The role of the microRNAs in the age-associated oancreatic β-cell dysfunction

Le corps humain emploie le glucose comme source principale d'énergie. L'insuline, sécrétée par les cellules ß-pancreatiques situées dans les îlots de Langerhans, est l'hormone principale assurant un maintien constant du taux de glucose sanguin (glycémie). Les prédispositions génétiques, le manque d'activité physique et un régime déséquilibré peuvent entraîner une perte de sensibilité à l'insuline et des taux de glucose dans le sang élevé (hyperglycémie), une condition nommée diabète de type 2. Cette maladie est initiée par une sensibilité diminuée à l'insuline dans les tissus périphériques, entraînant une demande accrue en insuline. Cette pression continue finie par épuiser les cellules ß-pancreatiques, qui sécrètent alors des niveaux d'insuline insuffisant en trainant l'apparition du diabète. Le vieillissement est un facteur de risque important pour les maladies métaboliques dont le diabète de type 2 faits partis. En effet la majeure partie des diabétiques de type 2 ont plus de 45 ans. Il est connu que le vieillissement entraine une perte de sensibilité à l'insuline, une sécrétion altérée d'insuline, une baisse de réplication et une plus grande mort des ß-cellules pancréatiques. Le but de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes contribuante au dysfonctionnement des cellules ß- pancréatiques lors du vieillissement. Les travaux du « Human Genome Project » ont révélés que seulement 2% de notre génome code pour des protéines. Le reste non-codant fut alors désigné sous le nom de « ADN déchets ». Cependant, l'étude approfondie de cet ADN non-codant ces dernières deux décennies a démontré qu'une grande partie code pour des «MicroARNs », des ARNs courts (20-22 nucleotides) découverts en 1997 chez le vers C.elegans. Depuis lors ces molécules ont été intensivement étudiées, révélant un rôle crucial de ces molécules dans la fonction et la survie des cellules en conditions normales et pathologiques. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Nos données suggèrent qu'ils peuvent jouer un rôle tantôt salutaire, tantôt nocif sur les cellules ß. Par exemple, certains microARNs réduisent la capacité des cellules ß à se multiplier ou réduisent leur survie, alors que d'autres protègent ces cellules contre la mort. Pour conclure, nous avons démontré les microARNs jouent un rôle important dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Ces nouvelles découvertes préparent le terrain pour la conception de futures stratégies visant à améliorer la résistance des cellules ß pancréatiques afin de trouver de nouveaux traitements du diabète de type 2. -- Le diabète de type 2 est une maladie métabolique due à la résistance à l'action de l'insuline des tissus cibles combinée à l'incapacité des cellules ß pancréatiques à sécréter les niveaux adéquats d'insuline. Le vieillissement est associé à un déclin global des fonctions de l'organisme incluant une diminution de la fonction et du renouvellement des cellules ß pancréatiques. Il constitue ainsi un risque majeur de développement des maladies métaboliques dont le diabète de type 2. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs (une classe d'ARN non- codants) dans le dysfonctionnement lié au vieillissement des cellules ß. L'analyse par microarray des niveaux d'expression des microARN dans les îlots pancréatiques de rats Wistar mâles âgés de 3 et 12 mois nous a permis d'identifier de nombreux changements d'expression de microARNs associés au vieillissement. Afin d'étudier les liens entre ces modifications et le déclin des cellules ß, les changements observés lors du vieillissement ont été reproduits spécifiquement dans une lignée cellulaire, dans des cellules ß primaires de jeune rats ou de donneurs humains sains. La diminution du miR-181a réduit la prolifération des cellules ß, tandis que la diminution du miR-130b ou l'augmentation du miR-383 protège contre l'apoptose induite par les cytokines. L'augmentation du miR-34a induit l'apoptose et inhibe la prolifération des cellules ß en réponse aux hormones Exendin-4 et prolactine et au facteur de croissance PDGF-AA. Cette perte de capacité réplicative est similaire à celle observée dans des cellules ß de rats âgés de 12 mois. Dans la littérature, la perte du récepteur au PDGF-r-a est associée à la diminution de la capacité proliférative des cellules ß observée lors du vieillissement. Nous avons pu démontrer que PDGF-r-a est une cible directe de miR- 34a, suggérant que l'effet néfaste de miR-34a sur la prolifération des cellules ß est, du moins en partie, lié à l'inhibition de l'expression de PDGF-r-a. L'expression de ce miR est aussi plus élevée dans le foie et le cerveau des animaux de 1 an et augmente avec l'âge dans les ilôts de donneurs non-diabétiques. Ces résultats suggèrent que miR-34a pourrait être non seulement impliqué dans l'affaiblissement des fonctions pancréatiques associé à l'âge, mais également jouer un rôle dans les tissus cibles de l'insuline et ainsi contribuer au vieillissement de l'organisme en général. Pour conclure, les travaux obtenus durant cette thèse suggèrent que des microARNs sont impliqués dans le dysfonctionnement des cellules ß pancréatiques durant le vieillissement. -- Type 2 diabetes is a metabolic disease characterized by impaired glucose tolerance, of the insulin sensitive tissues and insufficient insulin secretion from the pancreatic ß-cells to sustain the organism demand. Aging is a risk factor for the majority of the metabolic diseases including type 2 diabetes. With aging is observed a decline in all body function, due to decrease both in cell efficiency and renewal. The aim of this thesis was to investigate the potential role of microRNAs (short non- coding RNAs) in the pancreatic ß-cell dysfunction associated with aging. Microarray analysis of microRNA expression profile in pancreatic islets from 3 and 12 month old Wistar male rats revealed important changes in several microRNAs. To further study the link between those alterations and the decline of ß-cells, the changes observed in old rats were mimicked in immortalized ß-cell lines, primary young rat and human islets. Downregulation of miR-181a inhibited pancreatic ß-cell proliferation in response to proliferative drugs, whereas downregulation of miR-130b and upregulation of miR-383 protected pancreatic ß-cells from cytokine stimulated apoptosis. Interestingly, miR-34a augmented pancreatic ß-cell apoptosis and inhibited ß-cell proliferation in response to the proliferative chemicals Exendin-4, prolactin and PDGF-AA. This loss of replicative capacity is reminiscent of what we observed in pancreatic ß-cells isolated from 12 month old rats. We further observed a correlation between the inhibitory effect of miR-34a on pancreatic ß-cell proliferation and its direct interfering effect of this microRNA on PDGF-r-a, which was previously reported to be involved in the age-associated decline of pancreatic ß-cell proliferation. Interestingly miR-34a was upregulated in the liver and brain of 1 year old animals and positively correlated with age in pancreatic islets of normoglycemic human donors. These results suggest that miR-34a might be not only involved in the age-associated impairment of the pancreatic ß-cell functions, but also play a role in insulin target tissues and contribute to the aging phenotype on the organism level. To conclude, we have demonstrated that microRNAs are indeed involved in the age-associated pancreatic ß-cell dysfunction and they can play both beneficial and harmful roles in the context of pancreatic ß-cell aging.

Influence of PTPN2 and pre-existing immunity on the generation of effector and memory CD8 T cells

