Characterising the role of T-cell subsets in experimental allograft rejection and transplantation tolerance

SUMMARY : The recognition by recipient T cells of the allograft major histocompatibility complex (MHC)mismatched antigens is the primary event that ultimately leads to rejection. In the transplantation setting, circulating alloreactive CD4+ T cells play a central role in the initiation and the coordination of the immune response and can initiate the rejection of an allograft via three distinct pathways: the direct, indirect and the recently described semi-direct pathway. However, the exact role of individual CD4+ T-cell subsets in the development of allograft rejection is not clearly defined. Furthermore, besides pathogenic effector T cells, a new subset of T cells with regulatory properties, the CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) cells, has come under increased scrutiny over the last decade. The experiments presented in this thesis were designed to better define the phenotype and functional characteristics of CD4+ T-cell subsets and Treg cells in vitro and in vivo in a marine adoptive transfer and skin transplantation model. As Treg cells play a key role in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance, we have explored whether donor-antigen specific Treg cells could be expanded in vitro. Here we describe a robust protocol for the ex-vivo generation and expansion of antigen-specific Treg cells, without loss of their characteristic phenotype and suppressive function. In our in vivo transplantation model, antigen-specific Treg cells induced donor-specific tolerance to skin allografts in lymphopenic recipients and significantly delayed skin graft rejection in wild-type mice in the absence of any other immunosuppression. Naïve and memory CD4+ T cells have distinct phenotypes, effector functions and in vivo homeostatsis, and thus may play different roles in anti-donor immunity after transplantation. We have analyzed in vitro and in vivo primary alloresponses of naïve and cross-reactive memory CD4+ T cells. We found that the CD4+CD45RBlo memory T-cell pool was heterogeneous and contained cells with regulatory potentials, both in the CD4+CD25+ and CD4+CD25- populations. CD4+ T cells capable of inducing strong primary alloreactive responses in vitro and rejection of a first allograft in vivo were mainly contained within the CD45RBhi naïve CD4+ T-cell compartment. Taken together, the work described in this thesis provides new insights into the mechanisms that drive allograft rejection or donor-specific transplantation tolerance. These results will help to optimise current clinical immunosuppressive regimens used after solid organ transplantation and design new immunotherapeutic strategies to prevent transplant rejection. RÉSUMÉ : ROLE DES SOUS-POPULATIONS DE CELLULES T DANS LE REJET DE GREFFE ET L'INDUCTION DE TOLERANCE EN TRANSPLANTATION La reconnaissance par les cellules T du receveur des alloantigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMIT) présentés par une greffe allogénique, est le premier événement qui aboutira au rejet de l'organe greffé. Dans le contexte d'une transplantation, les cellules alloréactives T CD4+ circulantes jouent un rôle central dans l'initiation et la coordination de 1a réponse immune, et peuvent initier le rejet par 3 voies distinctes : la voie directe, indirecte et la voie servi-directe, plus récemment décrite. Toutefois, le rôle exact des sous-populations de cellules T CD4+ dans les différentes étapes menant au rejet d'une allogreffe n'est pas clairement établi. Par ailleurs, hormis les cellules T effectrices pathogéniques, une sous-population de cellules T ayant des propriétés régulatrices, les cellules T CD4+CD25+Foxp3+ (Treg), a été nouvellement décrite et est intensément étudiée depuis environ dix ans. Les expériences présentées dans cette thèse ont été planifiées afin de mieux définir le phénotype et les caractéristiques fonctionnels des sous-populations de cellules T CD4+ et des Treg in vitro et in vivo dans un modèle marin de transfert adoptif de cellules et de transplantation de peau. Comme les cellules Treg jouent un rôle clé dans l'induction et le maintien de la tolérance périphérique en transplantation, nous avons investigué la possibilité de multiplier in vitro des cellules Treg avec spécificité antigénique pour le donneur. Nous décrivons ici un protocole reproductible pour la génération et l'expansion ex-vivo de cellules Treg avec spécificité antigénique, sans perte de leur phénotype caractéristique et de leur fonction suppressive. Dans notre modèle in vivo de transplantation de peau, ces cellules Treg pouvaient induire une tolérance spécifique vis-à-vis du donneur chez des souris lymphopéniques, et, chez des souris normales non-lymphopéniques ces Treg ont permis de retarder significativement le rejet en l'absence de tout traitement immunosuppresseur. Les cellules T CD4+ naïves et mémoires se distinguent par leur phénotype, fonction effectrice et leur homéostasie in vivo, et peuvent donc moduler différemment la réponse immune contre le donneur après transplantation. Nous avons analysé in vitro et in vivo les réponses allogéniques primaires de cellules T CD4+ naïves et mémoires non-spécifiques (cross-réactives). Nos résultats ont montré que le pool de cellules T CD4+CD45RB'° mémoires était hétérogène et contenait des cellules avec un potentiel régulateur, aussi bien parmi la sous-population de cellules CD4+CD25+ que CD4+CD25+. Les cellules T CD4+ capables d'induire une alloréponse primaire intense in vitro et le rejet d'une première allogreffe in vivo étaient essentiellement contenues dans le pool de cellules T CD4+CD45RBhi naïves. En conclusion, le travail décrit dans cette thèse amène un nouvel éclairage sur les mécanismes responsables du rejet d'une allogreffe ou de l'induction de tolérance en transplantation. Ces résultats permettront d'optimaliser les traitements immunosuppresseurs utilisés en transplantation clinique et de concevoir des nouvelles stratégies irnmuno-thérapeutiques pour prévenir le rejet de greffe allogénique.

