Gene expression profiling of human glioblastomas for the identification of predictive factors and characterisation of molecular mechanism implicated in response to therapy and outcome

ABSTRACT Poor outcome for glioblastoma patients is largely due to resistance to chemoradiation therapy. While epigenetic inactivation of MGMT mediated DNA repair is highly predictive for benefit from the alkylating agent therapy Temozolomide, additional mechanisms for resistance associated with molecular alterations exist. Furthermore, new concepts in cancer suggest that resistance to treatment may be linked to cancer stem cells that escape therapy and act as source for tumour recurrence. We determined gene expression signatures associated with outcome in glioblastoma patients enrolled in a phase II and phase III clinical trial establishing the new combination therapy of radiation plus concomitant and adjuvant Temozolomide. Correlating stable gene clusters emerging from unsupervised analysis with survival of 42 treated patients identified a number of biological processes associated with outcome. Most prominent, a gene cluster dominated by HOX genes and comprising PROM1, was associated with resistance. PROM1 encodes CD133, a marker for a subpopulation of tumour cells enriched for glioblastoma stem- like cells. The core of this correlated HOX cluster was comprised in the top genes of a "self-renewal signature" defined in a mouse model for MLL-AF9 initiated leukaemia. The association of the HOX gene cluster with tumour resistance was confirmed in two external data sets of 146 malignant glioma As additional resistance factors we identified over-expression of the epidermal growth factor receptor gene, EGFR, while increased gene expression related to biological features of tumour host interaction, including markers for tumour vascular and cell adhesion, and innate immune response, were associated with better outcome. The "self-renewal" signature associated with resistance to the new combination chemoradiation therapy provides first clinical evidence that glioma stem like cells may implicated in resistance in a uniformly treated cohort of glioblastoma patients. This study underlines the need to target the tumour stem cell compartment, and provides some testable hypothesis for biological mechanisms relevant for malignant behaviour of glioblastoma that may be targeted in new treatment approaches. Résumé Le glioblastome, tumeur cérébrale primaire maligne la plus fréquente, est connue pour son mauvais pronostique. Des avancées chimiothérapeutiques récentes avec des agents alkylants comme le témozolomide (TMZ), ont permis une amélioration notable dans la survie de certains patients. Les bénéficiaires ont la caractéristique commune de présenter une particularité génétique, la methylation du MGMT (methylguanine methyltransferase). Néanmoins, d'autres mécanismes de résistance en fonction des aberrations moléculaires existent. Nous avons établi les profils d'expressions génétiques des patients traités par irradiation et TMZ dans des études cliniques de phase II et III. En combinant des méthodes non-supervisées et supervisées, de l'étude de la cohorte des patients traités nous avons découvert des groupes de gènes associés à la survie. Un ensemble de gènes contenant les gènes Hox semble lié au mécanisme de résistance au traitement. Récemment, les gènes Hox ont été décrits comme faisant partie d"une signature d'autorenouvellement (self-renewal) des cellules souches cancéreuses de la leucémie. L'autorenouvellement est un processus grâce auquel les cellules souches se maintiennent tout au long de la vie. Cette association à la résistance est confirmée dans deux autres études indépendantes. Un autre facteur de résistance au traitement est la surexpression du gène EGFR. D'autre part, deux groupes de gènes associés à la relation entre hôte-tumeur tels que les marqueurs des vaisseaux tumoraux et de la réponse immunitaire innée s'avèrent avoir un effet positif sur la survie des patients traités. La découverte de la signature d'autorenouvellement comme facteur de résistance à la nouvelle chimio-radiothérapie offre une preuve clinique que les cellules souches cancéreuses sont impliquées dans la résistance au traitement. If est donc logique de penser que le traitement ciblé contre des cellules souches cancéreuses va dans l'avenir permettre des thérapies anticancéreuses plus performantes.

Recherche de l'expression de la lamine A et de la progérine chez des patients avec un syndrome myélodysplasique/syndrome myéloprolifératif avec thrombocytose

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) et myéloprolifératifs (SMP) sont des maladies qui touchent les cellules souches de la moelle hématopoïétique. Les symptômes varient selon le sous-type de SMD ou SMP allant de l'anémie à la polyglobulie, de la leucopénie à la leucocytose et de la thrombopénie à la thrombocytose. Ces syndromes se développent à la suite de mutations acquises qui provoquent des anomalies des cellules souches. En outre, plusieurs études ont mis en évidence des anomalies de processus épigénétiques comme l'hyperméthylation de l'ADN et la déacéthylation des histones. La maladie de Hutchinson-Gilford ou progéria est provoquée par une mutation sur le gène de la lamine A (protéine de l'enveloppe nucléaire) qui a pour conséquence l'augmentation de l'utilisation d'un site de splicing normalement peu utilisé ce qui engendre une protéine anormale, la progérine. Cette protéine a pour effet de modifier les processus épigénétiques. Une étude récente sur des patients souffrant de progéria a révélé la présence d'une thrombocytose chez tous les patients. Le but du présent travail a été d'étudier l'expression de la lamine A et de la progérine chez les patients souffrant de SMD ou SMP avec une thrombocytose suivis par le Service d'hématologie du CHUV. Nous avons sélectionné parmi les patients souffrant de SMD ou SMP ceux avec une thrombocytose supérieure à 400 G/l au moment du diagnostic. Nous avons ensuite effectué une PCR pour détecter la lamine A et la mutation de la lamine A que l'on trouve dans la progéria. Sur les 33 patients sélectionnés, nous avons pu analyser les échantillons de 18 d'entre eux. Le matériel était issu de cellules mononucléées ou de granulocytes. Les résultats démontrent la présence de la lamine A et l'absence de la mutation trouvée dans la progéria chez 16 patients. Cependant, chez 2 patients, la PCR laisse suspecter la présence de progérine en plus de celle de la lamine A. D'autres investigations seront nécessaires pour confirmer cette dernière observation. S'il s'avère que la progérine est effectivement présente chez ces deux patients, il faudrait étendre l'analyse à d'autres patients avec une hémopathie maligne. Plusieurs publications rapportent l'absence de lamine A dans les cellules hématopoïétiques. Cependant, le présent travail démontre clairement que les cellules mononucléées du sang ou de la moelle osseuse de certains patients avec SMP/SMD expriment la lamine A. Nous n'avons toutefois pas étudié si la lamine A et, éventuellement la progérine, sont exprimées par les cellules hématopoïétiques normales. En conclusion, ce travail a révélé qu'il serait très intéressant d'étudier le rôle potentiel des lamines nucléaires et en particulier de la lamine A et de la progérine dans l'hématopoïèse et le développement des SMD/SMP et d'autres hémopathies malignes. Il a donc ouvert la voie pour de futurs projets de recherche.

Retinal degeneration progression changes lentiviral vector cell targeting in the retina

Ce travail de thèse a été réalisé au sein de l'Unité de Thérapie Génique et Biologie des Cellules Souches de l'Hôpital Jules- Gonin dans le Service d'Ophtalmologie de l'Université de Lausanne. Ce laboratoire recherche des solutions thérapeutiques pour des maladies dégénératives et incurables de la rétine comme les rétinites pigmentaires (RP). Ayant déjà montré certains résultats dans le domaine, la thérapie génique a été notre outil pour ce travail. Cette méthode se base sur le principe de remplacer un gène déficient par sa copie normale, en transportant celle-ci au coeur même du noyau par un vecteur. Il existe à l'heure actuelle différents vecteurs. Un des plus efficaces est un vecteur viral non-réplicatif : le lentivirus, dérivé de HIV-1. Celui-ci a la capacité d'intégrer le génome de la cellule cible, lui conférant ainsi un nouveau matériel génétique. Notre but a été d'établir le tropisme du lentivirus dans une rétine en dégénérescence. Ce lentivirus est connu pour transduire efficacement les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien dans l'oeil adulte sain, ainsi que celles de la neurorétine, mais ce, uniquement durant le développement. On sait aussi que le vecteur lentiviral présente un tropisme différent selon les enveloppes dont il est muni ; par exemple, le lentivirus avec une enveloppe Mokola est connu pour transduire les cellules gliales du système nerveux central. La rétine qui dégénère montre quant à elle des changements de sa structure qui pourraient influencer la diffusion du vecteur et/ou son tropisme. Le postulat de base a été le suivant : chez l'adulte, la transduction des neurones de la rétine via le lentivirus pourrait être facilitée par l'altération de la membrane limitante externe induite par la dégénérescence (meilleure pénétrance du virus). D'un point de vue technique, nous avons utilisé deux types distincts de modèles murins de dégénérescence rétinienne : des souris Balb/C soumises à une dose toxique de lumière et les souris Rhodopsin knockout, animaux génétiquement modifiés. Comme vecteur viral, nous avons employé deux différents pseudotypes de lentivirus (caractérisés par les enveloppes virales) avec différents promoteurs (séquence d'ADN qui initie la transduction et confère la spécificité d'expression d'un gène). En changeant l'enveloppe et le promoteur, nous avons essayé de trouver la meilleure combinaison pour augmenter l'affinité du vecteur vis-à-vis des photorécepteurs d'abord, puis vis-à-vis d'autres cellules de la rétine. Nos résultats ont montré que la membrane limitante externe est effectivement altérée chez les deux modèles de dégénérescence, mais que cette modification ne favorise pas la transduction des photorécepteurs lorsqu'on utilise un vecteur lentiviral contenant une enveloppe VSVG et un promoteur photorécepteur-spécifique ou ubiquitaire. En effet, une forte réaction gliale a été observée. Par contre, en utilisant le lentivirus avec une enveloppe Mokola et un promoteur ubiquitaire, nous avons constaté une très bonne transduction au niveau des cellules de Millier dans la rétine en dégénérescence, phénomène non observé chez les souris sauvages. Ce travail a donc permis de trouver un vecteur viral efficace pour atteindre et transduire les cellules de Miiller, ceci seulement pendant la dégénérescence de la rétine. Ces cellules, une fois transduites, pourraient être utilisées pour sécréter dans la rétine des agents thérapeutiques tels que des facteurs neurotrophiques pour soutenir la survie des photorécepteurs ou des facteurs anti-angiogéniques pour prévenir la néo-vascularisation lors de diabète ou de dégénérescence maculaire liée à l'âge. - In normal mice, the lentiviral vector (LV) is very efficient to target the RPE cells, but transduces retinal neurons well only during development. In the present study, the tropism of LV has been investigated in the degenerating retina of mice, knowing that the retina structure changes during degeneration. We postulated that the viral transduction would be increased by the alteration of the iuter limiting membrane (OLM). Two different LV pseudotypes were tested using the VSVG arid the Mokola envelopes, as well as two animal models of retinal degeneration: light-damaged Balb-C and Rhodopsin knockout (Rho-/-) mice. After light damage, the OLM is altered and no significant increase of the number of transduced photoreceptors can be obtained with a LV-VSVG-Rhop-GFP vector. In the Rho-/- mice, an altération of the OLM was also observed, but the possibility of transducing photoreceptors was decreased, probably by ongoing gliosis. The use of a ubiquitous promoter allows better photoreceptor transduction, suggesting that photoreceptór-specific promoter activity change during late stages of photoreceptor degeneration. However, the number of targeted photoreceptors remains low. In contrast, LV pseudotyped with the tfokola envelope allows a wide dispersion of the ctor into the retina (corresponding to the injection bleb) with preferential targeting of Muller cells, a situation Mc\ does ot occur in the wild- type retina. Mokola-pseudotyped lentiviral vectors may serve to engineer these glial cells to deliver secreted therapeutic factors to a diseased area of the retina.

