Identification and functional characterization of auxiliary enzymes of the β-oxidation in " Arabidopsis thaliana "

Abstract: The ß-oxidation is the universal pathway that allows living organisms to degrade fatty acids. leading to lipid homeostasis and carbon and energy recovery from the fatty acid molecules. This pathway is centred on four core enzymatic activities sufficient to degrade saturated fatty acids. Additional auxiliary enzymes of the ß-oxidation are necessary for the complete degradation of a larger array of molecules encompassing the unsaturated fatty acids. The main pathways of the ßoxidation of fatty acids have been investigated extensively and auxiliary enzymes are well-known in mammals and yeast. The comparison of the established ß-oxidation systems suggests that the activities that are required to proceed to the full degradation of unsaturated fatty acids are present regardless of the organism and rely on common active site templates. The precise identity of the plant enzymes was unknown. By homology searches in the genome of Arabidopsis thaliana, I identified genes. encoding for proteins that could be orthologous to the yeast or animal auxiliary enzymes Δ 3, Δ 2-enoyl-CoA isomerase, Δ 3,5, Δ 2,4 -dienoyl-CoA isomerase, and type 2 enoyl-CoA hydratase. I established that these genes are expressed in Arabidopsis and that their expression can be correlated to the expression of core ß-oxidation genes. Through the observation of chimeric fluorescent protein fusions, I demonstrated that the identified proteins are localized in the peroxisóme, the only organelle where the ß-oxidation occurs in plants. Enzymatic assays were performed with the partially purified enzymes to demonstrate that the identified enzymes can catalyze the same in vitro reactions as their non-plant orthologs. The activities in vivo of the plant enzymes were demonstrated by heterologous complementation of the corresponding yeast Saccharomyces cerevisiae mutants. The complementation was visualized using the artificial polyhydroxyalkanoate (PHA) production in yeast peroxisomes. The recombinant strains, expressing a Pseudomonas aeruginosa PHA synthase modified for a peroxisomal localization, produce this polymer that serves as a trap for the 3-hydroxyacyl-CoA intermediaries of the ßoxidation and that reflects qualitatively and quantitatively the array of molecules that are processed through the ß-oxidation. This complementation demonstrated the implication of the plant Δ 3, Δ 2-enoyl-CoA isomerases and Δ3,5, Δ2,4-dienoyl-CoA isomerase in the degradation of odd chain position unsaturated fatty acids. The presence of a monofunctional type 2 enoyl-CoA hydratase is a novel in eukaryotes. Downregulation of the corresponding gene expression in an Arabidopsis line, modified to produce PHA in the peroxisome, demonstrated thàt this enzyme participates in vivo to the conversion of the intermediate 3R-hydroxyacyl-CoA, generated by the metabolism of fatty acids with a cis (Z)-unsaturated bond on an even-numbered carbon, to the 2Eenoyl-CoA for further degradation through the core ß-oxidation cycle. Résumé: La ß-oxydation est une voie universelle de dégradation des acides gras qui permet aux organismes vivants d'assurer une homéostasie lipidique et de récupérer l'énergie et le carbone contenus dans les acides gras. Le coeur de cette voie est composé de quatre réactions enzymatiques suffisantes à la dégradation des acides gras saturés. La présence des enzymes auxiliaires de la ß-oxydation est nécessaire à la dégradation d'une gamme plus étendue de molécules comprenant les acides gras insaturés. Les voies principales de la ß-oxydation des acides gras ont été étudiées en détail et les enzymes auxiliaires sont déterminées chez les mammifères et la levure. La comparaison entre les systèmes de ß-oxydation connus suggère que les activités requises pour la dégradation complète des acides gras insaturés reposent sur la présence