Notre système immunitaire joue un rôle important pour la protection envers les maladies infectieuses. Au cours d'une réponse à une infection primaire, des cellules B et des cellules T spécifiques, dirigées contre le pathogène en question, sont générées et certaines d'entre elles deviennent des cellules dites mémoires. Leur fonction est de nous protéger contre une nouvelle infection avec le même pathogène, une infection secondaire. Dans certaines situations, comme c'est par exemple le cas avec la grippe, les pathogènes ne sont pas toujours complètement identiques et les cellules mémoires ne sont pas à même d'assurer leur rôle protecteur et d'empêcher une réinfection. Pourtant, on ne sait à l'heure actuelle que très peu comment une immunité acquise, mais non protectrice, influence le développement d'une réponse immunitaire ultérieure. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié comment les cellules T mémoires cytotoxiques altèrent la réponse de cellules T cytotoxiques nouvellement induites. Au cours d'une réaction immunitaire dirigée contre une infection primaire, un vaste répertoire de lymphocytes T est créé, constitué de cellules T possédant divers degrés d'affinité pour le pathogène. Lors d'une infection secondaire, seules les cellules T ayant une forte affinité pour le pathogène participent à la réponse. Nous avons pu démontrer que ce phénomène de restriction du répertoire des cellules T est principalement causé par les cellules T mémoires qui sont à même de reconnaître un antigène pathogénique présent dans les deux infections. Dans un deuxième projet, nous avons étudié comment l'absence de PTPN2 influence la réponse des cellules T. Chez l'homme, une mutation dans le gène de PTPN2 est associée à des maladies auto-immunes et résulte en une activité réduite de cette phosphatase dans les lymphocytes T. Nous avons montré que la baisse d'activité de la phosphatase PTNP2 conduit à une meilleure expansion des cellules T ayant une qualité comparable à des cellules T auto-antigène spécifiques. De plus, nous avons observé que la survie de ces cellules T effectues ayant une phosphatase diminuée est nettement améliorée. Cela peut conduire à une réponse immunitaire plus efficace ou, éventuellement, à une pathologie auto-immune plus grave. En outre, nos résultats montrent qu'en manipulant l'activité de cette phosphatase, il est possible d'augmenter l'efficacité du transfert des cellules T dans un hôte receveur. Un tel transfert de cellules T est pratiqué chez des patients atteints de tumeurs. Nos travaux suggèrent que la manipulation de la phosphatase PTPN2 pourrait donc représenter une approche thérapeutique novatrice et prometteuse. -- Notre système immunitaire joue un rôle important pour la protection contre les maladies. Les cellules T CD8+ ont une importance primordiale pour le contrôle d'infections primaires causées par des virus ou bactéries, mais également contre certaines tumeurs. Par conséquent, mieux comprendre les exigences nécessaires à l'induction de bonnes réponses des cellules T CD8 pourrait nous permettre de construire des vaccins contre les pathogènes contre lesquels nous n'avons pour l'instant pas de vaccins mais aussi d'améliorer les réactions immunitaires dirigées anti-tumorales. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'influence qu'une immunité préexistante a sur la réponse des cellules T CD8. Nous sommes souvent exposés à des pathogènes qui sont similaires mais pas identiques à ceux que nous avons rencontrés auparavant. De telles infections hétérologues ne sont pas l'objet de beaucoup d'études et certains exemples indiquent même qu'une immunité préexistante partielle peut mener à une aggravation de la maladie. Nous avons étudié le répertoire des lymphocytes T CD8 qui sont générés lors d'une rencontre avec un nouvel antigène, et ce en comparant infection primaire et secondaire. En utilisant le modèle expérimental d'infections à Listeria monocytogenes, nous avons pu montrer que lors d'une infection primaire, un répertoire diversifié comprenant des cellules T CD8 de forte et faible affinité est constitué. Au contraire, dans le cas d'une infection secondaire, le répertoire des cellules T est fortement limité et seulement les lymphocytes T de forte affinité sont impliqués dans la réponse immunitaire. Nous avons pu démontrer que ces Rangements sont provoqués par des cellules T CD8 mémoires capables de reconnaître un antigène présent dans les deux infections. Cette augmentation du seuil d'activation des cellules effectrices est majoritairement causée par les lymphocytes T CD8 mémoires non transférables. Ces observations indiquent que les vaccins visant à induire des cellules T anti-tumorales de faible affinité seraient inefficaces si le vaccin contient des épitopes contre lesquels il existe une mémoire immunologique. Les réponses immunitaires conduites par les cellules T contre les antigènes tumoraux dépendent des cellules T CD8 de faible réactivité contre les antigènes tumoraux puisque les cellules à forte réactivité sont éliminées par les mécanismes de tolérance. Nous basant sur l'existence dans la littérature de preuves indiquant que PTPN2 influence la réponse des cellules T de faible affinité, nous nous sommes intéressés à comprendre comment PTPN2 impacte les réponses des cellules T CD8 en général. Nous avons remarqué que des cellules T CD8 déficientes en PTPN2 exhibent une meilleure capacité à proliférer suite à une faible ou courte stimulation du récepteur des lymphocytes T. La phase effectrice est prolongée et la contraction retardée résultant ainsi à globalement plus de cellules effectrices. Ce phénomène est également accompagné d'une meilleure survie des cellules effectrices de différentiation terminale. Une fois transférées dans un nouvel hôte receveur, les cellules effectrices terminales KLRG1+CD127- déficientes en phosphatase PTPN2 peuvent survivre et se transformer en cellules mémoires CD127+ fonctionnelles. De façon inattendue, nous avons découvert que l'élimination de PTPN2 améliore l'efficacité du transfert et la formation des cellules mémoires ainsi que leur capacité protectrice. Manipuler l'activité de cette phosphatase apparaît donc comme une approche intéressante et prometteuse pour la thérapie cellulaire par transfert adoptif de lymphocytes T. Nos observations montrent que la manipulation d'un facteur intrinsèque, l'absence de PTPN2, peut, dans certaines circonstances, améliorer la réponse des cellules T. Une meilleure connaissance des mécanismes contrôlant la réponse des lymphocytes T CD8 pourrait donc permettre la manipulation de ces derniers et conduire à des réponses immunitaires plus vigoureuses. Si ces réponses sont déclenchées par l'utilisation de vaccins, il est nécessaire de considérer l'historique d'une exposition préalable à des agents pathogènes ou à des vaccins puisque celle-ci peut, comme nous l'avons démontré, influencer le répertoire des cellules T recrutées dans la réponse immunitaire et, par conséquent, modifier l'aptitude de notre système immunitaire à faire face à une infection. -- Our immune system plays an important role in the protection from disease. CD8 T cells are critical for the control of primary infections with most viruses and certain bacteria as well as against some tumors. Therefore, better knowledge of CD8 T cell responses might enable us to generate vaccines against pathogens for which currently no vaccines are available or to improve anti-tumor immune responses. In the first part of this thesis we addressed the issue how previously acquired immunity impacts on the response of CD8 T cells. We are often exposed to pathogens that are related but not identical to the previously encountered ones. Such heterologous infections are not well studied and there are some indications that partial pre-existing immunity may in some cases even lead to an enhancement of disease. We specifically studied the T cell repertoire of CD8 T cells that are responding to a newly encountered antigen in secondary compared to primary infections. Using the experimental model of Listeria monocytogenes infections, we showed that in primary infections a wide repertoire including high and low affinity CD8 T cells is recruited into the immune response. In contrast to this, in secondary infections, the T cell repertoire is severely restricted and only T cells of high affinity are responding. We were able to pinpoint this difference to the presence of memory CD8 T cells that recognize an antigen that is shared between the two subsequent infections. This increase in the activation threshold was most effectively mediated via non-transferable memory CD8 T cells. This would argue that vaccines targeting low affinity tumor-specific T cells would fail if the vaccine contains previously encountered CD8 T cell epitopes. T cell mediated immune responses to tumor antigen rely often on T cells which weakly react to tumor antigen as high affinity T cells are eliminated by tolerance mechanisms. Following indication in the literature that PTPN2 impacts on the response of such weakly antigen-reactive T cells, we investigated how PTPN2 impacts in general the response of CD8 T cells. We observed that CD8 T cells lacking PTPN2 show an enhanced expansion following weak or short-term T cell receptor stimulation. The effector phase is prolonged and contraction delayed thus resulting in overall more effector cells. This is accompanied by a better survival of terminal effector cells. When transferred into new recipients, KLRG1+CD127- terminal effector cells lacking PTPN2 can survive and convert into CD127+ functional memory cells. Surprisingly, we discovered that elimination of PTPN2 enhances the transfer efficacy and formation of memory cells as well as the protective capacity. Targeting PTPN2 might thus be a promising approach for adoptive T cell therapy. Our observations show how the manipulation of an intrinsic factor, the absence of PTPN2, can enhance T cell responses under certain circumstances. A better understanding of underlying mechanisms for the control of CDS T cell responses might enable the manipulation of these and allow for more powerful responses. If these responses are induced through vaccines it is imperative that the previous history of exposure to pathogens or vaccines is considered as it can, as we have shown in this thesis, influence the recruited T cell repertoire and thus possibly the ability to handle the infection.

Seismic characterization of heterogeneous sedimentary and fractured rocks based on Biot's theory of poroelasticity