Mechanisms of spindle positioning during "Caenorhabditis elgans" asymmetric cell division

Résumé : Le positionnement correct du fuseau mitotique est crucial pour les divisions cellulaires asymétriques, car il gouverne le contrôle spatial de la division cellulaire et assure la ségrégation adéquate des déterminants cellulaires. Malgré leur importance, les mécanismes contrôlant le positionnement du fuseau mitotique sont encore mal compris. Chez l'embryon au stade une-cellule du nématode Caenorhabditis elegans, le fuseau mitotique est positionné de manière asymétrique durant l'anaphase grâce à l'action de générateurs de force situés au cortex cellulaire, et dont la nature était jusqu'alors indéterminée. Ces générateurs de force corticaux exercent une traction sur les microtubules astraux et sont dépendants de deux protéines Gα et de leurs protéines associées. Cette thèse traite de la nature de la machinerie responsable pour la génération des forces de tractions, ainsi que de son lien avec les protéines Gα et associées. Nous avons combiné des expériences de coupure par faisceau laser du fuseau mitotique avec le contrôle temporel de l'inactivation de gènes ou de l'exposition à des produits pharmacologiques. De cette manière, nous avons établi que la dynéine, un moteur se déplaçant vers l'extrémité négative des microtubules, ainsi que la dynamique des microtubules, sont toutes deux requises pour la génération efficace des forces de tractions. Nous avons démontré que les protéines Gα et leurs protéines associées GPR-1/2 et LIN-5 interagissent in vivo avec LIS-1, un composant du complexe de la dynéine. De plus, nous avons découvert que les protéines Gα, GPR-1/2 et LIN-5 promeuvent la présence du complexe de la dynéine au cortex cellulaire. Nos résultats suggèrent un mécanisme par lequel les protéines Gα permettent le recrutement cortical de GPR-1/2 et LIN-5, assurant ainsi la présence de la dynéine au cortex. Conjointement avec la dynamique des microtubules, ce mécanisme permet la génération des forces de tractions afin d'obtenir une division cellulaire correcte. Comme les mécanismes contrôlant le positionnement du fuseau mitotique et les divisions cellulaires asymétriques sont conservés au cours de l'évolution, nous espérons que les mécanismes élucidés par ce travail sont d'importance générale pour la génération de la diversité cellulaire durant le développement. De plus, ces mécanismes pourraient être applicables à d'autres divisions asymétriques, comme celle des cellules souches, dont le disfonctionnement peut entraîner la génération de cellules cancéreuses. Abstract : Proper spindle positioning is crucial for asymmetric cell division, because it controls spatial aspects of cell division and the correct inheritance of cell-fate determinants. However, the mechanisms governing spindle positioning remain incompletely understood. In the Caenorhabditis elegans one-cell stage embryo, the spindle becomes asymmetrically positioned during anaphase through the action of as-yet unidentified cortical force generators that pull on astral microtubules and that depend on two Gα proteins and associated proteins. This thesis addresses the nature of the force generation machinery and the link with the Gα and associated proteins. By performing spindle-severing experiments following temporally restricted gene inactivation and drug exposure, we established that microtubule dynamics and the minus-end directed motor dynein are both required for generating efficient pulling forces. We discovered that the Gα proteins and their associated proteins GPR-1/2 and LIN-5 interact in vivo with LIS-1, a component of the dynein complex. Moreover, we uncovered that LIN-5, GPR-1/2 and the Gα proteins promote the presence of the dynein complex at the cell cortex. Our findings suggest a mechanism by which the Gα proteins enable GPR-1/2 and LIN-5 recruitment to the cortex, thus ensuring the presence of cortical dynein. Together with microtubule dynamics, this allows pulling forces to be exerted and proper cell division to be achieved. Because the mechanisms of spindle positioning and asymmetric cell division are conserved across evolution, we expect the underlying mechanism uncovered here to be of broad significance for the generation of cell diversity during development. Moreover, this mechanism could be relevant for other asymmetric cell divisions, such as stem cell divisions, whose dysfunction may lead to the generation of cancer cells.

Role of Notch signaling in epidermis and appendages

Résumé Dans la peau, il a été montré que Notch1 induit l'arrêt de la prolifération et la différentiation des keratinocytes. L'inactivation de Notch1 cause une hyperplasie de l'épiderme et la formation de carcinomes basaux cellulaires. Notre groupe a principalement identifié deux voies de signalisations, la voie Shh et la voie Wnt, qui sont dérégulées en conséquence de l'inactivation de Notch1 dans la peau. Nous avons démontré l'habilité de Notch1 à réprimer la voie Wnt induite par ß-catenin dans les keratinocytes primaires ainsi que dans d'autres types de cellules épithéliales humaines. De plus, nous avons pu déterminer que Notch1 régule cette voie, probablement en favorisant la phosphorylation de ß-catenin par le complexe axin/APC/GSK-3ß. La protéine faisant partie de la voie Wnt, ou la protéine affectant la voie Wnt, qui est régulée par Notch1 est sujette à de plus amples investigations. Un autre but de cette étude a été l'identification de potentiels gènes cibles de Notch1 autres que ceux faisant partie des voies de signalisation Shh et Wnt précédemment évoquées. Ce projet fut abordé par l'analyse de puces à ADN (ISREC et Affymetrix) qui ont été utilisées pour des expériences de gain et de perte de fonction de Notch1 dans des keratinocytes prúmaires. En plus de l'hyperplasie épidermale, les souris Notch1 déficiente ont une perte importante de poils. Nous avons montré que Notch1 est nécessaire pour le développement et l'homéostasie des follicules pileux. En effet, l'inactivation du gène Notch1 mediée par l'activation des kératines 5 ou 14 dans l'épiderme, cause des défauts du cycle ainsi que de la structure des poils. De plus, d'autres appendices de la peau, comme les glandes sudoripares et de Meibomius, ont une structure anormale et sont non fonctionnelles dans les souris Notch1 déficiente. Finalement, nous avons observé que la déficience de Notch1 dans l'épithélium cornéen mène à la formation d'une plaque épidermale opaque sur la cornée. Basé sur l'hypothèse que le défaut des glandes de Meibomius des souris Notch1 déficientes cause des lésions de la surface oculaire, nous avons montré que Notch1 est essentiel pour la cicatrisation de la cornée. Lorsque Notch1 est absent, les cellules souches de l'épithélium cornéen ne sont plus capables de se différentier en cellules cornéennes, mais réparent la blessure en se différentiant en épiderme. Ce résultat indique que Notch1 est essentiel pour la différentiation de cellules souches de la cornée qui sont spécifiquement impliquées dans la réparation de la cornée. De plus, nous avons montré que l'expression de CRBP1 dans l'épithélium cornéen est diminuée en l'absence de Notch1, ceci étant possiblement à l'origine de la formation de la plaque épidermale. Abstract: In the skin, Notch1 has been shown to trigger cell growth arrest and differentiation of keratinocytes. Notch1 inactivation results in epidermal hyperplasia and subsequent formation of basal cell carcinoma-like (BCC-like) tumors. So far our group has identified two main pathways, the Shh and the Wnt pathway, that are deregulated as a consequence of Notch1 inactivation in the skin. We showed the ability of Notch1 to represses ß-catenin-mediated Wnt signaling in primary keratinocytes as well as in other types of human epithelial cells. In addition we were able to determine that Notch1 regulates this pathway possibly by enhancing ß-catenin phosphorylation by the axin/APC/GSK-3ß complex. The exact target protein of the Wnt pathway or target protein that affects the Wnt pathway, and that is regulated by Notch1, is subject of current investigation. Another aim of this study was the identification of possible Notch1 target genes in addition to those of the Shh and Wnt signaling pathways. This was addressed by gene chip analysis using ISREC as well as Affymetrix microarrays for gain and loss of function of Notch1 in mouse primary keratinocytes. In addition to epidermal hyperplasia, Notch1 deficient mice show an important hair loss. We showed that Notch1 is required for postnatal development and homeostasis of hair follicles. Indeed, keratin5 or keratinl4-driven Cre recombinase-mediated inactivation of the Notch1 gene in the epidermis causes perturbations of the hair cycle and structural defects of the hair follicle. Moreover, other skin appendages, like the sweat and Meibomian glands show abnormal morphology and are not functional in the Notch 1 deficient mice. Finally, we observed that Notch1 deficiency in the corneal epithelium leads to the formation of an epidermal corneal plaque. Based on the hypothesis that the Meiboinian gland defect in the Notch1 deficient mice results in lesions of the eye surface, we showed that Notch1 is essential for wound-healing of the cornea. In absence of Notch1 the stem cells of the corneal epithelium are no longer able to differentiate in the corneal fate but instead repair the wound by differentiating into skin-like epidermis. This result indicated that Notch1 is essential for the differentiation of corneal stem cells specifically implicated in corneal wound-healing. Moreover, we showed that CRBP1 expression in the corneal epithelium was lost in the absence of Notch1, possibly being at the origin of plaque formation.