de site actifs similaires. L'identité précise des enzymes auxiliaires chez les plantes était inconnue. En cherchant par homologie dans le génome de la plante modèle Arabidopsis thaliana, j'ai identifié des gènes codant pour des protéines pouvant être orthologues aux enzymes auxiliaires Δ3 Δ2-enoyl-CoA isomérase, Δ 3,5 Δ 2,4-dienoyl-CoA isomérase et enoyl-CoA hydratase de type 2 d'origine fongique ou mammalienne. J'ai établi la corrélation de l'expression de ces gènes dans Arabidopsis avec celle de gènes des enzymes du coeur de la ß-oxydation. En observant des chimères de fusion avec des protéines fluorescentes, j'ai démontré que les protéines identifiées sont localisées dans le péroxysomes, le seul organelle où la ß-oxydation se déroule chez les plantes. Des essais enzymatiques ont été conduits avec ces enzymes partiellement purifiées pour démontrer que les enzymes identifiées sont capables de catalyser in vitro les mêmes réactions que leurs orthologues non végétaux. Les activités des enzymes végétales in vivo ont été .démontrées par complémentation hétérologue des mutants de délétion correspondants de levure Saccharomyces cerevisiae. La visualisation de la complémentation est rendue possible par la synthèse de polyhydroxyalcanoate (PHA) dans les péroxysomes de levure. Les souches recombinantes expriment la PHA synthase de Pseudomonas aeruginosa modifiée pour être localisée dans le péroxysome produisent ce polymère qui sert de piège pour les 3-hydroxyacylCoAs intermédiaires de la ß-oxydation et qui reflète qualitativement et quantitativement la gamme de molécules qui subit la ß-oxydation. Cette complémentation a permis de démontrer que les Δ3, Δ2-enoyl-CoA isomérases, et la Δ3.5, Δ2,4-dienoyl-CoA isomérase végétales sont impliquées dans la dégradation des acides gras insaturés en position impaire. L'enoyl-CoA hydratase de type 2 monofonctionelle est une enzyme nouvelle chez les eucaryotes. La sous-expression du gène correspondant dans une lignée d'Arabidopsis modifiée pour produite du PHA dans le péroxysome a permis de démontrer que cette enzyme participe in vivo à la dégradation des acides gras ayant une double liaison en conformation cis (Z) en position paire.

WNT Signaling in Drosophila Neuromuscular Junctions

The Wnt -Wingless (Wg) in Drosophila- signaling is an evolutionary conserved, fundamental signal transduction pathway in animals, having a crucial role in early developmental processes. In the adult animal the Wnt cascade is mainly shut off; aberrant activation leads to cancer. One physiological exception in the adult animal is the activation of Wnt signaling in the nervous system. In the present work, we investigated Wg signaling in the Drosophila neuromuscular junctions (NMJs). The fly NMJs closely resemble the glutamatergic synapses in the mammalian central nervous system and serves as a model system to investigate the mechanism of synapse formation and stability. We demonstrate that the trimeric G-protein Go has a fundamental role in the presynaptic cell in the NMJ. It is implicated in the presynaptic Wg pathway, acting downstream of the ligand Wg and its receptor Frizzled2 (Fz2). Furthermore, we prove that the presynaptic Wg-Fz2-Gαo pathway is essential for correct NMJ formation. The neuronal protein Ankyrin2 (Ank2) localizes to the NMJ and has so far been considered to be a static player in NMJ formation, linking the plasma membrane to the cytoskeleton. We identify Ank2 as a direct target of Gαo. The physical and genetic interaction of Gαo with Ank2 represents a novel branch of the presynaptic Wg pathway, regulating the microtubule cytoskeleton in NMJ formation, jointly with the previously established Futsch-dependent branch, which controls microtubule stability downstream of the kinase Sgg (the homolog of GSK3ß). We moreover demonstrate that the Gαo-Ankyrin interaction to regulate the cytoskeleton is conserved in mammalian neuronal cells. Our findings therefore