Étude de l'influence de l'activité inflammatoire liée au TNFα sur les altérations cognitives et comportementales et le dépôt de plaques β amyloïdes chez la souris

Résumé Les mutations du gène APP (amyloïde de la protéine de précurseur) sur le chromosome 21 mènent à une surproduction de protéines β amyloïdes dans la maladie d'Alzheimer (MA). Il existe donc un consensus impliquant la cascade amyloïde dans la genèse et le développement de la MA. C'est pourquoi, afin d'évaluer l'hypothèse de la cascade inflammatoire de la MA, on combine des manipulations génétiques chez des modèles de souris transgéniques avec des traitements anti-inflammatoires. Les animaux porteurs d'une mutation génétique induite permettent d'évaluer le rôle de certains gènes dans le développement de la maladie. Pour ce faire j'ai étudié les performances de différentes cohortes de souris soumises à un ensemble de trois épreuves comportementales complémentaires ; la première étudiant les conduites exploratoires, la deuxième évaluant la capacité de l'animal à effectuer un apprentissage de lieu et la troisième explorant l'efficacité des animaux dans une tâche dite d'élimination. Enfin, une évaluation complémentaire a été fondée sur le répertoire des troubles du comportement des animaux. Chez les animaux APP homozygotes, l'organisation de la mémoire se dégrade et se modifie avec l'âge. Chez ces animaux, le déficit des mémoires de références et de travail se manifeste déjà chez les souris jeunes (dès l'âge de 50 jours).De plus, il est apparu un certain nombre de troubles comportementaux. Enfin les APP homozygotes sont ceux qui ont le plus de dépôt de plaques amyloïdes localisé dans l'hippocampe. Chez les animaux APP hétérozygotes, tant la mémoire de référence, utilisée au cours d'un apprentissage de lieu, que la mémoire de travail permettant d'éviter des bras déjà visités, ne sont affectées que chez les sujets de 15 mois. De plus, tous les troubles du comportement sont présents à 15 mois, mais de manière moins intense que chez les animaux APP homozygotes. Un traitement anti-TNF administré aux APP hétérozygotes n'a pas permis d'améliorer leur performance mais a un effet bénéfique sur les troubles du comportement. Enfin, le pourcentage des dépôts de plaques a été estimé à trois fois moins élevé chez ces animaux hétérozygotes de 16 mois que chez les APP homozygotes de 8 mois. Chez les animaux APP hétérozygotes dont le gène TNFα est bloqué, les mémoires de travail et de référence sont altérées déjà à l'âge de 6 mois, en dépit du blocage de l'expression de TNF. Ces jeunes animaux ont même une capacité cognitive inférieure à celle des animaux hétérozygotes APP, en gardant toutefois leur activité et performance exploratoires intactes. Ainsi, il semble que le blocage de l'expression du gène TNFα chez des souris APP n'influence pas leurs capacités cognitives mais permet, d'une part, d'éviter l'apparition des troubles du comportement et d'autre part, ralentit le processus du déclin cognitif. Enfin, le pourcentage de plaques amyloïdes a été évalué à deux fois plus élevés pour les KO TNF-α APP hétérozygotes de 15 mois par rapport à des APP hétérozygotes sans traitement du même âge. Chez les animaux APP hétérozygotes surexprimant le TNFα, cette association génétique péjore la performance cognitive comparée à celle des APP homozygotes. Ces animaux ont une altération des mémoires de travail et de référence équivalente à celle retrouvée chez des APP homozygotes. Un traitement anti-inflammatoire administré à ces souris n'améliore pas la capacité cognitive mais permet d'une part, d'éviter l'apparition des troubles comportementaux, et d'autre part, d'entraîner la presque disparition des plaques amyloïdes. Abstract Mutations on the amyloid precursor protein (APP) gene on chromosome 21 lead to an overproduction of β amyloid in both human early onset familial Alzheimer's Disease (AD) and transgenic (TG) mice. On the other hand, inflammatory responses in the brain seem to contribute to the genesis and evolution of neurodegenerative damage. To study the influence of inflammatory factors - especially TNFα - on brain amyloid and behavioural components, TG mice expressing mutant amyloid precursor protein were treated with anti-TNFα antibody and compared with controls injected with PBS buffer or human globulins, as well as with APP mice knockout for the TNFα gene. The APP/V717 mutation leads to a brain deposit of amyloid and to significant behavioural deficits in both homozygous at different ages and heterozygous only at 15 months. The percentage of amyloid is almost triple in APP+/+ than in APP+/- animals, indicating a gene dosage effect. There is no significant effect of an anti-TNF treatment on the deposit of brain amyloid nor spatial learning capabilities. Transgenic mice show also stereotyped behaviour but the anti-TNF treatment decreases the production of stereotypies. The blockade of gene TNFα seems several cognitive alterations and increases the production of amyloid in APP mice at 15 months; but this combination allows to avoid the appearance of stereotyped behavior and in addition, the process of the cognitive decline slows down. Tg6074 mice (overexpressing TNF) increase deleterious effects on behavioural adaptive resources. Treatment with anti-TNF doesn't show changes in cognitive performances but seems to increase the production of amyloid and the stereotyped behaviour.