Understanding and quantifying seismic energy dissipation, which manifests itself in terms of velocity dispersion and attenuation, in fluid-saturated porous rocks is of considerable interest, since it offers the perspective of extracting information with regard to the elastic and hydraulic rock properties. There is increasing evidence to suggest that wave-induced fluid flow, or simply WIFF, is the dominant underlying physical mechanism governing these phenomena throughout the seismic, sonic, and ultrasonic frequency ranges. This mechanism, which can prevail at the microscopic, mesoscopic, and macroscopic scale ranges, operates through viscous energy dissipation in response to fluid pressure gradients and inertial effects induced by the passing wavefield. In the first part of this thesis, we present an analysis of broad-band multi-frequency sonic log data from a borehole penetrating water-saturated unconsolidated glacio-fluvial sediments. An inherent complication arising in the interpretation of the observed P-wave attenuation and velocity dispersion is, however, that the relative importance of WIFF at the various scales is unknown and difficult to unravel. An important generic result of our work is that the levels of attenuation and velocity dispersion due to the presence of mesoscopic heterogeneities in water-saturated unconsolidated clastic sediments are expected to be largely negligible. Conversely, WIFF at the macroscopic scale allows for explaining most of the considered data while refinements provided by including WIFF at the microscopic scale in the analysis are locally meaningful. Using a Monte-Carlo-type inversion approach, we compare the capability of the different models describing WIFF at the macroscopic and microscopic scales with regard to their ability to constrain the dry frame elastic moduli and the permeability as well as their local probability distribution. In the second part of this thesis, we explore the issue of determining the size of a representative elementary volume (REV) arising in the numerical upscaling procedures of effective seismic velocity dispersion and attenuation of heterogeneous media. To this end, we focus on a set of idealized synthetic rock samples characterized by the presence of layers, fractures or patchy saturation in the mesocopic scale range. These scenarios are highly pertinent because they tend to be associated with very high levels of velocity dispersion and attenuation caused by WIFF in the mesoscopic scale range. The problem of determining the REV size for generic heterogeneous rocks is extremely complex and entirely unexplored in the given context. In this pilot study, we have therefore focused on periodic media, which assures the inherent self- similarity of the considered samples regardless of their size and thus simplifies the problem to a systematic analysis of the dependence of the REV size on the applied boundary conditions in the numerical simulations. Our results demonstrate that boundary condition effects are absent for layered media and negligible in the presence of patchy saturation, thus resulting in minimum REV sizes. Conversely, strong boundary condition effects arise in the presence of a periodic distribution of finite-length fractures, thus leading to large REV sizes. In the third part of the thesis, we propose a novel effective poroelastic model for periodic media characterized by mesoscopic layering, which accounts for WIFF at both the macroscopic and mesoscopic scales as well as for the anisotropy associated with the layering. Correspondingly, this model correctly predicts the existence of the fast and slow P-waves as well as quasi and pure S-waves for any direction of wave propagation as long as the corresponding wavelengths are much larger than the layer thicknesses. The primary motivation for this work is that, for formations of intermediate to high permeability, such as, for example, unconsolidated sediments, clean sandstones, or fractured rocks, these two WIFF mechanisms may prevail at similar frequencies. This scenario, which can be expected rather common, cannot be accounted for by existing models for layered porous media. Comparisons of analytical solutions of the P- and S-wave phase velocities and inverse quality factors for wave propagation perpendicular to the layering with those obtained from numerical simulations based on a ID finite-element solution of the poroelastic equations of motion show very good agreement as long as the assumption of long wavelengths remains valid. A limitation of the proposed model is its inability to account for inertial effects in mesoscopic WIFF when both WIFF mechanisms prevail at similar frequencies. Our results do, however, also indicate that the associated error is likely to be relatively small, as, even at frequencies at which both inertial and scattering effects are expected to be at play, the proposed model provides a solution that is remarkably close to its numerical benchmark. -- Comprendre et pouvoir quantifier la dissipation d'énergie sismique qui se traduit par la dispersion et l'atténuation des vitesses dans les roches poreuses et saturées en fluide est un intérêt primordial pour obtenir des informations à propos des propriétés élastique et hydraulique des roches en question. De plus en plus d'études montrent que le déplacement relatif du fluide par rapport au solide induit par le passage de l'onde (wave induced fluid flow en anglais, dont on gardera ici l'abréviation largement utilisée, WIFF), représente le principal mécanisme physique qui régit ces phénomènes, pour la gamme des fréquences sismiques, sonique et jusqu'à l'ultrasonique. Ce mécanisme, qui prédomine aux échelles microscopique, mésoscopique et macroscopique, est lié à la dissipation d'énergie visqueuse résultant des gradients de pression de fluide et des effets inertiels induits par le passage du champ d'onde. Dans la première partie de cette thèse, nous présentons une analyse de données de diagraphie acoustique à large bande et multifréquences, issues d'un forage réalisé dans des sédiments glaciaux-fluviaux, non-consolidés et saturés en eau. La difficulté inhérente à l'interprétation de l'atténuation et de la dispersion des vitesses des ondes P observées, est que l'importance des WIFF aux différentes échelles est inconnue et difficile à quantifier. Notre étude montre que l'on peut négliger le taux d'atténuation et de dispersion des vitesses dû à la présence d'hétérogénéités à l'échelle mésoscopique dans des sédiments clastiques, non- consolidés et saturés en eau. A l'inverse, les WIFF à l'échelle macroscopique expliquent la plupart des données, tandis que les précisions apportées par les WIFF à l'échelle microscopique sont localement significatives. En utilisant une méthode d'inversion du type Monte-Carlo, nous avons comparé, pour les deux modèles WIFF aux échelles macroscopique et microscopique, leur capacité à contraindre les modules élastiques de la matrice sèche et la perméabilité ainsi que leur distribution de probabilité locale. Dans une seconde partie de cette thèse, nous cherchons une solution pour déterminer la dimension d'un volume élémentaire représentatif (noté VER). Cette problématique se pose dans les procédures numériques de changement d'échelle pour déterminer l'atténuation effective et la dispersion effective de la vitesse sismique dans un milieu hétérogène. Pour ce faire, nous nous concentrons sur un ensemble d'échantillons de roches synthétiques idéalisés incluant des strates, des fissures, ou une saturation partielle à l'échelle mésoscopique. Ces scénarios sont hautement pertinents, car ils sont associés à un taux très élevé d'atténuation et de dispersion des vitesses causé par les WIFF à l'échelle mésoscopique. L'enjeu de déterminer la dimension d'un VER pour une roche hétérogène est très complexe et encore inexploré dans le contexte actuel. Dans cette étude-pilote, nous nous focalisons sur des milieux périodiques, qui assurent l'autosimilarité des échantillons considérés indépendamment de leur taille. Ainsi, nous simplifions le problème à une analyse systématique de la dépendance de la dimension des VER aux conditions aux limites appliquées. Nos résultats indiquent que les effets des conditions aux limites sont absents pour un milieu stratifié, et négligeables pour un milieu à saturation partielle : cela résultant à des dimensions petites des VER. Au contraire, de forts effets des conditions aux limites apparaissent dans les milieux présentant une distribution périodique de fissures de taille finie : cela conduisant à de grandes dimensions des VER. Dans la troisième partie de cette thèse, nous proposons un nouveau modèle poro- élastique effectif, pour les milieux périodiques caractérisés par une stratification mésoscopique, qui prendra en compte les WIFF à la fois aux échelles mésoscopique et macroscopique, ainsi que l'anisotropie associée à ces strates. Ce modèle prédit alors avec exactitude l'existence des ondes P rapides et lentes ainsi que les quasis et pures ondes S, pour toutes les directions de propagation de l'onde, tant que la longueur d'onde correspondante est bien plus grande que l'épaisseur de la strate. L'intérêt principal de ce travail est que, pour les formations à perméabilité moyenne à élevée, comme, par exemple, les sédiments non- consolidés, les grès ou encore les roches fissurées, ces deux mécanismes d'WIFF peuvent avoir lieu à des fréquences similaires. Or, ce scénario, qui est assez commun, n'est pas décrit par les modèles existants pour les milieux poreux stratifiés. Les comparaisons des solutions analytiques des vitesses des ondes P et S et de l'atténuation de la propagation des ondes perpendiculaires à la stratification, avec les solutions obtenues à partir de simulations numériques en éléments finis, fondées sur une solution obtenue en 1D des équations poro- élastiques, montrent un très bon accord, tant que l'hypothèse des grandes longueurs d'onde reste valable. Il y a cependant une limitation de ce modèle qui est liée à son incapacité à prendre en compte les effets inertiels dans les WIFF mésoscopiques quand les deux mécanismes d'WIFF prédominent à des fréquences similaires. Néanmoins, nos résultats montrent aussi que l'erreur associée est relativement faible, même à des fréquences à laquelle sont attendus les deux effets d'inertie et de diffusion, indiquant que le modèle proposé fournit une solution qui est remarquablement proche de sa référence numérique.

Functional impact of genetic variation on gene expression

Numerous links between genetic variants and phenotypes are known and genome-wide association studies dramatically increased the number of genetic variants associated with traits during the last decade. However, how changes in the DNA perturb the molecular mechanisms and impact on the phenotype of an organism remains elusive. Studies suggest that many traitassociated variants are in the non-coding region of the genome and probably act through regulation of gene expression. During my thesis I investigated how genetic variants affect gene expression through gene regulatory mechanisms. The first chapter was a collaborative project with a pharmaceutical company, where we investigated genome-wide copy number variation (CNVs) among Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) used in pharmaceutical studies, and associated them to changes in gene expression. We found substantial copy number variation and identified CNVs linked to tissue-specific expression changes of proximal genes. The second and third chapters focus on genetic variation in humans and its effects on gene regulatory mechanisms and gene expression. The second chapter studies two human trios, where the allelic effects of genetic variation on genome-wide gene expression, protein-DNA binding and chromatin modifications were investigated. We found abundant allele specific activity across all measured molecular phenotypes and show extended coordinated behavior among them. In the third chapter, we investigated the impact of genetic variation on these phenotypes in 47 unrelated individuals. We found that chromatin phenotypes are organized into local variable modules, often linked to genetic variation and gene expression. Our results suggest that chromatin variation emerges as a result of perturbations of cis-regulatory elements by genetic variants, leading to gene expression changes. The work of this thesis provides novel insights into how genetic variation impacts gene expression by perturbing regulatory mechanisms. -- De nombreux liens entre variations génétiques et phénotypes sont connus. Les études d'association pangénomique ont considérablement permis d'augmenter le nombre de variations génétiques associées à des phénotypes au cours de la dernière décennie. Cependant, comprendre comment ces changements perturbent les mécanismes moléculaires et affectent le phénotype d'un organisme nous échappe encore. Des études suggèrent que de nombreuses variations, associées à des phénotypes, sont situées dans les régions non codantes du génome et sont susceptibles d'agir en modifiant la régulation d'expression des gènes. Au cours de ma thèse, j'ai étudié comment les variations génétiques affectent les niveaux d'expression des gènes en perturbant les mécanismes de régulation de leur expression. Le travail présenté dans le premier chapitre est un projet en collaboration avec une société pharmaceutique. Nous avons étudié les variations en nombre de copies (CNV) présentes chez le macaque crabier (Macaca fascicularis) qui est utilisé dans les études pharmaceutiques, et nous les avons associées avec des changements d'expression des gènes. Nous avons découvert qu'il existe une variabilité substantielle du nombre de copies et nous avons identifié des CNVs liées aux changements d'expression des gènes situés dans leur voisinage. Ces associations sont présentes ou absentes de manière spécifique dans certains tissus. Les deuxième et troisième chapitres se concentrent sur les variations génétiques dans les populations humaines et leurs effets sur les mécanismes de régulation des gènes et leur expression. Le premier se penche sur deux trios humains, père, mère, enfant, au sein duquel nous avons étudié les effets alléliques des variations génétiques sur l'expression des gènes, les liaisons protéine-ADN et les modifications de la chromatine. Nous avons découvert que l'activité spécifique des allèles est abondante abonde dans tous ces phénotypes moléculaires et nous avons démontré que ces derniers ont un comportement coordonné entre eux. Dans le second, nous avons examiné l'impact des variations génétiques de ces phénotypes moléculaires chez 47 individus, sans lien de parenté. Nous avons observé que les phénotypes de la chromatine sont organisés en modules locaux, qui sont liés aux variations génétiques et à l'expression des gènes. Nos résultats suggèrent que la variabilité de la chromatine est due à des variations génétiques qui perturbent des éléments cis-régulateurs, et peut conduire à des changements dans l'expression des gènes. Le travail présenté dans cette thèse fournit de nouvelles pistes pour comprendre l'impact des différentes variations génétiques sur l'expression des gènes à travers les mécanismes de régulation.