provide a novel, universally valid regulation of the cytoskeleton in the nervous system. Aberrant inactivation of the neuronal Wnt pathway is believed to be involved in the pathogenesis of the Aß peptide in Alzheimer's disease (AD). We modeled AD in Drosophila by expressing Aß42 in the nervous system and in the eye. Neuronal expression drastically shortens the life span of the flies. We prove that this effect depends on the expression specifically in glutamatergic neurons. However, Aß42 does not induce any morphological changes in the NMJ; therefore this synapse is not suitable to study the mechanism of Aß42 induced neurotoxicity. We furthermore demonstrate that genetic activation of the Wnt pathway does not rescue the Aß42 induced phenotypes - in opposition to the dominating view in the field. These results advice caution when interpreting data on the potential interaction of Wnt signaling and AD in other models. -- La voie de signalisation Wnt (Wingless (Wg) chez la drosophile) est conservée dans l'évolution et fondamentale pour le développement des animaux. Cette signalisation est normalement inactive chez l'animal adulte; une activation anormale peut provoquer le cancer. Or, ceci n'est pas le cas dans le système nerveux des adultes. La présente thèse avait pour but d'analyser le rôle de la voie de signalisation Wingless dans la plaque motrice de Drosophila melanogaster. En effet, cette plaque ressemble fortement aux synapses glutaminergiques du système nerveux central des mammifères et procure ainsi un bon modèle pour l'étude des mécanismes impliqués dans la formation et la stabilisation des synapses. Nos résultats montrent que la protéine trimérique Go joue un rôle fondamental dans la fonction de la cellule présynaptique de la plaque motrice. Go est en effet impliqué dans la voie de signalisation Wg, opérant en aval du ligand Wg et de son récepteur Frizzled2. Nous avons pu démontrer que cette voie de signalisation Wg-Fz2-Gαo est essentielle pour le bon développement et le fonctionnement de la plaque motrice. Fait intéressant, nous avons montré que la protéine neuronale Ankyrin2 (Ank2), qui est connue pour jouer un rôle statique en liant la membrane plasmique au cytosquelette dans la plaque motrice, est une cible directe de Gαo. L'interaction physique et génétique entre Gαo et Ank2 constitue ainsi une bifurcation de la voie de signalisation présynaptique Wg. Cette voie régule le cytosquelette des microtubules en coopération avec la branche liée à la protéine Futsch. Cette protéine est l'homologue de la protéine liant les microtubules MAP1B des mammifères et contrôle la stabilité des microtubules opérant en aval de la kinase Sgg (l'homologue de GSK3ß). De plus, la régulation du cytosquelette par l'interaction entre Gαo et Ankyrin est conservée chez les mammifères. Dans leur ensemble, nos résultats ont permis d'identifier un nouveau mode de régulation du cytosquelette dans le système nerveux, probablement valable de manière universelle. La voie de signalisation Wnt est soupçonnée d'être impliquée dans la toxicité provoquée par le peptide Aß dans le cadre de la maladie d'Alzheimer. Nous avons tenté de modéliser la maladie chez la drosophile en exprimant Aß42 spécifiquement dans le cerveau. Cette expérience a montré que l'expression neuronale d'Aß42 réduit la durée de vie des mouches de manière significative par un mécanisme impliquant les cellules glutamatergiques. Par contre, aucune modification morphologique n'est provoquée par Aß42 dans les plaques motrices glutamatergiques. Ces résultats montrent que ce modèle de Drosophile n'est pas adéquat pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. De plus, l'activation génétique de la voie de signalisation Wg n'a pas réussi à restaurer les phénotypes de survie ou ceux des yeux causés par Aß42. Ces résultats indiquent que l'implication de la voie de signalisation Wg dans la maladie d'Alzheimer doit être considérée avec prudence.