Endogenous and exogenous regulation of monocyte responses

Mononuclear phagocytes are essential for the innate response to pathogens and for the repair of injured tissue. The cells - which can be broadly divided into circulating monocytes and tissue-resident macrophages and dendritic cells - are selectively equipped to protect the host by mediating pleiotropic and tissue-specific functions. The properties of some mononuclear phagocytes, however, also contribute to the development and the progression of inflammatory diseases. Consequently, current research investigates mononuclear phagocytes into greater detail with the aim to clarify their contributions to pathophysiologic inflammation. Recent studies indicate that circulating monocytes can be divided into distinct populations, which differ in their tissue tropism and functional commitment. Also, tissue macrophages and dendritic cells have been found to adopt context-dependent phenotypes, which can range from "pro-" to "anti-" inflammatory. These findings have markedly contributed to our understanding of the functional heterogeneity of mononuclear phagocyte populations. Yet, in many cases, the factors that control the quantity and/or quality of phagocyte responses in vivo remain largely unknown. The goal of this thesis was to identify cell endogenous and cell exogenous factors that dictate the fate of mononuclear phagocyte populations. To this end we made use of the recent identification of phenotypic markers, which permit to track mononuclear cell types and their lineage precursors. A main approach consisted to define candidate regulatory factors of certain types of mononuclear phagocytes and then to manipulate the expression of these factors in mice so as to address their functions and causal contributions on mononuclear phagocyte lineages in vivo. Human patient material was further used to validate findings. First, we investigated a microRNA and a transcription factor as candidate cell endogenous co- regulators of monocyte subset responses. Second, we studied a tumor-derived hormone as a candidate exogenous factor that amplifies the production of a population of mononuclear phagocytes with tumor-promoting functions. The endogenous and exogenous factors identified in this research appear to act as effective regulators of mononuclear phagocyte responses in vivo and thus may be exploited in future therapeutic approaches to regulate disease-associated inflammation. - Les phagocytes mononucléaires sont essentiels pour la réponse innée aux pathogènes et pour la réparation des tissus lésés. Ces cellules - qui peuvent être largement divisées en deux groupes, les monocytes circulant dans le sang et les macrophages et cellules dendritiques résidant dans les tissus - sont capables de protéger l'hôte en exerçant des fonctions pléiotropiques. Cependant, les propriétés de certains phagocytes mononucléaires contribuent également au développement et à la progression des maladies inflammatoires. Par conséquent, la recherche actuelle étudie les phagocytes mononucléaires plus en détail afin de clarifier leurs contributions à l'inflammation pathophysiologique. Des études récentes indiquent que les monocytes circulants peuvent être divisés en populations distinctes, qui diffèrent dans leur tropisme tissulaire et dans leurs fonctions biologiques. En outre, les macrophages et les cellules dendritiques peuvent adopter des phénotypes dépendants de l'environnement dans lequel ils se trouvent; ces phénotypes peuvent aller du type "pro-" au type "anti-" inflammatoire. Ces récentes découvertes ont contribué à notre compréhension sur l'hétérogénéité fonctionnelle des phagocytes mononucléaires. Pourtant, dans de nombreux cas, les facteurs qui contrôlent la quantité et/ou la qualité des réponses produites par ces cellules restent encore largement inconnus. L'objectif de cette thèse a consisté à identifier de nouveaux facteurs (endogènes ou exogènes) qui contrôlent les phagocytes mononucléaires. Dans ce but, nous avons fait usage de l'identification récente de marqueurs qui permettent d'identifier différents types de phagocytes mononucléaires ainsi que des cellules (souches) dont ils sont issus. Notre approche a consisté à définir des facteurs candidats qui pourraient contrôler certains phagocytes mononucléaires, puis à manipuler l'expression de ces facteurs chez la souris de manière à tester leurs fonctions et leur contributions in vivo. Nous avons également utilisé des échantillons biologiques de patients pour vérifier nos résultats chez l'homme. Tout d'abord, nous avons étudié un microARN et un facteur de transcription pour déterminer si ces deux facteurs opèrent en tant que co-régulateurs d'un certain type de monocytes. Deuxièmement, nous avons considéré une hormone produite par certaines tumeurs afin d'examiner son rôle dans la production d'une population de macrophages qui favorisent la progression des tumeurs. Les facteurs endogènes et exogènes identifiés dans cette recherche semblent agir comme régulateurs dominants de réponses produites par certains phagocytes mononucléaires et pourraient donc être exploités dans de futures approches thérapeutiques afin de contrôler les réponses immunitaires inflammatoires associées a certaines maladies.