CD4+CD25+ T cell depletion impairs tolerance induction in a murine model of asthma.

BACKGROUND: Regulatory T cells (Tregs) are key players in controlling the development of airway inflammation. However, their role in the mechanisms leading to tolerance in established allergic asthma is unclear. OBJECTIVE: To examine the role of Tregs in tolerance induction in a murine model of asthma. METHODS: Ovalbumin (OVA) sensitized asthmatic mice were depleted or not of CD25(+) T cells by anti-CD25 PC61 monoclonal antibody (mAb) before intranasal treatment (INT) with OVA, then challenged with OVA aerosol. To further evaluate the respective regulatory activity of CD4(+)CD25(+) and CD4(+)CD25(-) T cells, both T cell subsets were transferred from tolerized or non-tolerized animals to asthmatic recipients. Bronchoalveolar lavage fluid (BALF), T cell proliferation and cytokine secretion were examined. RESULTS: Intranasal treatment with OVA led to increased levels of IL-10, TGF-beta and IL-17 in lung homogenates, inhibition of eosinophil recruitment into the BALF and antigen specific T cell hyporesponsiveness. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells were markedly upregulated in lungs and suppressed in vitro and in vivo OVA-specific T cell responses. Depletion of CD25(+) cells before OVA INT severely hampered tolerance induction as indicated by a strong recruitment of eosinophils into BALF and a vigorous T cell response to OVA upon challenge. However, the transfer of CD4(+)CD25(-) T cells not only suppressed antigen specific T cell responsiveness but also significantly reduced eosinophil recruitment as opposed to CD4(+)CD25(+) T cells. As compared with control mice, a significantly higher proportion of CD4(+)CD25(-) T cells from OVA treated mice expressed mTGF-beta. CONCLUSION: Both CD4(+)CD25(+) and CD4(+)CD25(-) T cells appear to be essential to tolerance induction. The relationship between both subsets and the mechanisms of their regulatory activity will have to be further analyzed.

Role of CD4+CD25+ regulatory T cells in the antigen specific induction of tolerance "via" the nasal route