The L-Type Ca2+ and KATP channels may contribute to pacing-induced protection against anoxia-reoxygenation in the embryonic heart model

Rapport de synthèse : Implication des canaux Ca2+ de type L et des canaux KATP dans la protection induite par pacing dans un modèle de coeur embryonnaire soumis à l'anoxieréoxygénation. Contexte et but : le canal Ca2+ de type L, les canaux K+ du sarcolemme (sarcKatp) et de la mitochondrie (mitoKatp) interviennent dans le préconditionnement ischémique ou pharmacologique du myocarde. La présente étude cherche à déterminer dans quelle mesure ces canaux peuvent aussi jouer un rôle dans la cardioprotection induite par pacing. Méthodes :des coeurs d'embryons de poulet âgés de 4 jours ont été soumis in ovo à un pacing durant 12 heures, en pratiquant une stimulation électrique ventriculaire asynchrone intermittente à 110% de la fréquence cardiaque intrinsèque. Les coeurs contrôles (sham) et les coeurs stimulés ont ensuite été soumis in vitro à une période d'anoxie de 30 minutes, suivie d'une réoxygénation de 60 minutes. Les coeurs ont été exposés à l'agoniste du canal Ca2+ de type L (Bay-K-8644, BAY-K) ou à son bloqueur (vérapamil, VERAP), à l'antagoniste non sélectif des canaux KATP (glibenclamide, GLIB), ainsi qu'à l'agoniste du canal mitoKATP (diazoxide, DIAZO), ou à son antagoniste (5-hydroxydécanoate, 5-HD). L'électrocardiogramme, le délai électro-mécanique (DEM) reflétant le couplage excitation-contraction, ainsi que la contractilité myocardique ont été systématiquement déterminés pendant l'anoxieréoxygénation. Résultats : en normoxie, la fréquence cardiaque, l'intervalle QT, la conduction atrioventriculaire, le DEM et le raccourcissement ventriculaires étaient identiques dans les coeurs sham et les coeurs stimulés. Par contre, au cours de la réoxygénation post-anoxique, les arythmies cessaient plus précocément et le DEM ventriculaire retrouvait plus rapidement son niveau initial dans les coeurs stimulés, comparés aux sham. Dans les coeurs sham, BAY-K (mais pas le VERAP), DIAZO (mais pas le 5HD) ou GLIB accéléraient la récupération du DEM ventriculaire, reproduisant ainsi la protection induite par le pacing. En revanche, aucun de ces agents n'affectait la récupération des cceurs stimulés. Conclusion : un pacing ventriculaire chronique et intermittent délivré à une fréquence quasi physiologique améliore la tolérance myocardique à une anoxie-réoxygénation ultérieure. L'approche pharmacologique amontré qu'une activation discrète du canal Ca2+ de type L, une inhibition du canal sarcKATP et/ou une ouverture du canal mitoKATP peuvent contribuer à la cardioprotection induite par le pacing.

Mechanisms of CYR61 mediated breast cancer metastasis to the lung

CYR61 (Cysteine-rich angiogenic inducer 61) is a matricellular protein that regulates cell proliferation, adhesion, migration and cell survival through interaction with various types of integrin cell adhesion receptors. At tissue level it is implicated in the regulation of embryonic development, wound healing and angiogenesis. CYR61 has also been involved in cancer progression, however its role appears to be diverse and complex depending on the cancer type and stage. Its contribution to metastasis formation is still unclear. Previous findings reported by our laboratory demonstrated that CYR61 cooperates with avßs integrin to promote invasion and metastasis of cancers growing in a pre-irradiated microenvironment. In this work, we used an orthotopic model of breast cancer to show for the first time that silencing of CYR61 in breast