Role of notch signalling in mammary gland

ÁBSTRACT : Mammary gland is composed of two main epithelial cell types, myoepithelial and luminal. The mechanisms involved in determination and maintenance of them remain poorly understood. Notch signaling is known to regulate cell fate determination in other tissues like skin and nervous system. It was also shown that it can act as tumor suppressor or oncogene depending on the tissue type. The mouse models overexpressing active Notch receptors indicated that Notch signaling is oncogenic in the mammary gland. This observation was followed by some descriptive and functional studies in human breast cancer and it was reported that Notch signaling activity or expression of its components are increased in some of the breast tumor samples compared to normal tissue. However, the physiological role of the Notch signaling and its downstream mechanisms in mammary gland is poorly defined. p63, a member of p53 family, has been implicated in the cell fate determination of keratinocytes. Knockout mouse models revealed that p63 is required for the formation of the mammary anlagen in embryo and its ΔN isoform is expressed exclusively in the myoepithelial layer of the adult breast. In order to understand its function in normal breast epithelial cells, I activated Notch signaling by expression of Notch1 intracellular domain (NICD) in normal primary human breast epithelial cells (HBECs). In this context, NICD reduced growth of HBECs and led to downmodulation of extracellular matrix-receptor interaction network (ECM) components as well as ΔNp63. Expression of ΔNp63 together with NICD partially rescued Notch induced growth reduction, which was correlated with an increase in ECM components. Moreover, silencing ΔNp63 in myoepithelial HBECs reduced growth similar to Notch activation and it led to downregulation of myoepithelial and upregulation of luminal markers. Complementing this observation, forced expression of ONp63 in luminal HBECs induced myoepithelial phenotype and decreased luminal markers. In vivo, by the analysis of a Notch reporter mouse strain, I showed that Notch is activated during puberty specifically at the sites of ductal morphogenesis, terminal end buds. FAGS analysis revealed that it can be detected in two different populations based on CD24 expression (low (lo) or high (high)): at lower levels in CD24lo, which includes stem/progenitor and myoepithelial cells and higher levels in CD24hi, which contains luminal cells. In parallel with in vitro results, the CD24lo mouse mammary epithelial cells displaying Notch activity have lower levels of p63 expression. Furthermore, deletion of RBPjk, the main mediator of Notch signaling, or the overexpression of ΔNp63 inhibited luminal cell lineage in vivo. Another important point revealed by Notch reporter mouse strain is the simultaneous activation of Notch with estrogen signaling during pubertal development. The expression of FOXA1, the mediator of estrogen receptor (ER) transcriptional activity, is correlated with Notch activation in vivo that it is lower in CD24lo than in CD24hi cells. Moreover, FOXA1 is regulated by NICD in vitro supporting the presence of a link between Notch and ER signaling. Taken together, I report that Notch signaling is involved in luminal cell fate determination and its effects are partially mediated through inhibition of ONp63. Besides, ΔNp63 is required for the maintenance and sufficient for the induction of myoepithelial phenotype in HBECs in vitro and is not compatible with luminal lineage in vivo. Based on these results, I propose a model for epithelial cell hierarchy in mammary gland, whereby there are two different types of luminal progenitors, early and late, displaying different levels of Notch activity. Notch signaling contributes to the determination of luminal cell lineage in these two progenitor steps: In "Early Luminal Progenitor" stage, it inhibits myoepithelial fate by decreasing p63 expression, and in "Late Luminal Progenitor" stage, Notch signaling is involved in induction of luminal lineage by acting on ER-FOXA1 axis. It has to be investigated further whether Notch signaling might behave as an oncogene or tumor suppressor depending on which cell type in the epithelial hierarchy it is modulated and which one is more likely to occur in different human breast cancer types. RÉSUMÉ : La glande mammaire est composée de deux types principaux de cellules: les cellules luminales, qui bordent le lumen et les cellules myoépithéliales, qui se trouvent entre la lame basale et les cellules luminales. Les mécanismes intervenant dans leur différenciation et leur maintenance demeurent encore mal compris. La protéine transmembranaire Notch est connue pour déterminer le destin des cellules dans plusieurs types de tissus comme la peau ou le système nerveux. Selon le type de tissu dans lequel se trouve Notch, il agira soit comme un suppresseur de tumeur soit comme un oncogène. A l'aide de modèles de souris surexprimant les récepteurs actifs de Notch, il a été démontré que la voie de signalisation de Notch est oncogénique au niveau de la glande mammaire. Des études descriptives et fonctionnelles dans le cadre du cancer du sein ont permis de mettre en évidence une augmentation de l'activité de Notch ou de l'expression de ces composants dans certains tissus cancéreux. Toutefois, le rôle physiologique de Notch et des mécanismes qu'il active restent méconnus. P63, une protéine membre de la famille p53, est impliquée dans la différenciation des kératinocytes. Le modèle issu de l'étude des souris p63 knockout a révélé que cette protéine est requise pour la formation des primordia mammaires chez l'embryon et que son isoforme ΔNp63 est exclusivement exprimée dans la couche myoépithéliale de la glande mammaire adulte. Dans le but de comprendre les fonctions physiologiques de Notch, je l'ai activé en exprimant le domaine intracellulaire de Notch 1 (NICD) dans des cellules épithéliales primaires de glande mammaire humaine (HBECs). Le NICD a alors réduit la croissance des HBECs et conduit à la régulation négative non seulement de p63 mais également des composants du réseau d'interaction des récepteurs de la matrice extracellulaire (ECM). En exprimant conjointement ΔNp63 et NICD, il est apparu que la réduction de croissance induite par Notch était partiellement compensée, et qu'il y avait également une augmentation des composants ECM. De plus, lorsque ΔNp63 a été inactivé dans les cellules HBECs myoépithéliales, une réduction de croissance cellulaire identique à celle provoquée par l'activation de Notch a pu être mise en évidence, de même qu'une régulation négative des marqueurs myoépithéliaux ainsi qu'une augmentation des marqueurs luminaux. Afin de compléter ces informations, l'expression de ΔNp63 a été forcée dans les HBECs luminales, ce qui a induit un phénotype myoépithélial et une diminution des marqueurs lumineux. In vivo, par l'analyse de souris ayant un gène rapporteur de l'activité de Notch, j'ai démontré que Notch est activé pendant la puberté au niveau des sites de la morphogenèse canalaire, à savoir les bourgeons terminaux. Les analyses par FACS (Fluorescence-activated cell sorting) basées sur l'expression de l'antigène CD24 ont révélé qu'il peut tre détecté dans deux populations différentes : une population qui l'exprime faiblement, qui regroupe les cellules souches/progéniteurs et les cellules myoépithéliales, et une population qui l'exprime fortement qui est composé des cellules luminales. Parallèlement aux résultats in vitro, j'ai mis en évidence un faible niveau d'expression de p63 dans les cellules épithéliales de la glande mammaire de souris, exprimant faiblement l'antigène CD24 et présentant une activité de Notch. De plus, la délétion de RBPjr~, médiateur principal de la signalisation de Notch, ainsi que la surexpression de ΔNp63 in vivo ont inhibé la lignée des cellules luminales. Un autre point important révélé par les souris rapporteur de l'activité de Notch a été l'activation simultanée de Notch et de la signalisation de l'oestrogène pendant le développement pubertaire. L'expression de FOXA1, médiateur de l'activité transcriptionnelle des récepteurs aux oestrogènes (ER), est en corrélation avec l'activation de Notch in vivo, plus basse dans les cellules avec une faible expression de l'antigène CD24 que dans celles avec une forte expression. De plus, FOXA1 est régulé par NICD in vitro confirmant la présence d'un lien entre Notch et la signalisation des ER. En résumé, la signalisation de Notch est impliquée dans la détermination du destin cellulaire des cellules luminales et ses effets sont partiellement modifiés par l'inhibition de ΔNp63. ΔNp63 est requis pour la maintenance et est suffisant pour l'induction du phénotype myoépithéliale dans les HBECs in vitro et ne peut donc pas se trouver dans les cellules luminales in vivo. Basé sur ces résultats, je propose un modèle de hiérarchisation des cellules épithéliales de la glande mammaire, dans lequel sont présents deux types de progéniteurs des cellules luminales exprimant des niveaux différents d'activité de Notch, les progéniteurs lumineux précoces et tardifs. La signalisation de Notch contribue à la différenciation de la lignée cellulaire luminale au niveau de ces deux progéniteurs : dans la forme précoce, il inhibe la différenciation des cellules myoépithéliales en réduisant l'expression de p63 et dans la forme tardive, Notch est impliqué dans l'induction de la lignée luminale en agissant sur l'axe ER-FOXA1. Il serait nécessaire d'investiguer plus loin si le fait que Notch agisse comme oncogène ou suppresseur de tumeur dépend du stade de différenciation de la cellule dans laquelle il est modulé et laquelle de ces deux fonctions il est le plus probable de rencontrer dans les différents types de cancer du sein.

High-dose therapy and autologous hematopoietic stem cell transplantation in T-cell lymphoma : a single centre experience

Le diagnostic de lymphome représente 4% de tous les cancers et a une incidence particulièrement élevée dans les pays industrialisés. La proportion de lymphomes T, évaluée en Europe et aux Etats Unis, représente environ 5 à 10% des lymphomes. Alors que des progrès très sensibles ont été apportés dans la prise en charge et le pronostic des lymphomes B agressifs durant ces dernières décennies et en particulier depuis le début des années 2000 avec l'utilisation des anticorps anti-CD20 associés à la chimiothérapie, le pronostic des lymphomes T reste très décevant. La survie globale des lymphomes T à 5 ans est estimée entre 28% et 38%. Le bénéfice réel d'une chimiothérapie intensive suivie d'une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques périphériques au terme d'un traitement de chimiothérapie d'induction dans le lymphome T périphérique reste débattu. Les résultats des rares études prospectives et des études rétrospectives à disposition sont discordants. Nous avons donc analysé rétrospectivement 43 patients successifs de mars 2000 à mars 2011, atteints de lymphome T, issus de notre base de données du programme autogreffe lausannois. Nos analyses statistiques permettent, sur la base d'un suivi médian de 63 mois, une estimation à 12 ans, de la survie globale de nos patients à 40%, de la survie sans progression à 34% et de la survie sans événement à 30%. Ces chiffres s'inscrivent parfaitement dans les résultats des études prospectives qui montrent un bénéfice de l'autogreffe dans le lymphome T. Parmi les différents paramètres pronostiques habituellement évalués, l'âge et l'absence de symptômes B au diagnostic sont les seuls paramètres statistiquement significatifs en analyse univariée dans notre cohorte. En effet, Les patients de moins de 50 ans et ceux qui ne présentent pas de symptômes B au diagnostic ont un meilleur pronostic. Nous concluons de cette analyse que les patients traités par chimiothérapie intensive et autogreffe de cellules souches hématopoïétiques périphériques ont une survie moyenne supérieure aux résultats rapportés dans la littérature avec des traitements de chimiothérapie conventionnelle de type CHOP. En effet, on estime à environ 50% les patients répondant à une chimiothérapie conventionnelle de type CHOP.

Role of β-catenin and γ-catenin in haematopoiesis : Generation of floxed Delta like 4 gene targeted mice

Résumé La voie de signalisation de Wnt est extrêmement conservée au cours de l'évolution. Les protéines Wnt sont des molécules sécrétées qui se lient à la famille de récepteurs Frizzled. Cette interaction mène à la stabilisation de la protéine β-caténine, qui va s'accumuler dans le cytoplasme puis migrer dans le noyau où elle peut s'hétérodimériser avec les facteurs de transcription de la famille TCF/LEF. Il a été démontré que cette voie de signalisation joue un rôle important durant la lymphopoïèse et de récents résultats suggèrent un rôle clé de cette voie dans le renouvellement des Cellules Souches Hématopoïétique (CSH). Des études se basant sur un système de surexpression de protéines montrent clairement que la voie Wnt peut influencer l'hématopoïèse. Cependant, le rôle de la protéine β-caténine dans le système hématopoïétique n'a jamais été testé directement. Ce projet de thèse se propose d'étudier la fonction de la protéine β-caténine par sa délétion inductible via le système Cre-loxP. De façon surprenante, nous avons pu démontrer que les progéniteurs de la moelle osseuse, déficients en β-caténine, ne montrent aucune altération dans leur capacité à s'auto-renouveler et/ou à reconstituer toutes les lignées hématopoïétiques (myéloïde, érythroïde et lymphoïde) dans les souris-chimères. De plus, le développement, la survie des thymocytes ainsi que la prolifération des cellules T périphériques induite par un antigène, sont indépendants de β-caténine. Ces résultats suggèrent soit que la protéine β-caténine ne joue pas un rôle primordial dans le système hématopoiétique, soit que son absence pourrait être compensée par une autre protéine. Un candidat privilégié susceptible de se substituer à β-caténine, serait plakoglobine, aussi connu sous le nom de γ-caténine. En effet, ces deux protéines partagent de multiples caractéristiques structurelles. Afin de démontrer que la protéine γ-caténine peut compenser l'absence de β-caténine, nous avons généré des souris dans lesquelles, le système hématopoïétique est déficient pour ces deux protéines. Cette déficience combinée de β- caténine et γ-caténine ne perturbe pas la capacité des Cellules Souche Hématopoïétique-Long Terme (CSH-LT) de se renouveler, par contre elle agit sur un progéniteur précoce déjà différencié de la moelle osseuse. Ces résultats mettent en évidence que la protéine γ-caténine est capable de compenser l'absence de protéine β-caténine dans le système hématopoïétique. Par conséquent, ce travail contribue à une meilleure connaissance de la cascade Wnt dans l'hématopoïèse. Summary The canonical Wnt signal transduction pathway is a developmentally highly conserved. Wnts are secreted molecules which bind to the family of Frizzled receptors in a complex with the low density lipoprotein receptor related protein (LRP-5/6). This initial activation step leads to the stabilization and accumulation of β-catenin, first in the cytoplasm and subsequently in the nucleus where it forms heterodimers with TCF/LEF transcription factor family members. Wnt signalling has been shown to be important during early lymphopoiesis and has more recently, been suggested to be a key player in self-renewal of haematopoietic stem cells (HSCs). Although mostly gain of function studies indicate that components of the Wnt signalling pathway can influence the haematopoietic system, the role of β-catenin has never been directly investigated. The aim of this thesis project is to investigate the putatively critical role of β-catenin in vivo using the Cre-loxP mediated conditional loss of function approach. Surprisingly, β-catenin deficient bone marrow (BM) progenitors arc not impaired in their ability to self-renew and/or to reconstitute all haematopoietic lineages (myeloid, erythroid and lymphoid) in both mixed and straight bone marrow chimeras. In addition, both thymocyte development and survival, and antigen-induced proliferation of peripheral T cells are β- catenin independent. Our results do not necessarily exclude the possibility of an important function for β-catenin mediated Wnt signalling in the haematopoietic system, it rather raises the question that β-catenin is compensated for by another protein. A prime candidate that may take over the function of β-catenin in its absence, is the close relative plakoglobin, also know as γ-catenin. This protein shares multiple structural features with β-catenin. In order to investigate whether γ-catenin can compensate for the loss of β-catenin we have generated mice in which the haematopoietic compartment is deficient for both proteins. Combined deficiency of β-catenin and γ-catenin does not perturb Long Term-Haematopoietic Stem Cells (LT-HSC) self renewal, but affects an already lineage committed progenitor population within the BM. Our results demonstrate that y-catenin can indeed compensate for the loss of β-catenin within the haematopoietie system.