ABSTRACT Asthma is a complex inflammatory syndrome caused by environmental factors in predisposed individuals (atopics). Its severity correlates with the presence of activated T lymphocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Induction of tolerance via the nasal route results in reduced recruitment of eosinophils into BALF upon challenge, inhibition of TH2 pro-inflammatory cytokine secretion and T cell hyporesponsiveness. Recently, CD4+CD25+ natural regulatory T cells (Treg) were proposed as key players in controlling the development of asthma and allergic disease. The objective of the present study is to investigate the role of CD4+CD25+ regulatory T cells in the mechanisms leading to tolerance in an established model of asthma. In this goal we depleted CD4+CD25+ T cells at different times during asthma and tolerance induction protocol in mice and looked at efficiency of tolerization (intranasal application of high dose of allergen) in the absence of natural Tregs. First, ovalbumin-sensitized mice were depleted of CD25+ T cells by intraperitoneal injection of anti-CD25 mAb (PC61) either for along-term (repeated injections of anti-CD25 from day 31 until the end of the protocol) or a short-term period (single injection of anti-CD25 before or after tolerance induction). We demonstrated that the long-term depletion of CD4+CD25+ T cells severely hampered tolerance induction (marked enhancement in eosinophil recruitment into BALF and a vigorous antigen specific T cell response to OVA upon allergen challenge) whereas transient depletions were not sufficient to do so. We then characterized T cell subsets by flow cytometry and observed that a large part of CD4+CD25+ T cells express Foxp3, an established marker of regulatory T cells. We also tested in-vitro suppressor activity of CD4+CD25+ T cells from tolerized mice by cell proliferation assay in coculture and observed a strong suppressive activity. Our data suggest that CD4+CD25+ T cells with regulatory properties play a crucial role in the induction of tolerance via the nasal route. The relationship between CD25+ natural Treg and inducible IL-10+ TRl-type Treg will have to be defined. RESUME L'asthme est un syndrome inflammatoire complexe provoqué par des facteurs environnementaux chez des individus génétiquement prédisposés (atopiques). Sa sévérité corrèle avec la présence des lymphocytes T activés et d'éosinophiles dans le lavage bronchoalvéolaire (BAL). L'induction de la tolérance par la voie nasale résulte en une diminution du recrutement des eosinophils dans le BAL, une inhibition de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires de type TH2 et de l'hypo-réponse des cellules T à l'allergène. Récemment, les cellules régulatrices «naturelles » de type CD4+CD25+ T (Tregs) ont été proposées comme acteurs essentiels dans le développement de l'asthme et de l'allergie. L'objectif de cette étude est d'étudier le rôle des cellules régulatrices CD4+CD25+ T dans les mécanismes menant à la tolérance dans un modèle établi d'asthme. Dans ce but nous avons déplété les cellules de CD4+CD25+ T à différents temps au cours du protocole d'induction d'asthme et de tolérance et nous avons regardé l'efficacité de l'induction de tolérance (application intranasale d'une dose importante d'allergène) en l'absence de Tregs. Dans un premier temps des souris sensibilisées à l'ovalbumine (OVA) ont été déplétées en cellules CD25+ T par l'injection intrapéritonéale d'anti-CD25 mAb (PC61) pour une longue période (injections répétées d'anti-CD25 du jour 31 jusqu'à la fin du protocole) ou pour une courte période (injection unique d'anti-CD25 avant ou après l'induction de tolérance). Nous avons démontré que la déplétion à long t erme des cellules de CD4+CD25+ T a empêché l'induction de tolérance (recrutement accru d'éosinophiles dans le BAL et une réponse vigoureuse des cellules T spécifiques de l'antigène après exposition à l'allergène) tandis des déplétions à court-terme n'ont pas cet effet. Nous avons ensuite caractérisé des sous-populations de cellules T par cytométrie de flux. Nous avons observé que la majorité des cellules CD4+CD25+ T expriment Foxp3, un marqueur établi des cellules régulatrices. Nous avons également examiné in vitro l'activité régulatrice des cellules T CD4+CD25+ issues de souris tolérisées. La prolifération de cellules T en coculture a démontré une forte activité suppressive des cellules CD4+CD25+. Nos données suggèrent que des cellules T CD4+CD25+ ayant des propriétés régulatrices jouent un rôle crucial dans l'induction de la tolérance par la voie nasale. Le rapport entre les cellules régulatrices naturelles CD4+CD25+ et les cellules régulatrices inductible de type TR1 I1-10+ devra être défini. RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC L'asthme est une maladie inflammatoire des bronches, caractérisée par des crises de dyspnée (gêne respiratoire) témoignant d'une activation brutale des muscles bronchoconstricteurs, auxquelles s'associent un oedème et une hypersécrétion des muqueuses des voies aériennes ainsi qu'une importante production d'anticorps de l'allergie (IgE). Chez la plupart des enfants atteints et chez près de la moitié des adultes concernés par l'asthme, c'est une allergie à des substances présentes dans l'air environnant (acariens, pollens ou poils d'animaux) qui est à l'origine de la maladie. . Le traitement actuel de l'asthme repose d'une part sur le soulagement des symptômes grâce à des produits à base de stéroïdes ou des bronchodilatateurs. D'autre part, l'immunothérapie spécifique (aussi appelée désensibilisation) permet d'améliorer l'asthme et de «reprogrammer» le système immunitaire. C'est à ce jour, le seul moyen connu de faire régresser une allergie. Cependant l'immunothérapie prend beaucoup de temps (3 à 5 ans) et ne marche pas à tous les coups ni pour tous les antigènes. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes impliqués lors d'un tel traitement afin d'en améliorer l'efficacité. Af n de pouvoir investiguer en détail ces mécanismes des modèles d'immunothérapie ont été mis au point chez la souris. Notre étude se base sur un modèle d'asthme allergique chez la souris. Des souris sont rendues allergiques à l'ovalbumine (OVA) et présentent alors les caractéristiques majeures de l'asthme humain (recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons, augmentation de la production d'IgE et de la résistance des bronches aux flux respiratoires). Ces souris asthmatiques une fois traitées par l'application nasale d'OVA (forme d'immunothérapie muqueuse) ne développent plus de réaction allergique lors d'une ré-exposition à l'allergène. Notre hypothèse est que cette «guérison» (tolérance) est liée à l'action de cellules (lymphocytes T CD4) dites «régulatrices» et caractérisées par le marqueur CD25. Pour le démontrer, nous avons éliminé ces cellules «régulatrices» CD25 de nos souris asthmatiques grâce à un anticorps monoclonal spécifique. Nous n'avons dès lors plus été en mesure d'induire une tolérance à l'allergène. Ceci suggère donc un rôle clé des cellules «régulatrices» T CD4+CD25+ dans la réussite de l'immunothérapie nasale dans notre modèle. Nos résultats n'excluent pas la participation d'autres cellules telles que les lymphocytes producteurs d'IL-10 (lymphocytes régulateurs induits). Le rôle respectif de ces sous-populations régulatrices devra être examiné dans les études à venir. Une meilleure maîtrise des mécanismes de régulation pourrait s'avérer cruciale pour améliorer les thérapies de l'asthme.

