transcriptional activation of their target genes, PPARs heterodimerize with the retinoid-X receptor (RXR). The convergence of the PPAR and RXR signaling pathways has been shown to have an important function in lipid metabolism. The promoter of the gene encoding the acyl-coenzyme-A oxidase (ACO), the rate-limiting enzyme in peroxisomal beta-oxidation of fatty acids, is a target site of PPAR action. In this study, we examined the role and the contribution of both cis-and trans-acting factors in the transcriptional regulation of this gene using transient transfections in insect cells. We identified several functional cis-acting elements present in the promoter of the ACO gene and established that PPAR-dependent as well as PPAR-independent mechanisms can activate the ACO promoter in these cells. We show that the PPAR/RXR heterodimer exerts its effect through two response elements within the ACO promoter, in synergy with the transcription factor Sp1 via five Sp1-binding sites. Furthermore, this functional interaction also occurs when Sp1 is co-expressed with PPAR or RXR alone, indicating that activation can occur independently of PPAR/RXR heterodimers.

Amoebae as a tool to isolate new bacterial species, to discover new virulence factors and to study the host-pathogen interactions.

Amoebae are unicellular protozoan present worldwide in several environments mainly feeding on bacteria. Some of them, the amoebae-resistant bacteria (ARBs), have evolved mechanisms to survive and replicate inside amoebal species. These mainly include legionella, mycobacteria and Chlamydia-related bacteria. Amoebae can provide a replicative niche, can act as reservoir for bacteria whereas the cystic form can protect the internalized bacteria. Moreover, the amoebae represent a Trojan horse for ARBs to infect animals. The long interaction between amoebae and bacteria has likely selected for bacterial virulence traits leading to the adaptation towards an intracellular lifestyle, and some ARBs have acquired the ability to infect mammals. This review intends to highlight the important uses of amoebae in several fields in microbiology by describing the main tools developed using amoebal cells. First, amoebae such as Acanthamoeba are used to isolate and discover new intracellular bacterial species by two main techniques: the amoebal co-culture and the amoebal enrichment. In the second part, taking Waddlia chondrophila as example, we summarize some important recent applications of amoebae to discover new bacterial virulence factors, in particular thanks to the amoebal plaque assay. Finally, the genetically tractable Dictyostelium discoideum is used as a model organism to study host-pathogen interactions, in particular with the development of several approaches to manipulate its genome that allowed the creation of a wide range of mutated strains largely shared within the Dictyostelium community.

Genetic evidence that the higher plant Rab-D1 and Rab-D2 GTPases exhibit distinct but overlapping interactions in the early secretory pathway.

GTPases of the Rab1 subclass are essential for membrane traffic between the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi complex in animals, fungi and plants. Rab1-related proteins in higher plants are unusual because sequence comparisons divide them into two putative subclasses, Rab-D1 and Rab-D2, that are conserved in monocots and dicots. We tested the hypothesis that the Rab-D1 and Rab-D2 proteins of Arabidopsis represent functionally distinct groups. RAB-D1 and RAB-D2a each targeted fluorescent proteins to the same punctate structures associated with the Golgi stacks and trans-Golgi-network. Dominant-inhibitory N121I mutants of each protein inhibited traffic of diverse cargo proteins at the ER but they appeared to act via distinct biochemical pathways as biosynthetic traffic in cells expressing either of the N121I mutants could be restored by coexpressing the wild-type form of the same subclass but not the other subclass. The same interaction was observed in transgenic seedlings expressing RAB-D1 [N121I]. Insertional mutants confirmed that the three Arabidopsis Rab-D2 genes were extensively redundant and collectively performed an essential function that could not be provided by RAB-D1, which was non-essential. However, plants lacking RAB-D1, RAB-D2b and RAB-D2c were short and bushy with low fertility, indicating that the Rab-D1 and Rab-D2 subclasses have overlapping functions.