cancer cells suppresses lung metastasis formation. Silencing of MDA-MB-231 reduced both local growth and lung metastasis formation of tumor cells implanted in a pre-irradiated mammary fat pad. CYR61 silencing in tumors growing in non-irradiated mammary fat pads did not impact primary tumor growth but decreased lung metastasis formation. The effect of CYR61 on spontaneous lung metastasis formation during natural cancer progression was further examined by using an experimental model of metastasis. Results from these experiments indicate that CYR61 is critically involved in promoting cancer cells entry into lung parenchyma rather than later steps of colonization. In vitro experiments showed that CYR61 promotes tumor cell spreading, migration and transendothelial migration. CYR61 also supported colony formation under anchorage-independent condition and promotes resistance to anoikis through the involvement of ß1 and ß3 integrin. These results indicate that CYR61 promotes lung metastasis of breast cancer by facilitating extravasation into lung parenchyma through enhanced motility, transendothelial migration and resistance to anoikis. - CYR61 (Cysteine-rich angiogenic inducer 61) est une protéine matricellulaire qui régule la prolifération, l'adhérence, la migration et la survie des cellules par son interaction avec différents types de récepteurs d'adhésion cellulaire de la famille des intégrine. Au niveau des tissus, CYR61 est impliquée dans la régulation du développement embryonnaire, de la cicatrisation et de l'angiogenèse. CYR61 a également été impliquée dans le cancer, mais son rôle semble être divers et complexe en fonction du type du cancer et de son stade. Son rôle dans la formation des métastases n'est pas encore clair. Des résultats antérieurs rapportés par notre laboratoire ont montré que CYR61 coopère avec l'intégrine avß5 pour favoriser l'invasion et la métastase de tumeurs se développant dans un micro-environnement pré-irradié. Dans ce travail, nous avons utilisé un modèle orthotopique de cancer du sein pour démontrer pour la première fois que l'extinction (silencing) du gène CYR61 dans le cancer du sein réduit la formation de métastases pulmonaires. L'extinction de CYR61 dans la lignée cellulaire de cancer du sein humain MDA-MB- 231 réduit à la fois la croissance local ainsi que la formation de métastases pulmonaires à partir de cellules implantés dans les coussinets adipeux mammaires pré-irradié. L'extinction de CYR61 dans des tumeurs grandissant dans les coussinets adipeux mammaires non irradiées n'a pas d'incidence sur la croissance tumorale primaire mais réduit la formation des métastases pulmonaires. Par la suite nous avons examiné l'effet de CYR61 sur la formation de métastases pulmonaires en utilisant un modèle expérimental de métastase. Les résultats de ces expériences indiquent que CYR61 est impliquée de manière cruciale dans les étapes précoces de la formation de métastases, plutôt que dans les étapes tardives de colonisation du poumon. Des expériences in vitro ont montré que CYR61 favorise l'étalement, la migration et la transmigration endothéliale des cellules tumorales. CYR61 favorise également la formation de colonies dans des conditions indépendante de l'ancrage et la résistance à l'anoïkis par l'engagement des intégrines ß1 et ß3. Ces résultats indiquent que CYR61 favorise les métastases pulmonaires du cancer du sein en facilitant l'extravasation dans le parenchyme pulmonaire grâce à la stimulation de la motilità, de la migration transmigration endothéliale et de la résistance à l'anoïkis.