Increased interleukin-10 production by ASC-deficient CD4(+) T cells impairs bystander T-cell proliferation.

Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) is an important component of the inflammasome, functioning as an adaptor protein that facilitates the recruitment and activation of procaspases that in turn promote the maturation of interleukin-1β (IL-1β) and IL-18. Despite initial focus on the inflammatory properties of ASC there is emerging evidence that highlights the importance of ASC in facilitating adaptive immune responses. However, the cellular and molecular basis for the involvement of ASC in adaptive immunity remains largely unexplored. We have previously demonstrated that activated ASC-deficient T cells have dampened proliferative responses. We have therefore explored the underlying cellular mechanism(s) by which ASC regulates T-cell proliferation. We show that under activating conditions (anti-CD3/CD28 stimulation) in bulk T-cell cultures the presence of ASC(-/-)  CD4(+) T cells is sufficient to suppress the proliferative responses of neighbouring T cells. Furthermore, ASC(-/-)  CD4(+) T cells upon activation exhibit a suppressive cytokine profile, with elevated production of IL-10 and reduced secretion of T helper type 1 cytokines, interferon-γ and IL-2. This increase in IL-10 secretion within the activated ASC(-/-)  CD4(+) T-cell compartment was not associated with a proportional increase in conventional Foxp3(+) regulatory T (Treg) cells. Interestingly, when equal numbers of fluorescence-activated cell sorted ASC(+/+) and ASC(-/-) Treg cells (CD4(+)  CD44(intermediate/high)  CD25(+) ) were activated in vitro, the ASC(-/-) fraction produced significantly more IL-10 than their wild-type counterparts, suggesting that ASC(-/-) Treg cells have greater suppressive capacity. Collectively, these results imply that the ASC may influence the development and functioning of Treg cells.