The biology of cancer stem cells : part 1: nuclear translocation of CD44 : part 2: IMP2 in glioblastoma cancer stem cells

SummaryCancer stem cells (CSC) are poorly differentiated, slowly proliferating cells, with high tumorigenic potential. Some of these cells, as it has been shown in leukemia, evade chemo- and radiotherapy and recapitulate the tumor composed of CSC and their highly proliferative progeny. Therefore, understanding the molecular biology of those cells is crucial for improvement of currently used anti-cancer therapies.This work is composed of two CSC-related projects. The first deals with CD44, a frequently used marker of CSC; the second involves Imp2 and its role in CSC bioenergetics. PART 1. CD44 is a multifunctional transmembrane protein involved in migration, homing, adhesion, proliferation and survival. It is overexpressed in many cancers and its levels are correlated with poor prognosis. CD44 is also highly expressed by CSC and in many malignancies it is used for CSC isolation.In the present work full-lenght CD44 nuclear localization was studied, including the mechanism of nuclear translocation and its functional role in the nucleus. Full-length CD44 can be found in nuclei of various cell types, regardless of their tumorigenic potential. For nuclear localization, CD44 needs to be first inserted into the cell membrane, from which it is transported via the endocytic pathway. Upon binding to transportinl it is translocated to the nucleus. The nuclear localization signal recognized by transportinl has been determined as the first 20 amino acids of the membrane proximal intracellular domain. Nuclear export of CD44 is facilitated by exportin Crml. Investigation of the function of nuclear CD44 revealed its implication in de novo RNA synthesis.PART 2. Glioblastoma multiforme is the most aggressive and most frequent brain malignancy. It was one of the first solid tumors from which CSC have been isolated. Based on the similarity between GBM CSC and normal stem cells expression of an oncofetal mRNA binding protein Imp2 has been investigated.Imp2 is absent in normal brain as well as in low grade gliomas, but is expressed in over 75% GBM cases and its expression is higher in CSC compared to their more differentiated counterparts. Analysis of mRNA transcripts bound by Imp2 and its protein interactors revealed that in GBM CSC Imp2 may be implicated in mitochondrial metabolism. Indeed, shRNA mediated silencing of protein expression led to decreased mitochondrial activity, decreased oxygen consumption and decreased activity of respiratory chain protein complex I. Moreover, lack of Imp2 severely affected self-renewal and tumorigenicity of GBM CSC. Experimental evidence suggest that GBM CSC depend on mitochondrial oxidative phosphorylation as an energy producing pathway and that Imp2 is a novel regulator of this pathway.RésuméLes cellules cancéreuses souches sont des cellules peu différentiées, à proliferation lente et hautement tumorigénique. Ces cellules sont radio-chimio résistantes et sont capable reformer la tumeur dans sont intégralité, reproduisant l'hétérogénéité cellulaire présent dans la tumeur d'origine. Pour améliorer les therapies antitumorales actuelles il est crucial de comprendre les mécanismes moléculaires qui caractérisent cette sous-population de cellules hautement malignes.Ce travail de thèse se compose de deux projets s'articulant autour du même axe :Le CD44 est une protéine multifonctionnelle et transmembranaire très souvent utilisée comme marqueur de cellules souches tumorales dans différents cancers. Elle est impliquée dans la migration, l'adhésion, la prolifération et la survie des cellules. Lors de ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés à la localisation cellulaire du CD44, ainsi qu'aux mécanismes permettant sa translocation nucléaire. En effet, bien que principalement décrit comme un récepteur de surface transmembranaire, le CD44 sous sa forme entière, non clivée en peptides, peut également être observé à l'intérieur du noyau de diverses cellules, quel que soit leur potentiel tumorigénique. Pour passer ainsi d'un compartiment cellulaire à un autre, le CD44 doit d'abord être inséré dans la membrane plasmique, d'où il est transporté par endocytose jusqu'à l'intérieur du cytoplasme. La transportai permet ensuite la translocation nucléaire du CD44 via une « séquence signal » contenue dans les 20 acides aminés du domaine cytoplasmique qui bordent la membrane. A l'inverse, le CD44 est exporté du noyau grâce à l'exportin Crml. En plus des mécanismes décrits ci-dessus, cette étude a également mis en évidence l'implication du CD44 dans la synthèse des ARN, d'où sa présence dans le noyau.Le glioblastome est la plus maligne et la plus fréquente des tumeurs cérébrales. Dans ce second projet de recherche, le rôle de IMP2 dans les cellules souches tumorales de glioblastomes a été étudié. La présence de cette protéine oncofoetale a d'abord été mise en évidence dans 75% des cas les plus agressifs des gliomes (grade IV, appelés glioblastomes), tandis qu'elle n'est pas exprimée dans les grades I à III de ces tumeurs, ni dans le cerveau sain. De plus, IMP2 est apparue comme étant davantage exprimée dans les cellules souches tumorales que dans les cellules déjà différenciées. La baisse de l'expression de IMP2 au moyen de shRNA a résulté en une diminution de l'activité mitochondriale, en une réduction de la consommation d'oxygène ainsi qu'en une baisse de l'activité du complexe respiratoire I.L'inhibition de IMP2 a également affecté la capacité de renouvellement de la population des cellules souches tumorales ainsi que leur aptitude à former des tumeurs.Lors de ce travail de thèse, une nouvelle fonction d'un marqueur de cellules souches tumorales a été mise en évidence, ainsi qu'un lien important entre la bioénergétique de ces cellules et l'expression d'une protéine oncofoetale.

Canonical WNT signaling in hematopoiesis and leukemia

SummaryCanonical Wnt signaling is crucial for embryonic development and the homeostasis of certain adult tissues such as the gut and the skin. The role of canonical Wnt signaling in hematopoiesis is still debated. The expression of a dominant-active β-catenin in hematopoietic stem cells (HSCs) enhances the self-renewal capacity of HSCs but is detrimental for long-term hematopoiesis. In contrast, loss of function experiments show that absence of β- and γ-catenin does not impair steady-state hematopoiesis. It has been argued that the inducible deletion of β-catenin using the IFN-responsive Mx promoter may somehow influence stem cell fate. Herein we used the constitutive deletion of β-catenin specifically in hematopoietic cells to show that the absence of β- catenin, as well as γ-catenin deletion, does not impair normal hematopoiesis and self-renewal capacity of HSCs.Dysregulation of canonical Wnt signaling is causal for several types of cancer, including colon carcinoma or breast cancer. Recently, it was found that Wnt signal transduction was upregulated in certain leukemias. Based on these data, we have investigated whether β- and γ-catenin play a role for the induction of leukemias by oncogenic BCR-ABL translocation product. We show that the induction of B-ALL (B cell acute lymphocytic leukemia) is strongly reduced in the absence of γ-catenin, while the induction of CML (chronic myeloid leukemia) occurs at a normal rate. In the combined absence of β- and γ-catenin the induction of both CML and B-ALL is essentially blocked. Consistent with these data others have found that β-catenin is essential for the induction of CML by BCR-ABL.Collectively, we find that β- and γ-catenin are dispensable for normal hematopoiesis but essential for the development of BCR-ABL induced leukemias. These findings suggest that the canonical Wnt pathway may represent a promising target for the therapy of leukemia.RésuméLa voie de signalisation canonique Wnt est essentielle pour le développement embryonnaire ainsi que l'homéostasie de certains tissus adultes, comme les intestins et la peau. Le rôle de la voie canonique Wnt pour l'hématopoïèse est encore incertain. D'un coté l'expression d'une forme active de β-catenine dans les cellules souches de la moelle augmente leur potentiel d'auto- renouvellement mais est préjudiciable pour l'hématopoïèse à long terme. Par contre, l'absence de β- et γ-catenine n'empêche pas le déroulement normal de l'hématopoïèse. La façon dont est supprimée β-catenine, en utilisant le promoteur IFN-inductible Mx, pourrait influencer le sort des cellules souches. Ici nous détruisons β-catenine spécifiquement dans les cellules hématopoïétiques de manière constitutive et montrons que, en combinaison avec l'absence de γ-catenine, l'absence de β-catenine n'affecte pas le déroulement normal de l'hématopoïèse et la capacité des cellules souches de la moelle à se renouveler.Plusieurs sortes de cancers, comme celui du colon ou du sein, sont parfois dus à une dérégulation de la voie canonique Wnt. Récemment, certaines leucémies ont présenté une activation du signal Wnt. A partir de ces données, nous avons examiné si β- et γ-catenine jouent un rôle dans l'induction des leucémies causées par le produit de translocation BCR-ABL. Nous avons montré que l'induction de la leucémie aiguë lymphoïde de cellules Β (LAL-B) est grandement diminuée en l'absence de γ-catenin, alors que l'induction de la leucémie myéloïde chronique (LMC) n'est pas affectée. En l'absence des deux catenines, l'induction des deux leucémies LAL-B et LMC est presque complètement bloquée. En confirmation de nos données, un autre groupe a montré que β-catenine est essentielle pour le développement de la LMC. Ensemble, ces données nous montrent que β- et γ-catenine ne sont pas nécessaires pour l'hématopoïèse normale, mais essentielle pour le développement des leucémies induites par BCR-ABL. Cela suggère que la voie de signalisation canonique Wnt est une cible prometteuse pour de futures thérapies.