Targeting anticancer therapy : clinical and preclinical approaches

AbstractCancer treatment has shifted from cytotoxic and nonspecific chemotherapy to chronic treatment with targeted molecular therapies. These new classes of drugs directed against cancer-specific molecules and signaling pathways, act at a particular level of the tumor cell development. However, in both types of therapeutic approaches (standard cytotoxic chemotherapy and targeted signal transduction inhibitions), toxicity and side effects can occur. The aim of this thesis was to investigate various approaches to improve the activity and tolerability of cancer treatment, in a clinical setting, a) by molecular targeting through the use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), whose dosage can be adapted to each patient according to plasma levels, and, b) in a preclinical model, by tissue targeting with locoregional administration of cytotoxic chemotherapy to increase drug exposure in the target tissue while reducing systemic toxicity of the treatment.A comprehensive program for the Therapeutic Drug Monitoring (TDM) of the new class of targeted anticancer drugs of TKIs in patient's blood has been therefore initiated comprising the setting up, validation and clinical application of a multiplex assay by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry of TKIs in plasma from cancer patients. Information on drugs exposure may be clinically useful for an optimal follow-up of patients' anticancer treatment, especially in case of less than optimal clinical response, occurrence of adverse drug reaction effects and the numerous risks of drug-drug interactions. In this context, better knowledge of the potential drug interactions between TKIs and widely prescribed co- medications is of critical importance for clinicians, to improve their daily care of cancer patients. For one of the first TKI imatinib, TDM interpretation is nowadays based on total plasma concentrations but, only the unbound (free) form is likely to enter cell to exert its pharmacological action. Pharmacokinetic analysis of the total and free plasma level of imatinib measured simultaneously in patients have allowed to refine and validate a population pharmacokinetic model integrating factors influencing in patients the exposure of pharmacological active species. The equation developed from this model may be used for extrapolating free imatinib plasma concentration based on the total plasma levels that are currently measured in TDM from patients. Finally, the specific influence of Pglycoprotein on the intracellular disposition of TKIs has been studies in cell systems using the siRNA silencing approach.Another approach to enhance the selectivity of anticancer treatment may be achieved by the loco-regional administration of a cytostatic agent to the target organ while sparing non- affected tissues. Isolated lung perfusion (ILP) was designed for the treatment of loco-regional malignancies of the lung but clinical results have been so far disappointing. It has been shown in a preclinical model in rats that ILP with the cytotoxic agent doxorubicin alone allows a high drug uptake in lung tissue, and a low systemic toxicity, but was characterized by a high spatial tissular heterogeneity in drug exposure and doxorubicin uptake in tumor was comparatively smaller than in normal lung tissue. Photodynamic therapy (PDT) is a new approach for the treatment of superficial tumors, and implies the application of a sensitizer activated by a laser light at a specific wavelength, that disrupts endothelial barrier of tumor vessels to increase locally the distribution of cytostatics into the tumor tissue. PDT pre-treatment before intravenous administration of liposomal doxorubicin was indeed shown to selectively increase drug uptake in tumors in a rat model of sarcoma tumors to the lung.RésuméLe traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et est passé de la chimiothérapie, cytotoxique et non spécifique, au traitement chronique des patients avec des thérapies moléculaires ciblées. Ces médicaments ont une action ciblée en interférant à un niveau spécifique du développement de la cellule tumorale. Dans les deux types d'approches thérapeutiques (chimiothérapie cytotoxique et traitements ciblés), on est confronté à la présence de toxicité et aux effets secondaires du traitement anticancéreux. Le but de cette thèse a donc été d'étudier diverses approches visant à améliorer l'efficacité et la tolérabilité du traitement anticancéreux, a) dans le cadre d'une recherche clinique, par le ciblage moléculaire grâce aux inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs) dont la posologie est adaptée à chaque patient, et b) dans un modèle préclinique, par le ciblage tissulaire grâce à l'administration locorégionale de chimiothérapie cytotoxique, afin d'augmenter l'exposition dans le tissu cible et de réduire la toxicité systémique du traitement.Un programme de recherche sur le suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) des inhibiteurs de tyrosine kinases a été ainsi mis en place et a impliqué le développement, la validation et l'application clinique d'une méthode multiplex par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem des TKIs chez les patients souffrant de cancer. L'information fournie par le TDM sur l'exposition des patients aux traitements ciblés est cliniquement utile et est susceptible d'optimiser la dose administrée, notamment dans les cas où la réponse clinique au traitement des patients est sous-optimale, en présence d'effets secondaires du traitement ciblé, ou lorsque des risques d'interactions médicamenteuses sont suspectés. Dans ce contexte, l'étude des interactions entre les TKIs et les co-médications couramment associées est utile pour les cliniciens en charge d'améliorer au jour le jour la prise en charge du traitement anticancéreux. Pour le premier TKI imatinib, l'interprétation TDM est actuellement basée sur la mesure des concentrations plasmatiques totales alors que seule la fraction libre (médicament non lié aux protéines plasmatiques circulantes) est susceptible de pénétrer dans la cellule pour exercer son action pharmacologique. L'analyse pharmacocinétique des taux plasmatiques totaux et libres d'imatinib mesurés simultanément chez les patients a permis d'affiner et de valider un modèle de pharmacocinétique de population qui intègre les facteurs influençant l'exposition à la fraction de médicament pharmacologiquement active. L'équation développée à partir de ce modèle permet d'extrapoler les concentrations libres d'imatinib à partir des concentrations plasmatiques totales qui sont actuellement mesurées lors du TDM des patients. Finalement, l'influence de la P-glycoprotéine sur la disposition cellulaire des TKIs a été étudiée dans un modèle cellulaire utilisant l'approche par la technologie du siRNA permettant de bloquer sélectivement l'expression du gène de cette protéine d'efflux des médicaments.Une autre approche pour augmenter la sélectivité du traitement anticancéreux consiste en une administration loco-régionale d'un agent cytostatique directement au sein de l'organe cible tout en préservant les tissus sains. La perfusion isolée du poumon (ILP) a été conçue pour le traitement loco-régional des cancers affectant les tissus pulmonaires mais les résultats cliniques ont été jusqu'à ce jour décevants. Dans des modèles précliniques chez le rat, il a pu être démontré que l'ILP avec la doxorubicine, un agent cytotoxique, administré seul, permet une exposition élevée au niveau du tissu pulmonaire, et une faible toxicité systémique. Toutefois, cette technique est caractérisée par une importante variabilité de la distribution dans les tissus pulmonaires et une pénétration du médicament au sein de la tumeur comparativement plus faible que dans les tissus sains.La thérapie photodynamique (PDT) est une nouvelle approche pour le traitement des tumeurs superficielles, qui consiste en l'application d'un agent sensibilisateur activé par une lumière laser de longueur d'onde spécifique, qui perturbe l'intégrité physiologique de la barrière endothéliale des vaisseaux alimentant la tumeur et permet d'augmenter localement la pénétration des agents cytostatiques.Nos études ont montré qu'un pré-traitement par PDT permet d'augmenter sélectivement l'absorption de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration i.v. de doxorubicine liposomale dans un modèle de sarcome de poumons