The presence of a CD4(+) CD25(high) CD45RO(+) CD127(high) T cell population correlates with the clinical status of kidney transplant recipients

Introduction: Recent data have suggested that a population of CD4+ CD25high T cells, phenotypically characterized by the expression of CD45RO and CD127, is significantly expanded in stable liver and kidney transplant recipients and represents alloreactive T cells. We analyzed this putative new alloreactive cellular marker in various groups of kidney transplant recipients. Patients & methods: Flow cytometry was used to analyze the expression of CD25, CD45RO and CD127 on peripheral CD4+ T cells. Of 73 kidney transplant recipients, 59 had a stable graft function under standard immunosuppressive therapy (IS), 5 had biopsy-proven chronic humoral rejection (CHR), 8 were stable under minimal IS and one was an operationally "tolerant" patient who had discontinued IS for more than 3 years. Sixty-six healthy subjects (HS) were studied as controls. Results: Overall, the alloreactive T cell population was found to be significantly increased in the 73 kidney recipients (mean ± SE: 15.03 ± 1.04% of CD4+ CD25high T cells) compared to HS (5.93 ± 0.39%) (p<0.001). In the 5 patients with CHR, this population was highly expanded (31.33 ± 4.16%), whereas it was comparable to HS in the 8 stable recipients receiving minimal IS (6.12 ± 0.86%), in 4 patients who had been switched to sirolimus (4.21 ± 0.53%) as well as in the unique "tolerant" recipient (4.69%). Intermediate levels (15.84 ± 0.93%) were found in the 55 recipients with stable graft function on standard CNI-based IS. Regulatory T cells, defined as CD4+CD25high FoxP3+ CD127low, were found to be significantly reduced in all recipients except in those with minimal or no IS, and this reduction was particularly striking in recipients with CHR. Conclusion: After kidney transplantation, an alloreactive T cell population was found to be significantly expanded and it correlates with the clinical status of the recipients. Interestingly, in stable patients with minimal (or no) IS as well as in patients on sirolimus, alloreactive T cells were comparable the healthy controls. Measuring circulating CD4+CD25high CD45RO+ CD127high T cells may become a useful monitoring tool after transplantation.

Between Immunology And Tolerance: Controlling Immune Responses Employing Tolerogenic Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most efficient antigen presenting cells, they provide co-stimulation, are able to secrete various proinflammatory cytokines and therefore play a pivotal role in shaping adaptive immune responses. Moreover, they are important for the promotion and maintenance of central and peripheral tolerance through several mechanisms like the induction of anergy or apoptosis in effector T cells or by promoting regulatory T cells. The murine CD8α+ (MuTu) dendritic cell line was previously derived and described in our laboratory. The MuTu cell line has been shown to maintain phenotypical and functional characteristics of endogenous CD8α+ DCs. They are able to cross-present exogenous antigens to CD8+ T cells and produce interleukin (IL-) 12 upon engagement of Toll like receptors. The cell line constitutes an infinite source of homogenous, phenotypically well-defined dendritic cells. This allows us to investigate the role and potential of specific molecules in the induction as well as regulation of immune responses by DCs in a rational and standardized way. In a first project the MuTu dendritic cell line was transduced in order to stably express the immunosuppressive molecules IL-10, IL-35 or the active form of TGF-β (termed IL-10+DC, IL-35+DC or actTGFβ+DC). We investigated the capability of these potentially suppressive or tolerogenic dendritic cell lines to induce immune tolerance and explore the mechanisms behind tolerance induction. The expression of TGF-β by the DC line did not affect the phenotype of the DCs itself. In contrast, IL-10+ and IL-35+DCs were found to exhibit lower expression of co-stimulatory molecules and MHC class I and II, as well as reduced secretion of pro-inflammatory cytokines upon activation. In vitro co-culture with IL-35+, IL10+ or active TGFβ+ DCs interfered with function and proliferation of CD4+ and CD8+ T cells. Furthermore, IL-35 and active TGF-β expressing DC lines induced regulatory phenotype on CD4+ T cells in vitro without or with expression of Foxp3, respectively. In different murine cancer models, vaccination with IL-35 or active TGF-β expressing DCs resulted in faster tumor growth. Interestingly, accelerated tumor growth could be observed when IL-35-expressing DCs were injected into T cell-deficient RAG-/- mice. IL-10expressing DCs however, were found to rather delay tumor growth. Besides the mentioned autocrine effects of IL-35 expression on the DC line itself, we surprisingly observed that the expression of IL-35 or the addition of IL-35 containing medium enhances neutrophil survival and induces proliferation of endothelial cells. Our findings indicate that the cytokine IL-35 might not only be a potent regulator of adaptive immune responses, but it also implies IL-35 to mediate diverse effects on an array of cellular targets. This abilities make IL-35 a promising target molecule not only for the treatment of auto-inflammatory disease but also to improve anti-cancer immunotherapies. Indeed, by applying active TGFβ+ in murine autoimmune encephalitis we were able to completely inhibit the development of the disease, whereas IL-35+DCs reduced disease incidence and severity. Furthermore, the preventive transfer of IL-35+DCs delayed rejection of transplanted skin to the same extend as the combination of IL-10/actTGF-β expressing DCs. Thus, the expression of a single tolerogenic molecule can be sufficient to interfere with the adequate activation and function of dendritic cells and of co-cultured T lymphocytes. The respective mechanisms of tolerance induction seem to be different for each of the investigated molecule. The application of a combination of multiple tolerogenic molecules might therefore evoke synergistic effects in order to overcome (auto-) immunity. In a second project we tried to improve the immunogenicity of dendritic cell-based cancer vaccines using two different approaches. First, the C57BL/6 derived MuTu dendritic cell line was genetically modified in order to express the MHC class I molecule H-2Kd. We hypothesized that the expression of BALB/c specific MHC class I haplotype (H-2Kd) should allow the priming of tumor-specific CD8+ T cells by the otherwise allogeneic dendritic cells. At the same time, the transfer of these H-2Kd+ DCs into BALB/c mice was thought to evoke a strong inflammatory environment that might act as an "adjuvant", helping to overcome tumor induced immune suppression. Using this so called "semi-allogeneic" vaccination approach, we could demonstrate that the delivery of tumor lysate pulsed H-2Kd+ DCs significantly delayed tumor growth when compared to autologous or allogeneic vaccination. However, we were not able to coherently elucidate the cellular mechanisms underlying the observed effect. Second, we generated MuTu DC lines which stably express the pro-inflammatory cytokines IL-2, IL-12 or IL-15. We investigated whether the combination of DC vaccination and local delivery of pro-inflammatory cytokines might enhance tumor specific T cell responses. Indeed, we observed an enhanced T cell proliferation and activation when they were cocultured in vitro with IL-12 or IL-2-expressing DCs. But unfortunately we could not observe a beneficial or even synergistic impact on tumor development when cytokine delivery was combined with semi-allogeneic DC vaccination.