Furosemide stimulation of parathormone in humans: role of the calcium-sensing receptor and the renin-angiotensin system

Les interactions entre les systèmes de régulation du sodium et du calcium sont encore mal comprises et leur importance clinique mérite d'être étudiée plus en détail. Les études chez l'animal ont montré qu'il existe des relations entre le taux plasmatique d'hormone parathyroïdienne (PTH) et l'aldostérone ou l'activité de la rénine. Par ailleurs, il a été démontré chez l'animal et chez l'homme que le taux sanguin de PTH augmente rapidement après une injection de furosémide, un diurétique de l'anse ce qui fait penser qu'il existe un lien entre l'effet du furosémide sur le rein et la sécrétion de PTH. Toutefois, à ce jour, le(s) mécanisme(s) impliqués dans ce lien reste(nt) encore inconnu(s). Des résultats plus récents suggèrent que l'effet du furosemide est amoindri par l'administration préalable d'un calcimimétique agissant au niveau du récepteur sensible au calcium (calcium sensing receptor). Pour explorer chez l'homme, les mécanismes possibles du lien entre PTH et effet du furosemide sur le rein, nous avons planifié une étude randomisée croisée contre placebo réalisée chez 18 volontaires sains masculins. Le but principal était d'investiguer le rôle du système rénine-angiotensine et des calcium sensing receptors. L'étude s'est donc réalisée en 2 phases pour chaque sujet. Les participants ont ainsi reçu soit du cinacalcet (60mg) soit un placebo dans une première phase et le placebo ou du cinacalcet dans la 2° phase. Dans chaque phase d'évaluation, une injection de 20 mg de furosemide a été administrée par voie intraveineuse à l'équilibre soit 3 heures après la prise du placebo ou du cinacalcet. Des échantillons de plasma ont été prélevés toutes les 15 minutes pendant 1 heure puis toutes les heures pour le dosage de PTH intacte, calcium, sodium, potassium, magnésium, phosphate, activité de la rénine plasmatique et aldostérone jusqu'à 6h après l'injection de furosémide. L'excrétion urinaire de ces mêmes électrolytes a été mesurée aux mêmes intervalles.

Characterization of a MAF1 knockout mouse model

L'ARN polymérase 3 transcrit un petit groupe de gènes fortement exprimés et impliqués dans plusieurs mécanismes moléculaires. Les ARNs de transfert ou ARNt représentent plus ou moins la moitié du transcriptome de l'ARN polymérase 3. Ils sont directement impliqués dans la traduction des protéines en agissant comme transporteurs d'acides aminés qui sont incorporés à la chaîne naissante de polypeptides. Chez des levures cultivées dans un milieu jusqu'à épuisement des nutriments, Maf1 réprime la transcription par l'ARN polymérase 3, favorisant ainsi l'économie énergétique cellulaire. Dans un modèle de cellules de mammifères, MAF1 réprime aussi la transcription de l'ARN polymérase 3 dans des conditions de stress, cependant il n'existe aucune donnée quant à son rôle chez un mammifère vivant. Pendant mon doctorat, j'ai utilisé une souris délétée pour le gène Maf1 afin de connaître les effets de ce gène chez un mammifère. Etonnamment, la souris Maf1-­‐/-­‐ est résistante à l'obésité même si celle-­‐ci est nourrie avec une nourriture riche en matières grasses. Des études moléculaires et de métabolomiques ont montré qu'il existe des cycles futiles de production et dégradation des lipides et des ARNt, ce qui entraîne une augmentation de la dépense énergique et favorise la résistance à l'obésité. En plus de la caractérisation de la souris Maf1-­‐/-­‐, pendant ma thèse j'ai également développé une méthode afin de normaliser les données de ChIP-­‐sequencing. Cette méthode est fondée sur l'utilisation d'un contrôle interne, représenté ici par l'ajout d'une quantité fixe de chromatine provenant d'un organisme différent de celui étudié. La méthode a amélioré considérablement la reproductibilité des valeurs entre réplicas biologiques. Elle a aussi révélé des différences entre échantillons issus de conditions différentes. Une occupation supérieure de l'ARN polymérase 3 sur les gènes Pol 3 chez les souris Maf1 KO entraîne une augmentation du niveau de précurseurs d'ARNt, ayant pour effet probable la saturation de la machinerie de maturation des ARNt. En effet, chez les souris Maf1 KO, le pourcentage d'ARNt modifiés est plus faible que chez les souris type sauvage. Ce déséquilibre entre le niveau de précurseurs et d'ARNt matures entraîne une diminution de la traduction protéique. Ces résultats ont permis d'identifier de nouvelles fonctions pour la protéine MAF1, comme étant une protéine régulatrice à la fois de la transcription mais aussi de la traduction et en étant un cible potentielle au traitement à l'obésité. -- RNA polymerase III (Pol 3) transcribes a small set of highly expressed genes involved in different molecular mechanisms. tRNAs account for almost half of the Pol 3 transcriptome and are involved in translation, bringing a new amino into the nascent polypeptide chain. In yeast, under nutrient deprivation, Maf1 acts for cell energetic economy by repressing Pol 3 transcription. In mammalian cells, MAF1 also represses Pol 3 activity under conditions of serum deprivation or DNA damages but nothing is known about its role in a mammalian organism. During my thesis studies, I used a Maf1 KO mouse model to characterize the effects of Maf1 deletion in a living animal. Surprisingly, the MAF1 KO mouse developed an unexpected phenotype, being resistant to high fat diet-­‐induced obesity and displaying an extended lifespan. Molecular and metabolomics characterizations revealed futile cycles of lipids and tRNAs, which are produced and immediately degraded, which increases energy consumption in the Maf1 KO mouse and probably explains in part the protection to obesity. Additionally to the mouse characterization, I also developed a method to normalize ChIP-­‐seq data, based on the addition of a foreign chromatin to be used as an internal control. The method improved reproducibility between replicates and revealed differences of Pol 3 occupancy between WT and Maf1 KO samples that were not seen without normalization to the internal control. I then established that increased Pol 3 occupancy in the Maf1 KO mouse liver was associated with increased levels of tRNA precursor but not of mature tRNAs, the effective molecules involved in translation. The overproduction of precursor tRNAs associated with the deletion of Maf1 apparently overwhelms the tRNA processing machinery as the Maf1 KO mice have lower levels of fully modified tRNAs. This maturation defect directly impacts on translation efficiency as polysomic fractions and newly synthetized protein levels were reduced in the liver of the Maf1 KO mouse. Altogether, these results indicate new functions for MAF1, a regulator of both transcription and translation as well as a potential target for obesity treatment.

Role of Munc18c in SNARE-mediated exocytosis

Background: The SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein Receptors) and SM (Sec1/Munc18) family of proteins form the core machinery that drives the fusion of vesicles in different membrane trafficking steps. They are highly conserved, implying a similar mode of binding and function. In vertebrates, Munc18a is essential for neuronal exocytosis. It binds to its partner syntaxin1a (Syx1a) at both its N-peptide and closed conformation, and thereby inhibits SNARE complex formation in vitro. By contrast, its close homolog Munc18c is thought to interact with only the N-peptide of its partner Syx4. Moreover, different effects of Munc18c on SNARE complex formation have been reported, suggesting that the two Munc18/Syx pairs act differently. Objective: The aim of the present study was to investigate whether the mechanism of action of Munc18c indeed deviates from that of Munc18a by using sensitive biochemical and biophysical methods. Results: I found that Munc18c does have a similar binding mode as Munc18a and interacts tightly with Syx4 at both the N-peptide and closed conformation. Moreover, I established, through a novel assay, that Munc18c inhibits SNARE complex assembly, with both the binding sites contributing to inhibition, similar to Munc18a. However, there were several subtle differences between the two Munc18/Syx pairs. Munc18a exerted stronger inhibition than Munc18c. Also their respective Syx partners were found to differ in the rate of binding to SNAP25, suggesting that the equilibrium of their open and closed conformations is different. Moreover, Munc18a was found to interact with Syx 1, 2, 3 but not 4, while Munc18c bound to Syx 2, 4 and 1 but not 3. By comparing the kinetics of interaction of Syx with either Munc18 or SNAP25, I found that the block of SNARE complex assembly by Munc18 is effective on a shorter time scale, but SNAP25 eventually binds to Syx resulting in SNARE complex formation. Nevertheless, these findings do not explain how Syx can escape the tight grip of Munc18, suggesting that other proteins or mechanisms are needed for this step. I also discovered that Munc18 is able to bind on the surface of the SNARE core complex; however, this observation needs to be tested more rigorously. Conclusion: Munc18c was found to be similar to Munc18a in its mode of binding to Syx and inhibition of SNARE complex assembly. However, differences in kinetics and interaction specificities were observed between the different Munc18/Syx pairs. -- Contexte : Les familles des protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor At- tachment protein Receptors) et SM (Sec1/Munc18) forment le coeur de la machinerie chargée de la fusion vésiculaire au cours des différentes étapes du trafic intracellulaire. Elles sont très conservées, suggérant un mode d'interaction et des fonctions semblables. Chez les Verté- brés, Munc18a est essentielle à l'exocytose neuronale. Elle se lie à sa partenaire d'interaction syntaxin1a (Syx1a) à la fois via un peptide N-terminal et la conformation fermée de celle-ci, inhibant ainsi la formation du complexe SNARE in vitro. Son homologue proche Munc18c au contraire, est supposée interagir seulement avec le peptide N-terminal de sa partenaire Syx4. En outre, différents effets de Munc18c sur la formation du complexe SNARE ont été décrits, suggérant que les deux paires Munc18/Syx fonctionnent différemment. Objectif : Le but de cette étude est de tester si les mécanismes de fonctionnement de Munc18c diffèrent vraiment de ceux de Munc18a par le biais de méthodes biochimiques et biophysiques très précises. Résultats : J'ai pu démontrer que Munc18c se comporte en effet de façon semblable à Munc18a, et interagit étroitement avec Syx4 à ses deux sites de liaison. J'ai pu de surcroît montrer par une nouvelle méthode que Munc18c inhibe l'assemblage du complexe SNARE en impliquant ces deux sites de liaison, comme le fait Munc18a. il existe cependant de subtiles différences entre les deux paires Munc18/Syx : Munc18a exerce une inhibition plus forte que Munc18c ; leurs Syx partenaires diffèrent également dans leur degré de liaison à SNAP25, ce qui suggère un équilibre different de leurs conformations ouverte et fermée. De plus, Munc18a interagit avec Syx 1, 2 et 3 mais pas Syx 4, alors que Munc18c se lie à Syx 2, 4 et 1 mais pas Syx 3. En comparant les cinétiques d'interaction de Syx avec Munc18 ou SNAP25, j'ai découvert que le blocage par Munc18 de l'assemblage du complexe SNARE est effectif de façon brève, bien que SNAP25 finisse par se lier à Syx et aboutir ainsi à la formation du complexe SNARE. Ces découvertes n'expliquent cependant pas comment Syx parvient à échapper à la solide emprise de Munc18, et suggèrent ainsi l'intervention nécessaire d'autres protéines ou mécanismes à cette étape. J'ai également découvert que Munc18 peut se lier à la surface de la partie centrale du complexe SNARE - cette observation reste à être testée de façon plus stringente. Conclusion : Il a pu être établi que Munc18c est semblable à Munc18a quant à son mode de liaison à Syx et d'inhibition de l'assemblage du complexe SNARE. Des différences de cinétique et de spécificité d'interaction entre les diverses paires Munc18/Syx ont cependant été identifiées.