de rongeurs.Résumé large publicDepuis une dizaine d'année, le traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et les patients qui devaient jusqu'alors subir des chimiothérapies, toxiques et non spécifiques, peuvent maintenant bénéficier de traitements chroniques avec des thérapies ciblées. Avec les deux types d'approches thérapeutiques, on reste cependant confronté à la toxicité et aux effets secondaires du traitement.Le but de cette thèse a été d'étudier chez les patients et dans des modèles précliniques les diverses approches visant à améliorer l'activité et la tolérance des traitements à travers un meilleur ciblage de la thérapie anticancéreuse. Cet effort de recherche nous a conduits à nous intéresser à l'optimisation du traitement par les inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs), une nouvelle génération d'agents anticancéreux ciblés agissant sélectivement sur les cellules tumorales, en particulier chez les patients souffrant de leucémie myéloïde chronique et de tumeurs stromales gastro-intestinales. L'activité clinique ainsi que la toxicité de ces TKIs paraissent dépendre non pas de la dose de médicament administrée, mais de la quantité de médicaments circulant dans le sang auxquelles les tumeurs cancéreuses sont exposées et qui varient beaucoup d'un patient à l'autre. A cet effet, nous avons développé une méthode par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse pour mesurer chez les patients les taux de médicaments de la classe des TKIs dans la perspective de piloter le traitement par une approche de suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM). Le TDM repose sur la mesure de la quantité de médicament dans le sang d'un patient dans le but d'adapter individuellement la posologie la plus appropriée: des quantités insuffisantes de médicament dans le sang peuvent conduire à un échec thérapeutique alors qu'un taux sanguin excessif peut entraîner des manifestations toxiques.Dans une seconde partie préclinique, nous nous sommes concentrés sur l'optimisation de la chimiothérapie loco-régionale dans un modèle de sarcome du poumon chez le rat, afin d'augmenter l'exposition dans la tumeur tout en réduisant la toxicité dans les tissus non affectés.La perfusion isolée du poumon (ILP) permet d'administrer un médicament anticancéreux cytotoxique comme la doxorubicine, sélectivement au niveau le tissu pulmonaire où sont généralement localisées les métastases de sarcome. L'administration par ILP de doxorubicine, toxique pour le coeur, a permis une forte accumulation des médicaments dans le poumon, tout en épargnant le coeur. Il a été malheureusement constaté que la doxorubicine ne pénètre que faiblement dans la tumeur sarcomateuse, témoignant des réponses cliniques décevantes observées avec cette approche en clinique. Nous avons ainsi étudié l'impact sur la pénétration tumorale de l'association d'une chimiothérapie cytotoxique avec la thérapie photodynamique (PDT) qui consiste en l'irradiation spécifique du tissu-cible cancéreux, après l'administration d'un agent photosensibilisateur. Dans ce modèle animal, nous avons observé qu'un traitement par PDT permet effectivement d'augmenter de façon sélective l'accumulation de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration intraveineuse de médicament.

Probing the interactions of NK cell receptors with ligand expressed in trans and cis.

Certain receptors on natural killer (NK) cells, which are specific for MHC class I (MHC-I) molecules, do not only interact with ligand expressed on opposing cell membranes (in trans) but also interact with those on the same cell membrane (in cis). Cis interactions have been demonstrated for only a small number of cell surface receptors. However, this has not been tested systematically, raising the possibility that additional receptors may be able to bind ligand expressed in cis. Here we describe a number of approaches to evaluate trans and cis binding of the Ly49A NK cell receptor to its H-2D(d) ligand. These procedures should facilitate the investigation of cis/trans interactions of other receptor-ligand pairs and simplify the analysis of NK cell receptor variants.

New human kallikrein 14: enzymatic characterization and inhibitors development.