CD103 marks a subset of human CD34(+)-derived langerin(+) dendritic cells that induce T-regulatory cells via indoleamine 2,3-dioxygenase-1.

Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) is an immunosuppressive molecule expressed in some subsets of normal and neoplastic cells. Mature human dendritic cells (DCs) have been shown to express IDO1, but little is known about its expression and function during DC differentiation from bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). Here, we show that during in vitro differentiation along the myeloid DC lineage, CD34(+) HSPCs acquire IDO1 expression, which acts in a tolerogenic manner by inducing a population of fully functional CD4(+)CD25(+) FOXP3(+) T-regulatory cells. Phenotypically, CD1a(+)CD14(-) HPSC-derived DCs expressed IDO1, langerin, CD11b, and CD1c. Cell-sorting experiments demonstrated that IDO1 expression is found in a subset of CD1a(+)CD14(-)langerin(+) cells, expressing CD103, which is capable of inducing T-regulatory cells in an IDO1-dependent manner. In conclusion, DC differentiation from CD34(+) HSPCs results in the expression of a functionally active IDO1 protein in CD1a(+)langerin(+), CD103-expressing DCs. These data point toward IDO1 expression as part of a tolerogenic signature during DC development.

T cells at the site of autoimmune inflammation show increased potential for trogocytosis