Stability of nanoparticle agglomerates under mechanical stress and its effects on their release into the air

L'exposition professionnelle aux nanomatériaux manufacturés dans l'air présente des risques potentiels pour la santé des travailleurs dans les secteurs de la nanotechnologie. Il est important de comprendre les scénarios de libération des aérosols de nanoparticules dans les processus et les activités associées à l'exposition humaine. Les mécanismes de libération, y compris les taux de libération et les propriétés physico-chimiques des nanoparticules, déterminent leurs comportements de transport ainsi que les effets biologiques néfastes. La distribution de taille des particules d'aérosols est l'un des paramètres les plus importants dans ces processus. La stabilité mécanique d'agglomérats de nanoparticules affecte leurs distributions de tailles. Les potentiels de désagglomération de ces agglomérats déterminent les possibilités de leur déformation sous énergies externes. Cela rend les changements possibles dans leur distribution de taille et de la concentration en nombre qui vont finalement modifier leurs risques d'exposition. Les conditions environnementales, telles que l'humidité relative, peuvent influencer les processus de désagglomération par l'adhérence de condensation capillaire de l'humidité. L'objectif général de cette thèse était d'évaluer les scénarios de libération des nanomatériaux manufacturés des processus et activités sur le lieu de travail. Les sous-objectifs étaient les suivants: 1. Etudier les potentiels de désagglomération des nanoparticules dans des conditions environnementales variées. 2. Etudier la libération des nano-objets à partir de nanocomposites polymères; 3. Evaluer la libération de nanoparticules sur le lieu de travail dans des situations concrètes. Nous avons comparé différents systèmes de laboratoire qui présentaient différents niveau d'énergie dans l'aérosolisation des poudres. Des nanopoudres de TiO2 avec des hydrophilicités de surface distinctes ont été testées. Un spectromètre à mobilité électrique (SMPS), un spectromètre à mobilité aérodynamique (APS) et un spectromètre optique (OPC) ont été utilisés pour mesurer la concentration de particules et la distribution de taille des particules. La microscopie électronique à transmission (TEM) a été utilisée pour l'analyse morphologique d'échantillons de particules dans l'air. Les propriétés des aérosols (distribution de taille et concentration en nombre) étaient différentes suivant la méthode employée. Les vitesses des flux d'air d'aérosolisation ont été utilisées pour estimer le niveau d'énergie dans ces systèmes, et il a été montré que les tailles modales des particules étaient inversement proportionnelles à la vitesse appliquée. En général, les particules hydrophiles ont des diamètres plus grands et des nombres inférieurs à ceux des particules hydrophobes. Toutefois, cela dépend aussi des méthodes utilisées. La vitesse de l'air peut donc être un paramètre efficace pour le classement de l'énergie des procédés pour des systèmes d'aérosolisation similaires. Nous avons développé un système laboratoire pour tester les potentiels de désagglomération des nanoparticules dans l'air en utilisant des orifices critiques et un humidificateur. Sa performance a été comparée à un système similaire dans un institut partenaire. Une variété de nanopoudres différentes a été testée. Le niveau d'énergie appliquée et l'humidité ont été modifiés. Le SMPS et l'OPC ont été utilisés pour mesurer la concentration de particules et la distribution de la taille. Un TEM a été utilisé pour l'analyse morphologique d'échantillons de particules dans l'air. Le diamètre moyen des particules a diminué et la concentration en nombre s'est accrue lorsque des énergies externes ont été appliquées. Le nombre de particules inférieures à 100 nm a été augmenté, et celui au-dessus de 350 nm réduits. Les conditions humides ont faits exactement le contraire, en particulier pour les petites particules. En outre, ils ont réduits les effets de la différence de pression due à l'orifice. Les résultats suggèrent que la désagglomération d'agglomérats de nanoparticules dans l'air est possible dans la gamme d'énergie appliquée. Cependant, l'atmosphère humide peut favoriser leur agglomération et améliorer leurs stabilités en réduisant la libération de nanoparticules dans l'environnement. Nous proposons d'utiliser notre système pour le test de routine des potentiels de désagglomération des nanomatériaux manufacturés et de les classer. Un tel classement faciliterait la priorisation de l'exposition et du risque encouru en fonction du niveau d'ENM. Un système de perçage automatique et un système de sciage manuel ont été développés pour étudier la libération de nanoparticules à partir de différents types de nanocomposites. La vitesse de perçage et taille de la mèche ont été modifiées dans les expériences. La distribution de taille des particules et leur concentration en nombre ont été mesurées par un SMPS et un miniature diffusion size classifier (DISCmini). Les distributions de nanoparticules dans les composites et les particules libérées ont été analysés par un TEM et un microscope électronique à balayage (SEM). Les tests de perçage ont libérés un plus grand nombre de particules que le sciage. Des vitesses de perçage plus rapide et les mèches plus grandes ont augmentés la génération de particules. Les charges de nanoparticules manufacturées dans les composites ne modifient pas leurs comportements de libération dans les expériences de perçage. Toutefois, le sciage différencie les niveaux de libération entre les composites et les échantillons blancs. De plus, les vapeurs de polymères ont été générées par la chaleur de sciage. La plupart des particules libérées sont des polymères contenant des nanoparticules ou sur leurs surface. Les résultats ont souligné l'importance du type de processus et paramètres pour déterminer la libération de nanoparticules de composites. Les émissions secondaires telles que les fumées polymères appellent à la nécessité d'évaluations de l'exposition et de risque pour de tels scénarios. Une revue systématique de la littérature sur le sujet de libérations de nanoparticules dans l'air dans les secteurs industriels et laboratoires de recherche a été effectuée. Des stratégies de recherche des informations pertinentes et de stockage ont été développées. Les mécanismes de libération, tels que la taille de particules d'aérosol et de leur concentration en nombre, ont été comparés pour différentes activités. La disponibilité de l'information contextuelle qui est pertinente pour l'estimation de l'exposition humaine a été évaluée. Il a été constaté que les données relatives à l'exposition ne sont pas toujours disponibles dans la littérature actuelle. Les propriétés des aérosols libérés semblent dépendre de la nature des activités. Des procédés à haute énergie ont tendance à générer des plus hauts niveaux de concentrations de particules dans les gammes de plus petite taille. Les résultats peuvent être utiles pour déterminer la priorité des procédés industriels pour l'évaluation les risques associés dans une approche à plusieurs niveaux. Pour l'évaluation de l'exposition, la disponibilité de l'information peut être améliorée par le développement d'une meilleure méthode de communication des données.

Sleep in vitro : Erk pathway regulates sleep duration and sleep related genes

To date, for most biological and physiological phenomena, the scientific community has reach a consensus on their related function, except for sleep, which has an undetermined, albeit mystery, function. To further our understanding of sleep function(s), we first focused on the level of complexity at which sleep-like phenomenon can be observed. This lead to the development of an in vitro model. The second approach was to understand the molecular and cellular pathways regulating sleep and wakefulness, using both our in vitro and in vivo models. The third approach (ongoing) is to look across evolution when sleep or wakefulness appears. (1) To address the question as to whether sleep is a cellular property and how this is linked to the entire brain functioning, we developed a model of sleep in vitro by using dissociated primary cortical cultures. We aimed at simulating the major characteristics of sleep and wakefulness in vitro. We have shown that mature cortical cultures display a spontaneous electrical activity similar to sleep. When these cultures are stimulated by waking neurotransmitters, they show a tonic firing activity, similar to wakefulness, but return spontaneously to the "sleep-like" state 24h after stimulation. We have also shown that transcriptional, electrophysiological, and metabolic correlates of sleep and wakefulness can be reliably detected in dissociated cortical cultures. (2) To further understand at which molecular and cellular levels changes between sleep and wakefulness occur, we have used a pharmacological and systematic gene transcription approach in vitro and discovered a major role played by the Erk pathway. Indeed, pharmacological inhibition of this pathway in living animals decreased sleep by 2 hours per day and consolidated both sleep and wakefulness by reducing their fragmentation. (3) Finally, we tried to evaluate the presence of sleep in one of the most primitive species with a neural network. We set up Hydra as a model organism. We hypothesized that sleep as a cellular (neuronal) property may occur with the appearance of the most primitive nervous system. We were able to show that Hydra have periodic rest phases amounting to up to 5 hours per day. In conclusion, our work established an in vitro model to study sleep, discovered one of the major signaling pathways regulating vigilance states, and strongly suggests that sleep is a cellular property highly conserved at the molecular level during evolution. -- Jusqu'à ce jour, la communauté scientifique s'est mise d'accord sur la fonction d'une majorité des processus physiologiques, excepté pour le sommeil. En effet, la fonction du sommeil reste un mystère, et aucun consensus n'est atteint le concernant. Pour mieux comprendre la ou les fonctions du sommeil, (1) nous nous sommes d'abord concentré sur le niveau de complexité auquel un état ressemblant au sommeil peut être observé. Nous avons ainsi développé un modèle du sommeil in vitro, (2) nous avons disséqué les mécanismes moléculaires et cellulaires qui pourraient réguler le sommeil, (3) nous avons cherché à savoir si un état de sommeil peut être trouvé dans l'hydre, l'animal le plus primitif avec un système nerveux. (1) Pour répondre à la question de savoir à quel niveau de complexité apparaît un état de sommeil ou d'éveil, nous avons développé un modèle du sommeil, en utilisant des cellules dissociées de cortex. Nous avons essayé de reproduire les corrélats du sommeil et de l'éveil in vitro. Pour ce faire, nous avons développé des cultures qui montrent les signes électrophysiologiques du sommeil, puis quand stimulées chimiquement passent à un état proche de l'éveil et retournent dans un état de sommeil 24 heures après la stimulation. Notre modèle n'est pas parfait, mais nous avons montré que nous pouvions obtenir les corrélats électrophysiologiques, transcriptionnels et métaboliques du sommeil dans des cellules corticales dissociées. (2) Pour mieux comprendre ce qui se passe au niveau moléculaire et cellulaire durant les différents états de vigilance, nous avons utilisé ce modèle in vitro pour disséquer les différentes voies de signalisation moléculaire. Nous avons donc bloqué pharmacologiquement les voies majeures. Nous avons mis en évidence la voie Erkl/2 qui joue un rôle majeur dans la régulation du sommeil et dans la transcription des gènes qui corrèlent avec le cycle veille-sommeil. En effet, l'inhibition pharmacologique de cette voie chez la souris diminue de 2 heures la quantité du sommeil journalier et consolide l'éveil et le sommeil en diminuant leur fragmentation. (3) Finalement, nous avons cherché la présence du sommeil chez l'Hydre. Pour cela, nous avons étudié le comportement de l'Hydre pendant 24-48h et montrons que des périodes d'inactivité, semblable au sommeil, sont présentes dans cette espèce primitive. L'ensemble de ces travaux indique que le sommeil est une propriété cellulaire, présent chez tout animal avec un système nerveux et régulé par une voie de signalisation phylogénétiquement conservée.