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC En biologie, si une découverte permet de répondre à quelques questions, en général elle en engendre beaucoup d'autres. C'est ce qui s'est produit récemment dans le monde des kallicréines. De la famille des protéases, protéines ayant la faculté de couper plus ou moins spécifiquement d'autres protéines pour exercer un rôle biologique, la famille des kallicréines humaines n'était composée que de 3 membres lors du siècle dernier. Parmi eux, une kallicréine mondialement utilisée pour détecter le cancer de la prostate, le PSA. En 2000, un chercheur de l'hôpital universitaire Mont Sinaï à Toronto, le Professeur Eleftherios Diamandis, a découvert la présence de 12 nouveaux gènes appartenant à cette famille, situés sur le même chromosome que les 3 premières kallicréines. Cette découverte majeure a placé les spécialistes des kallicréines face à une montagne d'interrogations car les fonctions de ces nouvelles protéases étaient totalement inconnues. La kallicréine humaine 14 (hK14) présente un intérêt particulier, car elle se retrouve associée à différents cancers, notamment les carcinomes ovariens et mammaires. Cette association ne répond cependant pas à la fonction de cette protéase. L'objectif de ce travail de thèse était donc de découvrir, dans un premier temps, la spécificité de cette nouvelle kallicréine, c'est-à-dire le type de coupure qu'elle engendre au niveau des protéines qu'elle cible. Utilisant une technologie de pointe qui exploite la propriété des bactériophages à se répliquer dans les bactéries à l'infini, des dizaines de millions de combinaisons protéiques aléatoires ont été présentées à hK14, qui a pu sélectionner celles qui lui étaient favorables pour la coupure. Cette technique qualitative porte le nom de Phage Display Substrate. Une fois la sélection réalisée, il fallait transférer ces séquences coupées ou substrats dans un système permettant de donner une valeur quantitative à l'efficacité de coupure. Pour cela nous avons développé une technologie qui permet d'évaluer cette efficacité en utilisant des protéines fluorescentes de méduse, modifiées génétiquement, dont l'excitation de la première (CFP : cyan fluorescent protein) par la lumière à une certaine longue d'onde permet le transfert d'énergie à la seconde (YFP : yellow fluorescent protein), via un substrat qui les lie. Pour que ce transfert d'énergie se produise, il faut que les deux protéines fluorescentes soient proches, comme c'est le cas lorsqu'elles sont liées par un substrat. La coupure de ce lien provoque un changement de transfert d'énergie qui est quantifiable en utilisant un spectrofluoromètre. Cette technologie permet donc de suivre la réaction d'hydrolyse (coupure) des protéases. Afin de poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre la fonction biologique d'hK14 ainsi que son éventuelle implication dans le cancer, nous avons développé des inhibiteurs spécifiques d'hK14. Les séquences qui on été le plus efficacement coupées par hK14 ont été utilisées pour transformer deux types d'inhibiteurs classiques, qui circulent dans notre sang, en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Selon les résultats obtenus in vitro, ils pourront être évalués in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. RESUME Les protéases sont des enzymes impliquées dans des processus physiologiques mais aussi parfois pathologiques. La famille des kallicréines tissulaires humaines représente le plus grand groupe de protéases humaines, dont plusieurs pourraient participer au développement de certaines maladies. D'autre part, ces protéases sont apparues comme des marqueurs de pathogénicité potentiels, notamment dans les cas de cancers hormono-dépendants. La kallicréine humaine 14 a été récemment découverte et son implication dans quelques maladies, particulièrement dans le cas de tumeurs, semble probable. En effet, son expression génique est augmentée au niveau des tissus cancéreux de la prostate et du sein et son expression protéique s'est révélée plus élevée dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein ou des ovaires. Cependant, comme c'est le cas pour la plupart des kallicréines, sa fonction est encore inconnue. Afin de mieux connaître son rôle biologique et/ou pathologique, nous avons décidé de caractériser son activité enzymatique. Nous avons tout d'abord mis au point un système de substrats entièrement biologique permettant d'étudier in vitro l'activité des protéases. Ce système est basé sur le phénomène de FRET, à savoir le transfert d'énergie de résonance fluorescente qui intervient entre deux molécules fluorescentes voisines si le spectre d'émission de la protéine donneuse chevauche le spectre d'excitation de la protéine receveuse. Nous avons fusionné de manière covalente une protéine fluorescente bleue (CFP) et une jaune (YFP) en les liant avec diverses séquences. Par clivage de la séquence de liaison, une perte du transfert d'énergie peut être mesurée par un spectrofluoromètre. Cette technologie représente un moyen facile de suivre la réaction d'hydrolyse des protéases. Les conditions optimales de production de ces substrats CFP-YFP ont été déterminées, de même que les paramètres pouvant éventuellement influencer le FRET. Ce système possède une grande résistance à la protéolyse non spécifique et est applicable à un grand nombre de protéase. Contrairement aux substrats fluorogéniques, il permet