Initiation de l'adhésion leucocytaire : rôle des fucosyltransférases et des ligands des sélectines

RESUME La dissémination extramédullaire des cellules blastiques est une complication majeure des leucémies myéloïdes (LMA) ou lymphoïdes aiguës (LLA). La migration des cellules blastiques dépend de mécanismes semblables à ceux qui régulent la migration des leucocytes dans un site d'inflammation. Parmi ceux-ci, les oligosaccharides fucosylés décorant les ligands des sélectines jouent un rôle clé en interagissant avec les sélectines. PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1) est une protéine de 240 kD, exprimée à la surface des leucocytes, permettant de soutenir le roulement leucocytaire sur les sélectines, le long de la paroi vasculaire. L'interaction de PSGL-1 avec les sélectines nécessite des modifications post-traductionnelles de type sialylation, sulfatation , N et 0-glycosylation. Parmi les enzymes impliqués, les α1,3-fucosyltransférases jouent un rôle important dans la biosynthèse d'oligosaccharides fucosylés, ligands des sélectines (sLex, Lex, VIM-2, CLA). Comme l'expression des α1,3-fucosyltransférases par les cellules blastiques leucémiques n'a pas été étudiée précédemment, nous l'avons recherchée dans 120 cas de leucémies aiguës. Les ARNm des FucT-IV et -VII ont été détectés, par RT-PCR, dans tous les cas testés. L'ARNm de la FucT-IX n'a été observé que dans 40% des leucémies aiguës (48/120). L'ARNm de la FucT-IX est détecté dans 65% des LMA (47/72) et, moins fréquemment, dans 26% des LLA (11/42). A noter que les cas de LLA exprimant la FucT-IX correspondent essentiellement à des LLA secondaires à la transformation d'une leucémie myéloïde chronique ou des LLA de la lignée B de type leucémie/lymphome de Burkitt. L'expression de PSGL-1 et des oligosaccharides fucosylés par les blastes varie significativement parmi les LMA et les LLA : Lex, VIM-2 et sLex étant exprimés plus fréquemment par les myéloblastes que par les lymphoblastes. Le rôle des FucT-IV, -VII et -IX dans la synthèse des Lex, VIM-2, CLA et sLex a été examiné en exprimant l'ADNc de chaque FucT dans des cellules CHO. L'immunophénotypisation des transfectants indique que la FucT-VII synthétise sLex et CLA, mais pas Lex et VIM-2. Lex et VIM-2 sont générés par la FucT-IV. La FucT-IX ne participe qu'à la synthèse de Lex, sa capacité de synthèse de VIM-2 dans les cellules CHO est très faible. Le rôle de la FucT-IX dans la régulation du roulement cellulaire dépendant des sélectines a été testé dans des conditions de flux. Les vitesses de roulement des cellules CHO co-exprimant la FucT-LX, la core-2 01,6-N-acetylglucosaminyltransferase et PSGL-1 sont très élevées sur la P-sélectine (médiane : 497.95 µm/s, n=96) alors qu'elles sont beaucoup plus lentes sur la E-sélectine (médiane 7 µm/s, n=64). Les recrutements sur la E-sélectine des cellules CHO-C2F9PSGL¬1 et des CHO-C2F7PSGL-1 sont similaires (moyenne ± SEM : 127.44 ± 4.38 vs. 151.16 ± 3.16 cellules/min/mm2, n=5). Celui des cellules CHO-C2F4PSGL-1 est par contre plus faible (54.20 ± 2.13 cellules/min/mm2, n=5). Ces résultats indiquent que la FucT-IX est impliquée dans la biosynthèse de Lex, VIM-2 et CLA et qu'elle régule l'interaction des cellules CHO avec la E-sélectine. Contrairement aux FucT-IV et -VII, la FucT-IX ne joue qu'un rôle mineur dans la régulation du roulement cellulaire sur la L- et la P-sélectine. L'expression fréquente de la FucT-IX par les myéloblastes suggère qu'elle pourrait participer avec les FucT-IV et -VII à la régulation de la migration cellulaire dépendant de la E-sélectine. Finalement, ce travail de thèse a été étendu à l'identification des protéines cytoplasmiques qui interagissent avec le domaine cytoplasmique de PSGL-1 et qui pourraient être impliquées dans la transmission de signaux intracellulaires. Les ligands intracellulaires de PSGL-1 seront identifiés par la technique du double hybride qui nous a déjà permis de confirmer que syk et la N-moésine se lient au domaine cytoplasmique de PSGL-1. Des ligands supplémentaires seront identifiés employant une librairie provenant des cellules souches hématopoïétiques comme proie. ABSTRACT Blast cell dissemination is a major complication of acute myeloblastic (AML) and lymphoblastic leukemia (ALL). Blast cell migration is dependent on mechanisms that are similar to those which regulate leukocyte migration into inflammatory lesions. Among them, fticosylated oligosaccharides that decorate selectin ligands play a key role by interacting with selectins. PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1) is a 240 kD glycoprotein constitutively expressed on leucocytes and which supports leukocyte rolling on selectins. PSGL-1 interaction with selectins is dependent on post-translational modifications such as sialylation, sulfation, N- and 0-glycosylation. Among the involved enzymes, the α1,3-fucosyltransferases (FucT) play a major role in generating cell surface glycoconjugates carrying fucosylated oligosaccharides which interact with selectins (sLex, Lex, VIM-2, CLA). Since no information is available on the expression of α1,3-fucosyltransferases by leukemic blast cells, we examined it in 120 cases of acute leukemia. FucT-IV and -VII mRNAs were detected, by RT-PCR, in all tested cases. In contrast, the presence of FucT-IX mRNA was shown in only 40% of patients with acute leukemia (48/120). FucT-IX mRNA was detected in 65% of AML (47/72) and, less frequently, in 26% of ALL (11/42). Importantly, all ALL cases expressing FucT-IX were either secondary leukemia resulting from the transformation of chronic myelocytic leukemia in acute lymphoblastic leukemia or mature B-ALL (FAB L3 subtype or Burkitt lymphoma/leukemia according to WHO classification). FucT-IX was not detected in precursor B or T-ALL. The expression of PSGL-1 and fucosylated epitopes was significantly different among AML and ALL, Lex, VIM-2 and sLex being more frequently expressed by myeloblasts than by lymphoblasts. The role of FucT-IV, -VII and -IX in the biosynthesis of Lex, VIM-2, CLA and sLex was examined by expressing the cDNA of each α1,3-FucT in CHO cells. Immunophenotypic analysis of CHO transfectants indicated that FucT-VII synthesizes sLex and CLA but not Lex or VIM-2. Lex and CLA were generated by both FucT-IV and -IX. FucT-IV and FucT-IX differed in their ability to synthesize VIM-2, FucT-IX being less efficient than FucT-IV. The role of FucT-IX in regulating selectin-dependent rolling was assessed under hydrodynamic flow conditions. P-selectin-dependent interactions were transient and occurred at high velocities (median: 497.95 1,µm/s, n=96). In contrast, much slower rolling velocities were observed on E-selectin (median: 7 µm/s, n=64). The recruitment of CHO-C2F9PSGL-1 and CHO-C2F7PSGL-1 cells was similar on E-selectin (mean ± SEM: 127.44 ± 4.38, n=5 vs 151.16 ± 3.16 cells/min/mm2, n=5). In the other hand, CHO-C2F4PSGL-1 cells were less efficiently recruited on E-selectin (54.20 ± 2.13 cells/min/mm2, n=5). This results indicate that FucT-IX is involved in the biosynthesis of Lex, VIM-2 and CLA and that it confers E-selectin binding activity to CHO cells. By contrast to FucT-IV and -VII, FucT-IX had a minor role in regulating P- and L-selectin-dependent rolling on CHO transfectants. The frequent expression of FucT-IX in myeloblasts suggests that it may participate with FucT-IV and -VII in regulating E-selectin-dependent cell migration into tissues. Finally, this thesis work was extended to the identification of the cytoplasmic proteins interacting with cytoplasmic domain of PSGL-1 that may be involved in transducing intracellular signals. We planned to identify these intracellular ligands of PSGL-1 by using the double hybrid technique and already confirmed that syk and N-moesin bind to the cytoplasmic domain of PSGL-1. Additional PSGL-1 ligands will be sought by the same technique using a CD34+ stem cell library as pray. RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC : L'adhésion et la migration leucocytaire sont nécessaires à de nombreux processus cellulaires comme la régulation de l'hématopoïèse, mais aussi dans la pathogenèse de l'artériosclérose, des maladies inflammatoires et de la métastatisation des cellules cancéreuses. Les molécules impliquées constituent depuis peu des cibles pour la thérapie du cancer. La migration leucocytaire vers un site d'inflammation dépend de mécanismes complexes, se déroulant en plusieurs étapes, nécessitant l'interaction séquentielle de molécules d'adhésion leucocytaires et endothéliales. Ainsi, chronologiquement, suite à un stimulus inflammatoire, les leucocytes « roulent » sur les cellules endothéliales, sont activées, s'arrêtent et traversent la paroi endothéliale (diapédèse) pour migrer dans les tissus environnants inflammés selon un gradient chimiotactique. La première étape de roulement met en jeu deux molécules principales : PSGL-1 (P-Sélectine Glycoprotéine Ligand-1) du coté des leucocytes et les sélectines du coté de l'endothélium de la paroi vasculaire. L'interaction entre ces deux molécules nécessite des décorations de ces protéines par des sucres, des résidus sulfates et des acides sialiques. Le sucre essentiel à la liaison demeure le fucose qui est attaché aux protéines grâce à des enzymes de la famille des fucosyltransferases. Actuellement, neuf fucosyltransférases humaines ont été identifiées et désignées sous FucT-I à IX. La FucT-IX, dernière fucosyltransférase clonée, a un faible degré d'homologie avec les autres fucosyltransférases mais sa séquence est extrêmement conservée entre les espèces. Ceci traduit son importance par une forte résistance à la pression évolutive. L'examen de son expression au sein de 120 cas de leucémies aiguës a mis en évidence son comportement atypique. En effet, alors que les autres FucTs sont toujours présentes, la FucT¬IX ne s'exprime que dans un cas sur deux en moyenne avec une préférence plus importante pour les leucémies myéloïdes. Ainsi, une étude plus approfondie de cet enzyme à mis en évidence sa capacité à induire une interaction cellulaire plus spécifique de la E-sélectine. Elle décore non seulement des protéines de surface, mais aussi certainement les glycolipides constituant la membrane cellulaire.