L'oeil, aux carrefours de l'humain

« Les yeux sont du visage humain la partie la plus noble et la plus importante, les yeux sont composés de corps, d'âme et d'esprit, ou plutôt les yeux sont la fenêtre où l'âme et l'esprit viennent se montrer » (Alphonse Karr, 1853). L'oeil est le regard, mais pour l'ophtalmologue il est aussi une fenêtre ouverte et un regard possible sur le reste du corps. Prolongement du système nerveux central en contact direct avec le monde extérieur dont il est l'un des « senseurs » le plus subtil et le plus complexe, il est sujet à des réactions inflammatoires, allergiques et toxiques chez l'enfant et chez l'adulte. Alors que notre environnement visuel change (modification des systèmes d'éclairage domestique dans les villes, écrans, mode de vie et habitudes de travail), que les polluants se multiplient et se combinent et que les environnements climatisés deviennent la règle, le nombre de patients souffrant de pathologies de la surface oculaire atteint 30 % des motifs de nos consultations et le nombre des patients myopes est en hausse. L'oeil est l'un des « senseurs » le plus subtil et le plus complexe Si la surface oculaire peut aussi être le témoin des pathologies systémiques, c'est la rétine qui en est plus fréquemment le reflet. Les atteintes du lit vasculaire, du nerf optique ou de la rétine peuvent être des manifestations de pathologies générales ou d'effets secondaires ou toxiques de médicaments. L'examen du fond d'oeil et la rétinophotographie restent les examens de dépistage de référence en particulier pour la rétinopathie diabétique, véritable fléau mondial et première cause de cécité dans les pays industrialisés chez les jeunes adultes. Mais ce n'est que par la collaboration entre ophtalmologues, médecins traitants et autres spécialistes que les pathologies rétiniennes peuvent être prises en charge de façon optimale pour qu'à des traitements oculaires spécifiques soit associée la prise en charge globale des maladies causales ou interférentes. Au-delà du fond d'oeil, les progrès technologiques contribuent au développement de multiples méthodes d'exploration des différentes structures de l'oeil offrant ainsi la possibilité d'utiliser l'oeil comme témoin de manifestations précoces de maladies neurologiques périphériques ou centrales. L'imagerie cornéenne semble aujourd'hui capable de révéler et de suivre de façon longitudinale la neuropathie diabétique périphérique et il n'est pas impossible que la rétine devienne le site de détection précoce de la maladie d'Alzheimer. Sur le plan de la prise en charge, l'ophtalmologue ne peut pas se contenter de traiter l'oeil, il doit aussi assurer une prise en charge pluridisciplinaire et accompagner le patient qui, perdant la vision, est sujet à la dépression et à la majoration de tout autre handicap. La perte visuelle est le handicap le plus redouté des populations et la perte d'autonomie qu'il induit limite l'observance et le suivi thérapeutique (comparable en termes de gravité ressentie à un « alitement brutal dans les suites d'un AVC »). La médecine personnalisée et les interactions multidisciplinaires prennent ici tout leur sens. Les développements thérapeutiques ont été majeurs ces dernières années et la cécité n'est plus une fatalité, au moins dans certains cas. Mais la rétine étant un tissu nerveux post-mitotique, les traitements et donc le dépistage doivent être précoces pour prévenir la perte visuelle irréversible. Spécifiquement, les espoirs lointains comme la thérapie génique entrent dans les essais cliniques laissant entrevoir la lumière au bout du tunnel. A portée de vue, la rétine artificielle constitue une avancée concrète, encore perfectible mais accessible dès aujourd'hui. Si les progrès sont manifestes dans le domaine de l'ophtalmologie, il reste encore beaucoup à apprendre et à comprendre en particulier dans les mécanismes pathogéniques multifactoriels des maladies oculaires plus fréquentes. Seule une exploration approfondie des maladies humaines pourra nous permettre de mieux appréhender de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comme le disait André Isaac (1893-1975), pour voir loin, il faut regarder de près.

Impact of T cell receptor affinity on the molecular mechanisms modulating CD8 T cell signalling and function against NY-ESO-1 tumour antigen

It is well established that cytotoxic T lymphocytes play a pivotal role in the protection against intracellular pathogens and tumour cells. Such protective immune responses rely on the specific T cell receptor (TCR)-mediated recognition by CD8 T cells of small antigenic peptides presented in the context of class-I Major Histocompatibility Complex molecules (pMHCs) on the surface of infected or malignant cells. The strength (affinity/avidity) of this interaction is a major correlate of protection. Although tumour-reactive CD8 T cells can be observed in cancer patients, anti-tumour immune responses are often ineffective in controlling or eradicating the disease due to the relative low TCR affinity of these cells. To overcome this limitation, tumour-specific CD8 T cells can be genetically modified to express TCRs of improved binding strength against a defined tumour antigen before adoptive cell transfer into cancer patients. We previously generated a panel of TCRs specific for the cancer-testis antigen NY-ESO-l,57.165 with progressively increased affinities for the pMHC complex, thus providing us with a unique tool to investigate the causal link between the surface expression of such TCRs and T cell activation and function. We recently demonstrated that anti-tumour CD8 T cell reactivity could only be improved within physiological affinity limits, beyond which drastic functional declines were observed, suggesting the presence of multiple regulatory mechanisms limiting T cell activation and function in a TCR affinity-dependent manner. The overarching goal of this thesis was (i) to assess the precise impact of TCR affinity on T cell activation and signalling at the molecular level and (ii) to gain further insights on the mechanisms that regulate and delimitate maximal/optimized CD8 T cell activation and signalling. Specifically, by combining several technical approaches we characterized the activation status of proximal (i.e. CD3Ç, Lek, and ZAP-70) and distal (i.e. ERK1/2) signalling molecules along the TCR affinity gradient. Moreover, we assessed the extent of TCR downmodulation, a critical step for initial T cell activation. CD8 T cells engineered with the optimal TCR affinity variants showed increased activation levels of both proximal and distal signalling molecules when compared to the wild-type T cells. Our analyses also highlighted the "paradoxical" status of tumour-reactive CD8 T cells bearing very high TCR affinities, which retained strong proximal signalling capacity and TCR downmodulation, but were unable to propagate signalling distally (i.e. pERKl/2), resulting in impaired cell-mediated functions. Importantly, these very high affinity T cells displayed maximal levels of SHP-1 and SHP-2 phosphatases, two negative regulatory molecules, and this correlated with a partial pERKl/2 signalling recovery upon pharmacological SHP-l/SHP-2 inhibition. These findings revealed the putative presence of inhibitory regulators of the TCR signalling cascade acting very rapidly following tumour-specific stimulation. Moreover, the very high affinity T cells were only able to transiently express enhanced proximal signalling molecules, suggesting the presence of an additional level of regulation that operates through the activation of negative feedback loops over time, limiting the duration of the TCR-mediated signalling. Overall, the determination of TCR-pMHC binding parameters eliciting optimal CD8 T cell activation, signalling, and effector function while guaranteeing high antigen specificity, together with the identification of critical regulatory mechanisms acting proximally in the TCR signalling cascade, will directly contribute to optimize and support the development of future TCR-based adoptive T cell strategies for the treatment of malignant diseases. -- Les lymphocytes T CD8 cytotoxiques jouent un rôle prédominant dans la protection contre les pathogènes intracellulaires et les cellules tumorales. Ces réponses immunitaires dépendent de la spécificité avec laquelle les récepteurs T (TCR) des lymphocytes CD8 reconnaissent les peptides antigéniques présentés par les molécules du complexe Majeur de Histocompatibilité de classe I (pCMH) à la surface des cellules infectées ou malignes. La force (ou affinité/avidité) de l'interaction du TCR-pCMH est un corrélat majeur de protection. Les réponses immunitaires sont cependant souvent inefficaces et ne permettent pas de contrôler ou d'éliminer les cellules tumorales chez les patients atteint du cancer, et ce à cause de la relative faible reconnaissance des TCRs exprimés par les lymphocytes T CD8 envers les antigènes tumoraux. Afin de surmonter cette limitation, les cellules T anti-tumorales peuvent être génétiquement modifiées en les dotant de TCRs préalablement optimisés afin d'augmenter leur reconnaissance ou affinité contre les antigènes tumoraux, avant leur ré¬infusion dans le patient. Nous avons récemment généré des cellules T CD8 exprimant un panel de TCRs spécifiques pour l'antigène tumoral NY-ESO-l157.16J avec des affinités croissantes, permettant ainsi d'investiguer la causalité directe entre l'affinité du TCR-pCMH et la fonction des cellules T CD8. Nous avons démontré que la réactivité anti-tumorale pouvait être améliorée en augmentant l'affinité du TCR dans une intervalle physiologique, mais au delà duquel nous observons un important déclin fonctionnel. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes de régulation limitant l'activation des cellules T de manière dépendante de l'affinité du TCR. Le but de cette thèse a été (i) de définir l'impact précis de l'affinité du TCR sur l'activation et la signalisation des cellules T CD8 au niveau moléculaire et (ii) d'acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent et délimitent l'activation et la signalisation maximale des cellules T CD8 optimisées. Spécifiquement, en combinant plusieurs approches technologiques, nous avons caractérisé l'état d'activation de différentes protéines de la voie de signalisation proximale (CD3Ç, Lek et ZAP-70) et distale (ERK1/2) le long du gradient d'affinité du TCR, ainsi que l'internalisation du TCR, une étape clef dans l'activation initiale des cellules T. Les lymphocytes T CD8 exprimant des TCRs d'affinité optimale ont montré des niveaux d'activation augmentés des molécules proximales et distales par rapport aux cellules de type sauvage (wild-type). Nos analyses ont également mis en évidence un paradoxe chez les cellules T CD8 équipées avec des TCRs de très haute affinité. En effet, ces cellules anti-tumorales sont capables d'activer leurs circuits biochimiques au niveau proximal et d'internaliser efficacement leur TCR, mais ne parviennent pas à propager les signaux biochimiques dépendants du TCR jusqu'au niveau distal (via phospho-ERKl/2), avec pour conséquence une limitation de leur capacité fonctionnelle. Finalement, nous avons démontré que SHP-1 et SHP-2, deux phosphatases avec des propriétés régulatrices négatives, étaient majoritairement exprimées dans les cellules T CD8 de très hautes affinités. Une récupération partielle des niveaux d'activation de ERK1/2 a pu être observée après l'inhibition pharmacologique de ces phosphatases. Ces découvertes révèlent la présence de régulateurs moléculaires qui inhibent le complexe de signalisation du TCR très rapidement après la stimulation anti-tumorale. De plus, les cellules T de très hautes affinités ne sont capables d'activer les molécules de la cascade de signalisation proximale que de manière transitoire, suggérant ainsi un second niveau de régulation via l'activation de mécanismes de rétroaction prenant place progressivement au cours du temps et limitant la durée de la signalisation dépendante du TCR. En résumé, la détermination des paramètres impliqués dans l'interaction du TCR-pCMH permettant l'activation de voies de signalisation et des fonctions effectrices optimales ainsi que l'identification des mécanismes de régulation au niveau proximal de la cascade de signalisation du TCR contribuent directement à l'optimisation et au développement de stratégies anti-tumorales basées sur l'ingénierie des TCRs pour le traitement des maladies malignes.