d'étudier les acides aminés se trouvant des deux côtés du site de clivage. Ce système étant entièrement biologique, il est le reflet des interactions protéine-protéine et représente un outil biologique facile, bon marché et rapide pour caractériser les protéases. Dans un premier temps, hK14 a été mise en présence d' une banque de haute diversité de pentapeptides aléatoires présentée à la surface de phages afin d'identifier des substrats spécifiques. Ensuite, le système CFP-YFP a été employé pour trier les peptides sélectionnés afin d'identifier les séquences de substrats les plus sensibles et spécifiques pour hK14. Nous avons montré, qu'en plus de sa prévisible activité de type trypsine, hK14 possède aussi une très surprenante activité de type chymotrypsine. Les séquences les plus sensibles ont été choisies pour cribler la banque de donnée Swissprot, permettant ainsi l'identification de 6 substrats protéiques humains potentiels pour hK14. Trois d'entre eux, la laminine α-5, le collagène IV et la matriline-4, qui sont des composants de la matrice extracellulaire, ont démontré une grande susceptibilité à l'hydrolyse par hK14. De plus, la séparation éléctrophorétique a montré que la dégradation de la laminine α-5 et de la matriline-4 par hK14 devait se produire aux sites identifiés par la technologie du phage display. Pour terminer, nous avons transformé, par mutagenèse dirigée, deux serpines (inhibiteurs de protéases de type sérine) connues, AAT et ACT (alpha anti-trypsine et alpha anti-chymotrypsine), qui inhibent un vaste éventail d'enzymes humaines en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Ces inhibiteurs pourront être utilisés d'une part pour poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre l'implication d'hK14 dans des voies physiologiques ou dans le cancer et d'autre part pour les évaluer in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. SUMMARY Proteases consist of enzymes involved in physiological events, but also, in case of dysregulation, in pathogenicity. The human tissue kallikrein family represents the largest human protease cluster and includes several members that either could participate in the course of certain diseases or emerged as potential biological markers, especially in hormone dependent cancers. The human kallikrein 14 has been recently discovered and suggested implications in some disorders, particularly in tumors since its gene expression is up-regulated in prostate and breast cancer tissues and its protein expression increased in the serum of patients with breast and ovarian cancers. However, like most kallikreins, its function remains unknown. To better understand hK14 biological and/or pathological role, we decided to characterize its enzymatic activity. First of all, we developped a biological system suitable for in vitro study of protease activity. This system is based on the so-called FRET phenomenon, that is the Fluorescence Resonance Energy Transfer that occurs between two nearby fluorescent proteins if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. We fused covalently a cyan fluorescent protein (CFP) and a yellow fluorescent protein (YFP) with diverses sequences. Upon cleavage of the linker sequence by protease, the loss of energy transfer can be measured by a spectrofluorometer allowing an easy following of hydrolysis reaction. The optimal conditions to produce in bacterial system these CFP-YFP substrates were determined as well as the parameters that could eventually influence the FRET. This system demonstrated a high degree of resistance to non-specific proteolysis and applicability to various conditions corresponding to a great number of existing proteases. Other avantages are the possibility to study the amino acids located both sides of the cleavage site as well as the interest to work in a full biological system reflecting protein-protein interaction. A phage substrate library with exhaustive diversity was used prior to CFP-substrate-YFP system to isolate specific human kallikrein 14 substrates. After that the CFP-YFP system was used to sort peptides and identify highly sensitive and specific substrate sequences for hK14. We showed that besides its predictable trypsin-like activity, hK14 also possesses a surprising chymotrypsin-like activity. The screening of the Swissprot database was achieved with the most sensitive sequences and allowed the identification of 6 potential human protein substrates for hK14. Three of them, laminin α-5, collagen IV and matrilin-4, which are components of the extracellular matrix were incubated with hK14, by which they were efficiently hydrolyzed. Moreover, electrophoretic separation revealed that degradation of laminin α-5 and matrilin-4 by hK14 generated fragments with identical molecular size than the predicted N-terminal fragments that would result from hK14 specific cleavage, proving the value of phage display substrate to identify potential substrates. Finally, with site-directed mutagenesis, we transformed two well-known serpins (serine protease inhibitors), AAT and ACT (alpha anti-trypsin and alpha anti-chymotrypsin), which inhibit a vast spectrum of human enzymes into highly efficient and specific hK14 inhibitors. These inhibitors will be used to pursue experiments that could help understand hK14 implication in physiological pathways as well as in cancer biology and also to perform their in vivo evalution as potential cancer treatment.