Les lymphocytes T CD4+ sont connus pour leur potentiel d'acquisition de fragments membraneux de cellules présentatrices d'antigène (CPA) dans un processus nommé trogocytose. Ce phénomène est observé lors de l'interaction entre le lymphocyte T CD4+ antigène-spécifique et la CPA lors de la présentation de l'antigène en question, et dépend donc de la spécificité du lymphocyte T CD4+. L'identification des lymphocytes T CD4+ sujets à la trogocytose en co-culture avec des CPA chargées d'un antigène connu permet d'enrichir des lymphocytes T antigène-spécifiques sans connaître leur spécificité exacte ou leur profil de production de cytokines. Dans cette étude, nous avons donc cherché à évaluer l'utilité de cette méthode dans l'identification de la spécificité des lymphocytes T effecteurs et régulateurs lors de l'inflammation auto-immune avec des spécificités souvent inconnues. La trogocytose a démontré son efficacité dans la détection de lymphocytes T réactifs à la protéine basique de myéline in vitro ainsi qu'ex vivo après immunisation. Cependant, le potentiel de la trogocytose à identifier des lymphocytes T régulateurs antigène-spécifiques est limité par le fait que les lymphocytes T régulateurs Foxp3+ montrent un taux élevé de manière constitutive de trogocytose comparé aux lymphocytes T Foxp3-, Un taux localement élevé de trogocytose lors d'un état inflammatoire (observé au niveau des lymphocytes T effecteurs et régulateurs isolés du système nerveux central enflammé) empêche l'utilisation de la trogocytose dans l'évaluation de la réactivité antigénique de cellules extraites d'un site inflammatoire. Nos résultats montrent la possibilité d'enrichir des lymphocytes T conventionnels antigène- réactifs en périphérie par détection au moyen de la trogocytose. Nous avons aussi montré les limitations de cette méthode dans sa capacité d'identifier des lymphocytes T effecteurs et régulateurs antigène- réactifs extraits de sites inflammatoires. Le potentiel de trogocytose élevé dans les sites d'inflammation soulève la question de la signification biologique de ce phénomène dans l'inflammation, dans la suppression médiée par les lymphocytes T régulateurs et dans le maintien de la tolérance immunologique dans des états de santé variables.

The Human Mesenchymal Stromal Cell-Derived Osteocyte Capacity to Modulate Dendritic Cell Functions Is Strictly Dependent on the Culture System.

In vitro differentiation of mesenchymal stromal cells (MSC) into osteocytes (human differentiated osteogenic cells, hDOC) before implantation has been proposed to optimize bone regeneration. However, a deep characterization of the immunological properties of DOC, including their effect on dendritic cell (DC) function, is not available. DOC can be used either as cellular suspension (detached, Det-DOC) or as adherent cells implanted on scaffolds (adherent, Adh-DOC). By mimicking in vitro these two different routes of administration, we show that both Det-DOC and Adh-DOC can modulate DC functions. Specifically, the weak downregulation of CD80 and CD86 caused by Det-DOC on DC surface results in a weak modulation of DC functions, which indeed retain a high capacity to induce T-cell proliferation and to generate CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Moreover, Det-DOC enhance the DC capacity to differentiate CD4(+)CD161(+)CD196(+) Th17-cells by upregulating IL-6 secretion. Conversely, Adh-DOC strongly suppress DC functions by a profound downregulation of CD80 and CD86 on DC as well as by the inhibition of TGF-β production. In conclusion, we demonstrate that different types of DOC cell preparation may have a different impact on the modulation of the host immune system. This finding may have relevant implications for the design of cell-based tissue-engineering strategies.

Additive effects of rapamycin and aspirin on dendritic cell allostimulatory capacity.

Acting as antigen presenting cells, mature dendritic cells (DCs) initiate both innate and adaptive alloimmune responses. However, immature DCs are weak immunostimulators and mediate tolerogenic effects under certain conditions. Tolerogenic activities of immature DCs can be enhanced by pharmacological agents. Here, we compared pharmacological DC preconditioning with rapamycin and aspirin, applied alone or in combination, on LPS-induced DC maturation and T-cell allostimulatory capacity. Preconditioning with aspirin but not rapamycin tended to reduce the number of mouse bone marrow-derived immature DCs expressing CD40 and major histocompatibility complex class II molecules upon LPS stimulation. Conversely, DC preconditioning with rapamycin, but not aspirin, reduced T-cell alloproliferative responses. A combination of rapamycin and aspirin was more effective than either drug applied alone with respect to inhibition of T-cell alloproliferation. The two agents in combination reduced numbers of CD4(+)IFN-γ(+) Th1 and CD4(+)IL-17(+) Th17 effector cells while maintaining Foxp3(+) regulatory T cells. These results suggest aspirin may moderately enhance rapamycin-mediated inhibition of DC allostimulatory capacity.