Distribution of artifactual gas on post-mortem multidetector computed tomography (MDCT)

L'imagerie est de plus en plus utilisée en médecine forensique. Actuellement, les connaissances nécessaires pour interpréter les images post mortem sont faibles et surtout celles concernant les artéfacts post mortem. Le moyen radiologique le plus utilisé en médecine légale est la tomodensitométrie multi-coupes (TDMC). Un de ses avantages est la détection de gaz dans le corps. Cette technique est utile au diagnostic d'embolie gazeuse mais sa très grande sensibilité rend visible du gaz présent même en petite quantité. Les premières expériences montrent que presque tous les corps scannés présentent du gaz surtout dans le système vasculaire. Pour cette raison, le médecin légiste est confronté à un nouveau problème : la distinction entre du gaz d'origine post-mortem et une embolie gazeuse vraie. Pour parvenir à cette distinction, il est essentiel d'étudier la distribution de ces gaz en post mortem. Aucune étude systématique n'a encore été réalisée à ce jour sur ce sujet.¦Nous avons étudié l'incidence et la distribution des gaz présents en post mortem dans les vaisseaux, dans les os, dans les tissus sous-cutanés, dans l'espace sous-dural ainsi que dans les cavités crânienne, thoracique et abdominale (82 sites au total) de manière à identifier les facteurs qui pourraient distinguer le gaz post-mortem artéfactuel d'une embolie gazeuse¦Les données TDMC de 119 cadavres ont été étudiées rétrospectivement. Les critères d'inclusion des sujets sont l'absence de lésion corporelle permettant la contamination avec l'air extérieur, et, la documentation du délai entre le moment du décès et celui du CT-scan (p.ex. rapport de police, protocole de réanimation ou témoin). La présence de gaz a été évaluée semi-quantitativement par deux radiologues et codifiée. La codification est la suivante : grade 0 = pas de gaz, grade 1 = une à quelques bulles d'air, grade 2 = structure partiellement remplie d'air, grade 3 = structure complètement remplie d'air.¦Soixante-quatre des 119 cadavres présentent du gaz (62,2%), et 56 (75,7%) ont montré du gaz dans le coeur. Du gaz a été détecté le plus fréquemment dans le parenchyme hépatique (40%); le coeur droit (ventricule 38%, atrium 35%), la veine cave inférieure (infra-rénale 30%, supra-rénale 26%), les veines sus-hépatiques (gauche 26%, moyenne 29%, droite 22 %), et les espaces du porte (29%). Nous avons constaté qu'une grande quantité de gaz liée à la putréfaction présente dans le coeur droit (grade 3) est associée à des collections de gaz dans le parenchyme hépatique (sensibilité = 100%, spécificité = 89,7%). Pour décrire nos résultats, nous avons construit une séquence d'animation qui illustre le processus de putréfaction et l'apparition des gaz à la TDMC post-mortem.¦Cette étude est la première à montrer que l'apparition post-mortem des gaz suit un modèle de distribution spécifique. L'association entre la présence de gaz intracardiaque et dans le parenchyme hépatique pourrait permettre de distinguer du gaz artéfactuel d'origine post-mortem d'une embolie gazeuse vraie. Cette étude fournit une clé pour le diagnostic de la mort due à une embolie gazeuse cardiaque sur la base d'une TDMC post-mortem.¦Abstract¦Purpose: We investigated the incidence and distribution of post-mortem gas detected with multidetector computed tomography (MDCT) to identify factors that could distinguish artifactual gas from cardiac air embolism.¦Material and Methods: MDCT data of 119 cadavers were retrospectively examined. Gas was semiquantitatively assessed in selected blood vessels, organs and body spaces (82 total sites).¦Results: Seventy-four of the 119 cadavers displayed gas (62.2%; CI 95% 52.8 to 70.9), and 56 (75.7%) displayed gas in the heart. Most gas was detected in the hepatic parenchyma (40%); right heart (38% ventricle, 35% atrium), inferior vena cava (30% infrarenally, 26% suprarenally), hepatic veins (26% left, 29% middle, 22% right), and portal spaces (29%). Male cadavers displayed gas more frequently than female cadavers. Gas was detected 5-84 h after death; therefore, the post-mortem interval could not reliably predict gas distribution (rho=0.719, p<0.0001). We found that a large amount of putrefaction-generated gas in the right heart was associated with aggregated gas bubbles in the hepatic parenchyma (sensitivity = 100%, specificity = 89.7%). In contrast, gas in the left heart (sensitivity = 41.7%, specificity = 100%) or in peri-umbilical subcutaneous tissues (sensitivity = 50%, specificity = 96.3%) could not predict gas due to putrefaction.¦Conclusion: This study is the first to show that the appearance of post-mortem gas follows a specific distribution pattern. An association between intracardiac gas and hepatic parenchymal gas could distinguish between post- mortem-generated gas and vital air embolism. We propose that this finding provides a key for diagnosing death due to cardiac air embolism.