The roles of PKCδ and Src kinases in the glucocorticoid induction and the TGF-β superinduction of the mouse mammary tumor virus transcription in B lymphocytes

Résumé : Le virus tumoral de la glande mammaire de la souris (MMTV) est un rétrovirus provoquant le développement de tumeurs dans les glandes mammaires des souris susceptibles femelles. Au cours de son évolution, le virus s'est adapté et s'exprime dans des cellules spécialisées. Les lymphocytes B sont les premières cellules infectées et elles sont essentielles pour la propagation de l'infection aux glandes mammaires. Dans notre étude, le virus MMTV a été utilisé afin d'examiner les voies de signalisation induites par les glucocorticoïdes (dexaméthasone (dex), une hormone stéroïdienne) et le transforming growth factor-f3 (TGF-P, une cytokine), deux molécules impliquées dans l'activation de la transcription à partir du promoteur du MMTV dans les cellules B. Le TGF-P seul n'influence pas l'activité du promoteur du MMTV. Par contre, en synergie avec dex, le TGF-P provoque une super-induction de l'expression du promoteur par rapport à une stimulation par le glucocorticoïde seul. Cette super-induction est régulée par une famille de protéines, les Smads. Ainsi, dans les lymphocytes B, l'utilisation du MMTV a permis de mettre en évidence une nouvelle synergie entre les glueocortieoïdes et le TGF-p. pans ce travail, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et de mutants « dominant-négatifs » nous a pet mis de démontrer qu'une Protéine Kinase C delta (PKC5) active est impliquée dans la transduction du signal lors de la réponse au dex ainsi que celle au TGF-P. Néanmoins, la PKC5 est régulée différemment dans chaque voie spécifique : la voie du TGF-p nécessitait l'activation du PKC5 par diacylglycerol (DAG) et la phosphorylation de tyrosines spécifiques, alors que la voie impliquant les glucocorticoïdes ne le nécessitait pas. Nous avons aussi démontré qu'une tyrosine kinase de la famille Src est responsable de la phosphorylation des tyrosines sur la PKC5. Les essais de kinase in vitro nous ont permis de découvrir que plusieurs Src kinases peuvent phosphoryler la PKC6 dans les cellules B et qu'elles étaient constitutivement actives. Enfin, nous avons montré qu'il existe une interaction protéine - protéine induite par dex, entre le récepteur aux glucocorticoïdes (GR) et la PKC5 dans les cellules B, une association qui n'a pas été démontrée auparavant. Par ailleurs, nous avons analysé les domaines d'interactions entre PKC5 et GR en utilisant les essais de «GST pull-down». Nos résultats montrent que le domaine régulateur de la PKC5 et celui qui interagit avec l'ADN du GR sont impliqués. En résumé, nous avons trouvé que dans une lignée lymphocytaire B, le virus MMTV utilise des mécanismes pour réguler à la fois la transcription et la voie de signalisation qui sont différents de ceux utilisés dans les cellules mammaires épithéliales et les fibroblastes. Nos découvertes pourraient être utilisées comme modèles pour l'étude de gènes cellulaires impliqués dans des processus tels qu'inflammation, immunité ou cancérogénèse. Summary: Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) is a retrovirus that causes tumors in the mammary glands of susceptible female mice and has adapted evolutionarily to be expressed in specialized cells. The B lymphocytes are the first cells to be infected by the MMTV and are essential for the spread of infection to the mammary glands. Here, we used the MMTV as a model system to investigate the signalling cascade induced by giucocorticoids (dexamethasone, "dex", a steroid hormone), and by Transforming Growth Factor-beta (TGF-P, a cytokine) leading to its transcriptional activation in B lymphocytes. By itself, TGF-I3 does not affect the basal activity of the MMTV