Innate immune responses to "Aspergillus fumigatus"

AbstractAspergillus fumigatus is a ubiquitous mould that can cause invasive aspergillosis, a potentially lethal infection in onco-hematological patients. With an incidence rate ranging from 5 to 15%, invasive aspergillosis (IA) is one of the most frequent infections in patients undergoing intensive myeloablative chemotherapy for acute leukaemia or allogenic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Toll-like receptors (TLRs) are transmembrane proteins located in immune cells, such as macrophages sand dendritic cells, that detect molecular motifs from invading pathogens to initiate immune response mechanisms. Studies suggested a role for TLR2 and TLR4 in the detection of A. fumigatus. However, few data are available on the role of TLR1 and TLR6, both known as TLR2 co-receptors, in innate immune responses to this pathogen.In this study, we used an immunogenic mutant strain of A. fumigatus, together with a wild-type strain, to analyse the role of TLRs and their signalling pathways in the innate immune response to this mould. We show for the first time that this response involves both TLR1 and TLR6 in mouse and TLR1, but not TLR6, in human. We show that, despite the high sequence homology between TLR1 and TLR6, the specificity in the sensing of A. fumigatus relies on the human TLR1 and TLR6 ectodomains. Furthermore, we show that two human single nucleotide polymorphisms (SNPs) (G1805T [S6021] and G239C [R80T]) affect the response to this pathogen. Our work also confirms the role of TLR2 and TLR4 in the detection of A. fumigatus, together with their co-receptors CD 14 and MD2, in both mouse and human, and highlights the nature of the intracellular signaling pathway used by these receptors to mediate the immune response against this pathogen.This study provides a comprehensive analysis of the role of TLRs and their signalling pathways in the innate immune recognition of A. fumigatus and may have important consequences for diagnosis, management and treatment of IA in high risk patients.RésuméAspergillus fumigatus est un champignon saprophyte ubiquitaire qui peut causer l'aspergillose invasive (AI), une infection potentiellement mortelle chez les patients onco-hématologiques. Avec un taux d'incidence de 5 à 15%, l'AI est l'une des infections les plus fréquentes chez les patients subissant une chimiothérapie intensive pour une leucémie aiguë ou une allogreffe de cellules souches hématopoïétiques. Les récepteurs Toll-like (Toll-like receptors, TLRs) sont des protéines transmembranaires placés stratégiquement à la surface de certaines cellules immunitaires, comme les macrophages et les cellules dendritiques. Ces protéines sont capables de détecter des motifs moléculaires à la surface des pathogènes et de déclencher la réponse immunitaire innée. Des études ont suggéré l'implication de TLR2 et TLR4 dans la détection dΆ. fumigatus. Cependant, peu de données sont disponibles sur le rôle de TLR1 et TLR6, qui sont les co-récepteurs de TLR2, dans ce mécanisme de défense immunitaire.Dans cette étude, nous avons utilisé une souche particulièrement immunogénique d'A. fumigatus, ainsi qu'une souche sauvage, pour analyser l'implication des récepteurs TLRs dans la réponse immunitaire à ce champignon filamenteux. Nous montrons pour la première fois que cette détection implique TLR1 et TLR6 chez la souris, et TLR1, mais pas TLR6, chez l'homme. Nous montrons également que la spécificité de détection chez l'homme est due à des séquences spécifiques du domaine extra- membranaire de TLR1 et TLR6, et que des polymorphismes mono-nucléotidiques du récepteur (G1805T [S602I] and G239C [R80T]) influencent la réponse à ce pathogène. Nous confirmons également l'implication de TLR2 et TLR4, avec leurs co-récepteurs CD14 et MD2, dans la détection d'A. fumigatus, chez l'homme et la souris, et mettons en évidence les voies de signalisation cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire à ce pathogène.Ces nouvelles connaissances sur le rôle des TLRs et de leurs voies de signalisation cellulaire dans la détection immunitaire innée d'A. fumigatus pourraient influencer le diagnostic, la prévention et le traitement de l'AI chez les patients à haut risque de développer cette infection.

The role of the c-myc gene in pigment cell development and homeostasis

Résumé La dérégulation de c-Myc est un événement fréquent de la transformation cellulaire. Une régulation positive de cette oncoprotéine a été démontrée dans divers mélanomes cutanés primaires et métastatiques et est associée à un pronostic défavorable (Grover et al., 1996; Zhuang et al., 2008). c-Myc est considéré comme une molécule centrale impliquée dans plusieurs processus de l'homéostasie cellulaire. En raison de sa contribution importante dans la progression tumorale, la fonction de c-Myc a été étudiée intensément. Cependant nous connaissons peu le rôle de ce facteur de transcription dans l'embryogenèse et dans la spécification tissulaire. Un déficit total de c-Myc pendant l'embryogenèse conduit à la mort embryonnaire avant 10.5 jours de gestation. Cette mort est causée par de multiples imperfections du développement touchant la taille de l'embryon, le coeur, le péricarde, le tube neural et les cellules sanguines (Davis et al., 1993; Trumpp et al., 2001). Récemment, il a été montré que la plupart de ces anomalies sont secondaires et résultent d'une insuffisance du placenta dans les embryons c-myc-/- (Dubois et al., 2008). Sachant que c-Myc est important dans la maintenance des lignées de la crête neurale (Wei et al., 2007), nous nous sommes intéressés au rôle de c-Myc dans le développement des cellules pigmentaires et à leur homéostasie après la naissance. Un allèle floxé de c-myc (Trumpp et al., 2001) a été utilisé pour supprimer ce gène spécifiquement dans la lignée mélanocytaire à l'aide d'une souris transgénique Tyr::Cre (Delmas et al., 2003). L'ablation des deux allèles de c-myc dans les mélanocytes des souris c-myccKO conduit au phénotype de grisonnement des poils, observé directement après la naissance et associé à une diminution du nombre de mélanocytes dans le bulbe des follicules pileux. Les cellules pigmentaires restantes expriment les marqueurs mélanogéniques (Tyr, TRP-1, Dct and MITF) et semblent être fonctionnelles puisqu'elles peuvent produire et transférer la mélanine. De plus, la capacité de prolifération des mélanocytes déficients en c-Myc dans le bulbe des follicules pileux ne semble pas être affectée chez les nouveaux-nés. Les cellules souches mélanocytaires sont présentes, mais en nombre réduit, dans le bulge des follicules pileux à la fin de la morphogenèse chez les souris c-myccKO âgées de huit jours. Ces cellules sont maintenues sans changement durant le premier cycle pileux (vérifié à l'âge de trente jours), ce qui sous-entend que la fonction de c-Myc n'est pas nécessaire pour ce processus. Ceci explique pourquoi, en supposant que des cellules souches mélanocytaires fonctionnelles sont présentes dans la peau, nous n'observons pas de dilution de couleur de la robe liée à l'âge. Cependant, la présence de ces cellules souches mélanocytaires dans la peau c-myccKO ne suffit pas à assurer une quantité normale de mélanocytes différenciés dans le bulbe des follicules pileux. Cette population de cellules pigmentaires matures est sévèrement affectée par la suppression de c-Myc, ce qui contribue amplement au phénotype de grisonnement des poils. De plus, c-Myc paraît être important pour le développement des mélanocytes. Ainsi, le nombre de mélanoblastes diminue dans les embryons c-myccKO à partir du douzième jour de gestation. A treize jours de gestation, au stade où les mélanoblastes pénètrent dans l'épiderme et prolifèrent, les mélanoblastes déficients en c-Myc ne s'adaptent pas aux signaux de prolifération et se retrouvent en nombre réduit dans l'épiderme. Finalement, nous nous sommes intéressés, au rôle de N-Myc, un homologue proche de c-Myc, dans la lignée mélanocytaire. Nos expériences ont montré que. N-Myc était superflu pour le développement et l'homéostasie des mélanocytes, une seule copie du gène c-myc étant suffisante pour maintenir une pigmentation normale de la robe des souris c-mycc-myccKO/+~N_ myccKO/KO. Cependant, le rôle essentiel de N-Myc dans la maintenance des cellules mélanocytaires précurseurs apparaît lorsque c-Myc est absent, puisque la suppression simultanée des deux Myc résulte en une perte complète de la coloration de la robe. Ceci implique la présence d'un mécanisme compensatoire entre c- et N-Myc dans la lignée mélanocytaire, avec un rôle prédominant de c-Myc. Summary Deregulation of c-Myc is known to be a common event in cellular transformation. Upregulation of this oncoprotein was shown in a variety of primary and metastatic cutaneous melanomas and has been associated with a poor prognosis (Grover et al., 1996; Zhuang et al., 2008). c-myc is seen as a central molecule involved in many aspects of cellular homeostasis. c-Myc function has been intensively studied mostly because of its significant contribution to tumour progression. However little is known on the role of this transcription factor in embryogenesis and tissue specification. Complete loss of c-Myc during embryogenesis results in embryonic death before E10.5 due to multiple developmental defects including embryonic size, heart, pericardium, neural tube and blood cells (Davis et al., 1993; Trumpp et al., 2001). Recently it was discovered that most of these abnormalities are secondary and results of placental insufficiency in c-Myc-/- embryos (Dubois et al., 2008). Here, we focused on the role of c-Myc in pigment cell development and homeostasis after birth, knowing that c-Myc is important in the maintenance of neural crest lineages (Wei et al., 2007). A floxed allele of c-Myc (Trumpp et al., 2001) was used to specifically delete this gene in the melanocyte lineage using Tyr::Cre transgenic mice (Delmas et al., 2003). Removal of both c-Myc alleles in melanocytes of c-MyccKO mouse led to the grey hair phenotype which is seen directly after birth and was associated with a decrease in the melanocyte number in the bulb of the hair follicle. The remaining population of pigment cells express melanogenic markers (Tyr, TRP-1, Dct and MITF) and seem functionally normal since they can produce and transfer melanin. Furthermore proliferation capacity of c-Myc deficient melanocytes in the bulb of hair follicle seems not to be affected in newborn animals. Melanocyte stem cells (MSCs) are present but reduced in numbers in the bulge of the hair follicle at the end of morphogenesis in 8 days old c-MyccKO mice. These cells are maintained through the first hair cycle (as verified at P30) without any further changes, suggesting that c-Myc function is not required for this process. This explains why we did not detect any agerelated coat color dilution, assuming a presence of functional MSCs in the skin. Importantly, presence of MSCs in c-MyccKO skin was not sufficient for assuring a normal number of differentiated melanocytes in the bulb of the hair follicle. This population of mature pigmented cells is severely affected upon c-myc deletion thus largely contributing to the grey hair phenotype. Moreover, c-Myc appears to be important for melanocyte development. Thus, melanoblast number is affected in c-MyccKO embryos day 12 of gestation onwards. At E13.5, when melanoblasts enter the epidermis and proliferate, c-myc deficient melanoblasts failed to adapt to proliferation signals and are therefore reduced in number in the epidermis. Finally, we addressed the role of N-Myc, a closest homologue of c-Myc, in the melanocyte lineage. In these experiments, N-Myc was dispensable for melanocyte development and homeostasis, and even one copy of the c-myc gene was sufficient to maintain normal coat color pigmentation in c-mycc-mycCKO/+ ,N-myccKO/KO mice. However the crucial role of N-Myc in maintenance of melanocyte precursor cells became apparent when c-myc is eliminated since simultaneous deletion of both Myc results in complete loss of coat color pigmentation. This suggests compensatory mechanisms between c- and N-Myc with a predominant role of c-Myc in melanocyte lineage.