Iterative reconstruction in CT : using mathematical model observers to determine low dose images' trustworthiness

La tomodensitométrie (TDM) est une technique d'imagerie pour laquelle l'intérêt n'a cessé de croitre depuis son apparition au début des années 70. De nos jours, l'utilisation de cette technique est devenue incontournable, grâce entre autres à sa capacité à produire des images diagnostiques de haute qualité. Toutefois, et en dépit d'un bénéfice indiscutable sur la prise en charge des patients, l'augmentation importante du nombre d'examens TDM pratiqués soulève des questions sur l'effet potentiellement dangereux des rayonnements ionisants sur la population. Parmi ces effets néfastes, l'induction de cancers liés à l'exposition aux rayonnements ionisants reste l'un des risques majeurs. Afin que le rapport bénéfice-risques reste favorable au patient il est donc nécessaire de s'assurer que la dose délivrée permette de formuler le bon diagnostic tout en évitant d'avoir recours à des images dont la qualité est inutilement élevée. Ce processus d'optimisation, qui est une préoccupation importante pour les patients adultes, doit même devenir une priorité lorsque l'on examine des enfants ou des adolescents, en particulier lors d'études de suivi requérant plusieurs examens tout au long de leur vie. Enfants et jeunes adultes sont en effet beaucoup plus sensibles aux radiations du fait de leur métabolisme plus rapide que celui des adultes. De plus, les probabilités des évènements auxquels ils s'exposent sont également plus grandes du fait de leur plus longue espérance de vie. L'introduction des algorithmes de reconstruction itératifs, conçus pour réduire l'exposition des patients, est certainement l'une des plus grandes avancées en TDM, mais elle s'accompagne de certaines difficultés en ce qui concerne l'évaluation de la qualité des images produites. Le but de ce travail est de mettre en place une stratégie pour investiguer le potentiel des algorithmes itératifs vis-à-vis de la réduction de dose sans pour autant compromettre la qualité du diagnostic. La difficulté de cette tâche réside principalement dans le fait de disposer d'une méthode visant à évaluer la qualité d'image de façon pertinente d'un point de vue clinique. La première étape a consisté à caractériser la qualité d'image lors d'examen musculo-squelettique. Ce travail a été réalisé en étroite collaboration avec des radiologues pour s'assurer un choix pertinent de critères de qualité d'image. Une attention particulière a été portée au bruit et à la résolution des images reconstruites à l'aide d'algorithmes itératifs. L'analyse de ces paramètres a permis aux radiologues d'adapter leurs protocoles grâce à une possible estimation de la perte de qualité d'image liée à la réduction de dose. Notre travail nous a également permis d'investiguer la diminution de la détectabilité à bas contraste associée à une diminution de la dose ; difficulté majeure lorsque l'on pratique un examen dans la région abdominale. Sachant que des alternatives à la façon standard de caractériser la qualité d'image (métriques de l'espace Fourier) devaient être utilisées, nous nous sommes appuyés sur l'utilisation de modèles d'observateurs mathématiques. Nos paramètres expérimentaux ont ensuite permis de déterminer le type de modèle à utiliser. Les modèles idéaux ont été utilisés pour caractériser la qualité d'image lorsque des paramètres purement physiques concernant la détectabilité du signal devaient être estimés alors que les modèles anthropomorphes ont été utilisés dans des contextes cliniques où les résultats devaient être comparés à ceux d'observateurs humain, tirant profit des propriétés de ce type de modèles. Cette étude a confirmé que l'utilisation de modèles d'observateurs permettait d'évaluer la qualité d'image en utilisant une approche basée sur la tâche à effectuer, permettant ainsi d'établir un lien entre les physiciens médicaux et les radiologues. Nous avons également montré que les reconstructions itératives ont le potentiel de réduire la dose sans altérer la qualité du diagnostic. Parmi les différentes reconstructions itératives, celles de type « model-based » sont celles qui offrent le plus grand potentiel d'optimisation, puisque les images produites grâce à cette modalité conduisent à un diagnostic exact même lors d'acquisitions à très basse dose. Ce travail a également permis de clarifier le rôle du physicien médical en TDM: Les métriques standards restent utiles pour évaluer la conformité d'un appareil aux requis légaux, mais l'utilisation de modèles d'observateurs est inévitable pour optimiser les protocoles d'imagerie. -- Computed tomography (CT) is an imaging technique in which interest has been quickly growing since it began to be used in the 1970s. Today, it has become an extensively used modality because of its ability to produce accurate diagnostic images. However, even if a direct benefit to patient healthcare is attributed to CT, the dramatic increase in the number of CT examinations performed has raised concerns about the potential negative effects of ionising radiation on the population. Among those negative effects, one of the major risks remaining is the development of cancers associated with exposure to diagnostic X-ray procedures. In order to ensure that the benefits-risk ratio still remains in favour of the patient, it is necessary to make sure that the delivered dose leads to the proper diagnosis without producing unnecessarily high-quality images. This optimisation scheme is already an important concern for adult patients, but it must become an even greater priority when examinations are performed on children or young adults, in particular with follow-up studies which require several CT procedures over the patient's life. Indeed, children and young adults are more sensitive to radiation due to their faster metabolism. In addition, harmful consequences have a higher probability to occur because of a younger patient's longer life expectancy. The recent introduction of iterative reconstruction algorithms, which were designed to substantially reduce dose, is certainly a major achievement in CT evolution, but it has also created difficulties in the quality assessment of the images produced using those algorithms. The goal of the present work was to propose a strategy to investigate the potential of iterative reconstructions to reduce dose without compromising the ability to answer the diagnostic questions. The major difficulty entails disposing a clinically relevant way to estimate image quality. To ensure the choice of pertinent image quality criteria this work was continuously performed in close collaboration with radiologists. The work began by tackling the way to characterise image quality when dealing with musculo-skeletal examinations. We focused, in particular, on image noise and spatial resolution behaviours when iterative image reconstruction was used. The analyses of the physical parameters allowed radiologists to adapt their image acquisition and reconstruction protocols while knowing what loss of image quality to expect. This work also dealt with the loss of low-contrast detectability associated with dose reduction, something which is a major concern when dealing with patient dose reduction in abdominal investigations. Knowing that alternative ways had to be used to assess image quality rather than classical Fourier-space metrics, we focused on the use of mathematical model observers. Our experimental parameters determined the type of model to use. Ideal model observers were applied to characterise image quality when purely objective results about the signal detectability were researched, whereas anthropomorphic model observers were used in a more clinical context, when the results had to be compared with the eye of a radiologist thus taking advantage of their incorporation of human visual system elements. This work confirmed that the use of model observers makes it possible to assess image quality using a task-based approach, which, in turn, establishes a bridge between medical physicists and radiologists. It also demonstrated that statistical iterative reconstructions have the potential to reduce the delivered dose without impairing the quality of the diagnosis. Among the different types of iterative reconstructions, model-based ones offer the greatest potential, since images produced using this modality can still lead to an accurate diagnosis even when acquired at very low dose. This work has clarified the role of medical physicists when dealing with CT imaging. The use of the standard metrics used in the field of CT imaging remains quite important when dealing with the assessment of unit compliance to legal requirements, but the use of a model observer is the way to go when dealing with the optimisation of the imaging protocols.