promoter. However, TGF-13 significantly increases glucocorticoid-induced expression, through its effectors, the Smad factors. Thus, MMTV in B cells demonstrates a novel synergism between glucocorticoids and TGF-16. In this thesis project, we present evidence, based on the use of pharmacological inhibitors and of dominant-negative mutants, that an active Protein Kinase C delta (PKC6) is required as a signal transducer for the dex response and for the TGF-P superinduction as well. The PKC6 is differentially regulated in each specific pathway: whereas the TGF-13 superinduction required PKC6 to be activated by diacylglycerol (DAG) and to be phosphorylated at specific tyrosine residues, the glueocorticoid-induced pathway did not. We also showed that a protein tyrosine kinase of the Src family is responsible for the phosphorylation of tyrosines on PKC6. By performing in vitro kinase assays, we found that several Src kinases of B cells were able to phosphorylate PKC6 and that they were constitutively active. Finally, we demonstrate a dex-dependent functional protein-protein interaction between the glucocorticoid receptor (GR) and PKC6 in B cells, an association that has not been previously described. We further analysed the interacting domains of PKG6 and GR using in vitro GST pull-down assays, whereby the regulatory domain of PKC6 and the extended DNA-binding domain of the GR were involved. In summary, we found that in B-lymphoid cell lines, MMTV uses novel mechanisms of transcriptional control and signal transduction that are different from those at work in mammary epithelial or fibroblastic cells. These findings will be used as model for cellular genes involved in cellular processes such as immune functions, inflammation, or oncogenic transformation that may have a similar pattern of regulation.

Microglial reaction induced by noncytotoxic methylmercury treatment leads to neuroprotection via interactions with astrocytes and IL-6 release.

Microglial cells react early to a neurotoxic insult. However, the bioactive factors and the cell-cell interactions leading to microglial activation and finally to a neuroprotective or neurodegenerative outcome remain to be elucidated. Therefore, we analyzed the microglial reaction induced by methylmercury (MeHgCl) using cell cultures of different complexity. Isolated microglia were found to be directly activated by MeHgCl (10(-10) to 10(-6) M), as indicated by process retraction, enhanced lectin staining, and cluster formation. An association of MeHgCl-induced microglial clusters with astrocytes and neurons was observed in three-dimensional cultures. Close proximity was found between the clusters of lectin-stained microglia and astrocytes immunostained for glial fibrillary acidic protein (GFAP), which may facilitate interactions between astrocytes and reactive microglia. In contrast, immunoreactivity for microtubule-associated protein (MAP-2), a neuronal marker, was absent in the vicinity of the microglial clusters. Interactions between astrocytes and microglia were studied in cocultures treated for 10 days with MeHgCl. Interleukin-6 release was increased at 10(-7) M of MeHgCl, whereas it was decreased when each of these two cell types was cultured separately. Moreover, addition of IL-6 to three-dimensional brain cell cultures treated with 3 x 10(-7) M of MeHgCl prevented the decrease in immunostaining of the neuronal markers MAP-2 and neurofilament-M. IL-6 administered to three-dimensional cultures in the absence of MeHgCl caused astrogliosis, as indicated by increased GFAP immunoreactivity. Altogether, these results show that microglial cells are directly activated by MeHgCl and that the interaction between activated microglia and astrocytes can increase local IL-6 release, which may cause astrocyte reactivity and neuroprotection.