Optimisation d'une approche pour l'analyse de l'expression de gènes au niveau unicellulaire chez des sous-populations spécialisées de lymphocytes T CD4+ humaines

Chez les patients cancéreux, les cellules malignes sont souvent reconnues et détruites par les cellules T cytotoxiques du patient. C'est pourquoi, depuis plusieurs années, des recherches visent à produire des vaccins sensibilisant les cellules de l'immunité adaptative, afin de prévenir certains cancers. Bien que les vaccins ciblant les cellules T CD8+ (cytotoxiques) ont une efficacité in-vitro élevée, un vaccin pouvant cibler les cellules T CD8+ et CD4+ aurait une plus grande efficacité (1-3). En effet, les cellules T helper (CD4+) favorisent la production et la maintenance des cellules T CD8+ mémoires à longue durée de vie. Il existe un grand nombre de sous-types de cellules T CD4+ et leur action envers les cellules cancéreuses est différente. Par exemple, les lymphocytes Treg ont une activité pro-tumorale importante (4) et les lymphocytes Th1 ont une activité anti-tumorale (5). Cependant, le taux naturel des différents sous-types de cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux est variable. De plus, une certaine flexibilité des différents sous-types de cellules T CD4+ a été récemment démontrée (6). Celle-ci pourrait être ciblée par des protocoles de vaccination avec des antigènes tumoraux administrés conjointement à des adjuvants définis. Pour cela, il faut approfondir les connaissances sur le rôle des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes dans l'immunité anti-tumorale et connaître précisément la proportion des sous-types de cellules T CD4+ activées avant et après la vaccination. L'analyse des cellules T, par la cytométrie de flux, est très souvent limité par le besoin d'un nombre très élevé de cellules pour l'analyse de l'expression protéique. Or dans l'analyse des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux cette technique n'est souvent pas applicable, car ces cellules sont présentes en très faible quantité dans le sang et dans les tissus tumoraux. C'est pourquoi, une approche basée sur l'analyse de la cellule T individuelle a été mise en place afin d'étudier l'expression du profil génétique des cellules T CD8+ et CD4+. (7,8) Méthode : Ce nouveau protocole (« single cell ») a été élaboré à partir d'une modification du protocole PCR-RT, qui permet la détection spécifique de l'ADN complémentaire (ADNc) après la transcription globale de l'ARN messager (ARNm) exprimé par une cellule T individuelle. Dans ce travail, nous optimisons cette nouvelle technique d'analyse pour les cellules T CD4+, en sélectionnant les meilleures amorces. Tout d'abord, des clones à profils fonctionnels connus sont générés par cytométrie de flux à partir de cellules T CD4+ d'un donneur sain. Pour cette étape d'optimisation des amorces, la spécificité des cellules T CD4+ n'est pas prise en considération. Il est, donc, possible d'étudier et de trier ces clones par cytométrie de flux. Ensuite, grâce au protocole « single cell », nous testons par PCR les amorces des différents facteurs spécifiques de chaque sous-type des T CD4+ sur des aliquotes issus d'une cellule provenant des clones générés. Nous sélectionnons les amorces dont la sensibilité, la spécificité ainsi que les valeurs prédictives positives et négatives des tests sont les meilleures. (9) Conclusion : Durant ce travail nous avons généré de l'ADNc de cellules T individuelles et sélectionné douze paires d'amorces pour l'identification des sous-types de cellules T CD4+ par la technique d'analyse PCR « single cell ». Les facteurs spécifiques aux cellules Th2 : IL-4, IL-5, IL-13, CRTh2, GATA3 ; les facteurs spécifiques aux cellules Th1 : TNFα, IL-2 ; les facteurs spécifiques aux cellules Treg : FOXP3, IL-2RA ; les facteurs spécifiques aux cellules Th17 : RORC, CCR6 et un facteur spécifique aux cellules naïves : CCR7. Ces amorces peuvent être utilisées dans le futur en combinaison avec des cellules antigènes-spécifiques triées par marquage des multimères pMHCII. Cette méthode permettra de comprendre le rôle ainsi que l'amplitude et la diversité fonctionnelle de la réponse de la cellule T CD4+ antigène-spécifique dans les cancers et dans d'autres maladies. Cela afin d'affiner les recherches en immunothérapie oncologique. (8)