Le retour des villes : les phénomènes de déprise et de reprise démographiques dans les villes suisses

Partant de la littérature sur le déclin des villes d'une part et sur le regain d'attractivité des centres urbains d'autre part, cet article analyse l'évolution démographique des villes suisses au cours des dernières décennies. Dès les années 1960/1970, la majorité d'entre elles enregistrent une diminution de leur population, une déprise interprétée comme le signe d'une attractivité déficiente et que beaucoup d'observateurs jugent inéluctable. Et pourtant, depuis les années 2000, une nouvelle phase de croissance (réurbanisation) est constatée. En prenant en compte les différentes composantes de l'évolution de la population, cet article identifie les mécanismes et facteurs économiques, démographiques, socio-culturels et politiques à l'origine de ce « retour des villes ». Drawing on the literature on urban decline on the one hand and on the renewed attractiveness of urban centres on the other, this paper addresses the demographic evolution of Swiss cities during the last decades. In the years 1960/1970 most of them experience a decrease of their population, a loss interpreted as the sign of a deficient attractiveness and that many observers assess as ineluctable. Nonetheless, since 2000 a new period of growth (reurbanisation) has been noted. Taking into account the various components of the population evolution, this paper identifies the mechanisms and the economic, demographic, socio-cultural and political factors at the origin of this « returns of cities ».

Redox dysregulation in schizophrenia : effect on myelination of cortical structures and connectivity

Cette thèse traite du rôle qu'un facteur de risque génétique développé chez les patients souffrant de schizophrénie, à savoir un déficit de la synthèse du glutathion, peut jouer dans les anomalies de la connectivité cérébrale trouvées chez ces patients. L'essentiel du travail a été consacré à évaluer la structure de la substance blanche dans l'ensemble du cerveau chez un modèle animal par une méthode similaire à celle utilisée en recherche clinique avec l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Cette approche de translation inverse chez la souris knock-out de glutamate-cystéine ligase modulateur sous-unité (Gclm KO), avait l'objectif d'étudier l'effet des défenses redox déficientes sur le développement des connexions cérébrales, tout en excluant celui des facteurs non liés au génotype. Après avoir établi le protocole de recherche, l'influence d'une manipulation environnementale a également été étudiée. Pour effectuer une analyse statistique fiable des données d'IRM obtenues, nous .avons d'abord créé un atlas du cerveau de la souris afin de l'utiliser comme modèle pour une segmentation précise des différentes régions du cerveau sur les images IRM obtenues in vivo. Les données provenant de chaque région d'intérêt ont ensuite été étudiées séparément. La qualité de cette méthode a été évaluée dans une expérience de simulation pour déduire la puissance statistique réalisable dans chaque région en fonction du nombre d'animaux utilisés. Ces outils d'analyse nous ont permis d'évaluer l'intégrité de la substance blanche dans le cerveau des souris durant le développement grâce à une expérience longitudinale, en utilisant l'imagerie du tenseur de diffusion (DTI). Nous avons ainsi observé des anomalies dans les paramètres dérivés du tenseur (diffusivité et anisotropie) dans la Commissure Antérieure et le Fimbria/Fornix des souris Gclm KO, par rapport aux animaux contrôles. Ces résultats suggèrent une substance blanche endommagée dans ces régions. Dans une expérience électrophysiologique, Pascal Steullet a montré que ces anomalies ont des conséquences fonctionnelles caractérisées par une réduction de la vitesse de conduction dans les fibres nerveuses. Ces données renforcent les conclusions des analyses d'imagerie. Le mécanisme par lequel une dérégulation redox affecte la structure de la substance blanche reste encore à définir, car une analyse immunohistochimique des protéines constituantes de la couche de myéline des fibres concernées n'a pas donné de résultats concluants. Nous avons également constaté un élargissement des ventricules dans les jeunes souris Gclm KO, mais pas chez les adultes et des anomalies neurochimiques déjà connues chez ces animaux (Duarte et al. 2011), à savoir une réduction du Glutathion et une augmentation de l'acide N-acétylaspartique, de l'Alanine et du ratio Glutamine/Glutamate. Nous avons ensuite testé l'effet d'un stress environnemental supplémentaire, l'élevage en isolement social, sur le phénotype. Ce stress n'a eu aucun effet sur la structure de la substance blanche évaluée par DTI, mais a réduit la concentration de myo-Inositol et augmenté le ratio de Glutamine/Glutamate dans le cortex frontal. Nous avons aussi reproduit dans ce groupe indépendant d'animaux les effets du génotype sur le profil neurochimique, sur la taille des ventricules et aussi sur les paramètres dérivés du tenseur de diffusion dans le Fimbria/Fornix, mais pas dans la Commissure Antérieure. Nos résultats montrent qu'une dérégulation redox d'origine génétique perturbe la structure et la fonction de la substance blanche dans des régions spécifiques, causant ainsi l'élargissement des ventricules. Ces phénotypes rassemblent certaines caractéristiques neuro-anatomiques de la schizophrénie, mais les mécanismes qui en sont responsables demeurent encore inconnus. L'isolement social n'a pas d'effet sur la structure de la substance blanche évaluée par DTI, alors qu'il est prouvé qu'il affecte la maturation des oligodendrocytes. La neurochimie corticale et en particulier le rapport Glutamine/Glutamate a été affecté par le dérèglement redox ainsi que par l'isolement social. En conséquence, ce ratio représente un indice prometteur dans la recherche sur l'interaction du stress environnemental avec le déséquilibre redox dans le domaine de la schizophrénie. -- The present doctoral thesis is concerned with the role that a genetic risk factor for the development of schizophrenia, namely a deficit in Glutathione synthesis, may play in the anomalies of brain connectivity found in patients. Most of the effort was devoted to perform a whole-brain assessment of white matter structure in the Glutamate-Cysteine ligase modulatory knockout mouse model (Gclm KO) using Magnetic Resonance Imaging (MRI) techniques similar to those used in state-of-the-art clinical research. Such reverse translational approach taking brain imaging from the bedside to the bench aimed to investigate the role that deficient redox defenses may play in the development of brain connections while excluding all influencing factors beside the genotype. After establishing the protocol, the influence of further environmental manipulations was also studied. Analysis of MRI images acquired in vivo was one of the main challenges of the project. Our strategy consisted in creating an atlas of the mouse brain to use as segmentation guide and then analyze the data from each region of interest separately. The quality of the method was assessed in a simulation experiment by calculating the statistical power achievable in each brain region at different sample sizes. This analysis tool enabled us to assess white matter integrity in the mouse brain along development in a longitudinal experiment using Diffusion Tensor Imaging (DTI). We discovered anomalies in diffusivity parameters derived from the tensor in the Anterior Commissure and Fimbria/Fornix of Gclm KO mice when compared to wild-type animals, which suggest that the structure of these tracts is compromised in the KO mice. In an elegant electrophysiological experiment, Pascal Steullet has provided evidence that these anomalies have functional consequences in form of reduced conduction velocity in the concerned tracts, thus supporting the DTI findings. The mechanism by which redox dysregulation affects WM structure remains unknown, for the immunohistochemical analysis of myelin constituent proteins in the concerned tracts produced inconclusive results. Our experiments also detected an enlargement of the lateral ventricles in young but not adult Gclm KO mice and confirmed neurochemical anomalies already known to affect this animals (Duarte et al. 2011), namely a reduction in Glutathione and an increase in Glutamine/Glutamate ratio, N-acetylaspartate and Alanine. Using the same methods, we tested the effect of an additional environmental stress on the observed phenotype: rearing in social isolation had no effect on white matter structure as assessed by DTI, but it reduced the concentration of myo-Inositol and increased the Glutamine/Glutamate ratio in the frontal cortex. We could also replicate in this separate group of animals the effects of genotype on the frontal neurochemical profile, ventricular size and diffusivity parameters in the Fimbria/Fornix but not in the Anterior Commissure. Our data show that a redox dysregulation of genetic origin may disrupt white matter structure and function in specific tracts and cause a ventricular enlargement, phenotypes that resemble some neuroanatomical features of schizophrenia. The mechanism responsible remains however unknown. We have also demonstrated that environmental stress in form of social isolation does not affect white matter structure as assessed by DTI even though it is known to affect oligodendrocyte maturation. Cortical neurochemistry, and specifically the Glutamine to Glutamate balance was affected both by redox dysregulation and social isolation, and is thus a good target for further research on the interaction of redox imbalance and environmental stress in schizophrenia.

Défenses du thérapeute et niveau de formation : une étude exploratoire

Parmi l'ensemble des variables étudiées par la recherche en psychothérapie, le thérapeute en tant que tel semble être le facteur prédictif le plus robuste du processus et des résultats thérapeutiques. Cependant, on ne dispose que de très peu de données de recherche pour expliquer cet effet. Aucune recherche ne s'est intéressée directement aux défenses des psychothérapeutes aux cours d'une psychothérapie. Cette étude poursuit deux objectifs principaux : (1) Évaluer la fréquence absolue des mécanismes de défense utilisés par le thérapeute durant les séances de thérapies et la fréquence relative des différents mécanismes de défense ; (2) évaluer l'effet de la formation à la psychothérapie sur la fréquence des mécanismes de défense du thérapeute. L'échantillon comprend 12 thérapeutes, divisés en 3 catégories : novices, expérimentés (formation terminée), et experts. La thérapie consiste en une intervention psychodynamique brève (IPB) en 4 séances. Les mécanismes de défense du thérapeute ont été mesurés à l'aide des Echelles d'évaluation des mécanismes de défense »), version française du Defense Mechanism Rating Scales (DMRS, Perry et coll., 2004). Les résultats montrent que tous les thérapeutes utilisent plusieurs mécanismes de défense, correspondant à des niveaux de maturité différents. Par ailleurs, les thérapeutes novices n'utilisent pas plus de mécanismes de défense que les thérapeutes plus formés. Enfin le niveau défensif du thérapeute n'a pas d'effet sur le résultat de l'intervention. Cette étude ouvre un champ de recherche prometteur en validant l'intérêt d'étudier les processus de régulation des affects du thérapeute parfois très intenses qui apparaissent au cours de la psychothérapie.