Role of lymph node fibroblasts in T cell priming

SummarySecondary lymphoid organs, such as lymph nodes or spleen, are the only places in our body where primary adaptive immune responses are efficiently elicited. These organs have distinct Β and Τ cell rich zones and Τ lymphocytes constantly migrate from the bloodstream into Τ zones to scan dendritic cells (DCs) for antigens they present. Specialized fibroblasts, the Τ zone reticular cells (HR.Cs), span the Τ zone in the form a three-dimensional network. lK.Cs guide incoming Τ cells in their migration, both chemically, by the secretion of the chemokines CCL19 and CCL21, and physically, by construction of a road system to which also DCs adhere. In this way TRCs are thought to facilitate encounters of Τ cells with antigen-bearing DCs and thereby accelerate the selection of rare antigen-specific Τ cells. The resulting Τ cell activation, proliferation and differentiation all take place within the TRC network. However, the influence of TRCs on Τ cell activation has so fer not been elucidated with the possible reasons being that TRCs represent a relative rare cell population and that mice devoid of TRCs have not been described.To circumvent these technical limitations, we established TRC clones and lines to have an abundant source to functionally characterize TRCs. Both the clones and lines show a fibroblastic phenotype, express a surface marker profile comparable to ex vivo TRCs and produce extracellular matrix molecules. However, expression of Ccl19, Ccl21 and ZL-7 is lost and could not be restored by cytokine stimulation. When these TRC clones or lines were cultured in a three-dimensional cell culture system, their morphology changed and resembled that of in vivo TRCs as they formed networks. By adding Τ cells and antigen-loaded DCs to these cultures we successfully reconstructed lymphoid Τ zones that allowed antigen-specific Τ cell activation.To characterize the role of TRCs in Τ cell priming, TRCs were co-cultured with antigen-specific Τ cells in the presence antigen-loaded DCs. Surprisingly, the presence of TRC lines and ex vivo TRCs inhibited rather than enhanced CD8+ Τ cell activation, proliferation and effector cell differentiation. TRCs shared this feature with fibroblasts from non-lymphoid tissues as well as mesenchymal stromal cells. TRCs were identified as a strong source of nitric oxide (NO) thereby directly dampening Τ cell expansion as well as reducing the Τ cell priming capacity of DCs. The expression of inducible NO synthase (iNOS) was up- regulated in a subset of TRCs by both DC-signals as well as interferon-γ produced by primed CD8+ Τ cells. Importantly, iNOS expression was induced during viral infection in vivo in both lymph node TRCs and DCs. Consistent with a role for NO as a negative regulator, the primary Τ cell response was exaggerated in iNOS-/- mice. Our findings highlight that in addition to their established positive roles in Τ cell responses TRCs and DCs cooperate in a negative feedback loop to attenuate Τ cell expansion during acute inflammation.RésuméLes organes lymphoïdes secondaires, comme les ganglions lymphoïdes ou la rate, sont les seuls sites dans notre corps où la réponse primaire des lymphocytes Β et Τ est initiée efficacement. Ces organes ont des zones différentes, riches en cellules Β ou T. Des lymphocytes Τ circulent constamment du sang vers les zones T, où ils échantillonent la surface des cellules dendritiques (DCs) pour identifier les antigènes qu'ils présentent. Des fibroblastes spécialisés - nommés Τ zone reticular cells (TRCs)' forment un réseau tridimensionnel dans la zone T. Les TRCs guident la migration des cellules Τ par deux moyens: chimiquement, par la sécrétion des chimiokines CCL19 et CCL21 et physiquement, par la construction d'un réseau routier en trois dimensions, auquel adhèrent aussi des DCs. Dans ce? cas, on pense que la présence des TRCs facilite les rencontres entre les cellules Τ et les DCs chargées de l'antigène et accélère la sélection des rares cellules Τ spécifiques. Ensuite, l'activation de cellules T, ainsi que la prolifération et la différenciation se produisent toutes à l'intérieur du réseau des TRCs. L'influence des TRCs sur l'activation des cellules T n'est que très peu caractérisée, en partie parce que les TRCs représentent une population rare et que les souris déficientes dans les TRCs n'ont pas encore été découvertes.Pour contourner ces limitations techniques, nous avons établi des clones et des lignées cellulaires de TRC pour obtenir une source indéfinie de ces cellules permettant leur caractérisation fonctionnelle. Les clones et lignées établis ont un phénotype de fibroblaste, ils expriment des molécules de surface similaires aux TRCs ex vivo et produisent de la matrice extracellulaire. Mais l'expression de Ccl19, Ccl21 et 11-7 est perdue et ne peut pas être rétablie par stimulation avec différentes cytokines. Les clones TRC ou les lignées cultivées en un système tridimensionnel de culture cellulaire, montrent une morphologie changée, qui ressemble à celle de TRC ex vivo inclus la construction de réseaux tridimensionnels.Pour caractériser le rôle des TRC dans l'activation des cellules T, nous avons cultivé des TRCs avec des cellules T spécifiques et des DCs chargées avec l'antigène. Etonnamment, la présence des TRC (lignées et ex vivo) inhibait plutôt qu'elle améliorait l'activation, la prolifération et la différenciation des lymphocytes T CDS+. Les TRCs partageaient cette fonction avec des fibr-oblastes des organes non lymphoïdes et des cellules souches du type mésenchymateux. Dans ces conditions, les TRCs sont une source importante d'oxyde nitrique (NO) et par ce fait limitent directement l'expansion des cellules T et réduisent aussi la capacité des DCs à activer les cellules T. L'expression de l'enzyme NO synthase inductible (ïNOS) est régulée à la hausse par des signaux dérivés des DCs et par l'interféron-γ produit par des cellules T de type CD8+ activées. Plus important, l'expression d'iNOS est induite pendant une infection virale in vivo, dans les TRCs et dans les DCs. Par conséquent, la réponse primaire de cellules T est exagérée dans des souris iNOS-/-. Nos résultats mettent en évidence qu'en plus de leur rôle positif bien établi dans la réponse immunitaire, les TRCs et les DCs coopèrent dans une boucle de rétroaction négative pour atténuer l'expansion des cellules T pendant l'inflammation aigiie pour protéger l'intégrité et la fonctionnalité des organes lymphoïdes secondaires.