L'histoire naturelle au XVIe siècle : regards, lectures et discours sur la nature à travers l'exemple de La nature et diversité des poissons de Pierre Belon (1555)

Plan du travail Nous traiterons de cet aspect historique et contextuel dans la première partie. Les trois premiers chapitres décrivent les fondements antiques et médiévaux de la philosophie naturelle seiziémiste et évoquent l'influence du De animalibus d'Albert le Grand sur les médecins naturalistes. Nous en arriverons alors aux liens qui unissent ces derniers (chapitre IV) et aux conditions matérielles et intellectuelles qui entourent et parfois entravent la parution des ouvrages (chapitre V). Nous nous pencherons ensuite sur l'identité des lecteurs susceptibles d'être intéressés par les traités d'histoire naturelle. Ces lecteurs ont des attentes qui méritent aussi un examen quant à leur origine, car elles conditionnent pour une part variable, mais importante, le contenu des oeuvres (chapitre VI). Confrontés à des critiques, à des obstacles institutionnels parfois séculaires, les médecins naturalistes se défendent pour une part en reprenant les arguments de leurs prédécesseurs médiévaux. Mais nous les verrons mettre en place de nouvelles stratégies, en relation étroite avec le renouveau bien connu de la dialectique et de la rhétorique, qui trouve ses racines en Italie du nord à la fin du XVe siècle. Ce point sera développé dans la seconde partie, qui servira de transition essentielle dans notre exposé. C'est là que nous découvrirons que la rhétorique ne s'impose pas uniquement comme un rituel renouvelé de la dispute médiévale : elle n'entre pas seulement en jeu lorsqu'il s'agit de défendre ses intérêts contre des rivaux ou des adversaires académiques (chapitre VII). Les médecins naturalistes mettent au contraire au point des instruments au service d'un processus heuristique qui s'inspire des nouveaux canons de la rhétorique, dont Rudolph Agricola est un des théoriciens principaux (chapitre VIII). Ces observations nous amèneront à repréciser ce qu'il faut entendre par philosophie naturelle au XVIe siècle, notamment au travers de l'autorité de personnages comme Théodore Gaza (chapitre IX) et à définir les fondements généraux de l'histoire naturelle seiziémiste, en adoptant des points de vue divers : examen des tables des matières d'ouvrages, des réflexions des médecins naturalistes, avec à leur tête Conrad Gesner, ou encore étude de la pénétration de l'histoire naturelle dans quelques récits des voyageurs aux Amériques (chapitre X et XI). Arrivé à ce point de l'exposé, le lecteur aura constaté que la solidité de l'histoire naturelle seiziémiste tient à une stratégie discursive soigneusement élaborée. Le développement détaillé et l'application de ce nouveau processus, qui s'ancre au plus profond du discours descriptif de la nature, seront décrits dans la troisième partie. Nous commencerons par y rappeler quels sont les instruments antiques de la description des particulares, l'accident et la différence, que les médecins naturalistes adaptent à leurs exigences heuristiques (chapitre XII). Nous verrons le rôle de "nota", outil discursif méconnu, qui désigne les éléments décisifs ou arguments par lesquels les médecins naturalistes identifient les espèces décrites par les anciens en les confrontant aux espèces réelles (chapitre XIII). Une fois présenté l'instrument descriptif, se pose la question de son utilisation par les médecins naturalistes et de son évaluation par rapport au fonctionnement de la taxonomie moderne (chapitre XIV). La différence entre les deux regards sur la nature apparaîtra comme fondamentale : les médecins naturalistes assignent à leurs investigations des limites, inhérentes à l'origine sacrée de leur quête, qui relève de la philosophie, elle-même subordonnée à la théologie. Cela se percevra par exemple dans la description des animaux du Nouveau Monde. Les conséquences de cette constatation sont considérables : elles remettent en cause le statut du "savant" du XVIe siècle, qui ne saurait être assimilé à l'observateur extérieur tel que l'érige la science des Lumières. Belon et ses collègues se disent plutôt des "contemplateurs" et des interprètes, ce qui les rapprochent de la figure du poète, avec qui ils entretiennent des rapports ambivalents. C'est la relation même du médecin naturaliste au langage de la nature qui s'en trouve affectée : le savant n'a pas la maîtrise du discours, dans la mesure où les signes qu'il interprète et, dans une certaine mesure, ordonne, du latin : les noms d'espèces, entre autres dans les titres de notices descriptives, pour mieux cerner la relation entre la langue antique et la vernaculaire, ainsi que la notion de langue originelle chez les médecins naturalistes (chapitre XVIII). Les points communs qui émergeront de cette confrontation feront disparaître le clivage anachronique entre langue latine et langue vernaculaire, de même que l'hypothèse de l'insuffisance lexicale de la seconde, dont les médecins naturalistes auraient en vain voulu faire l'instrument de la science moderne (chapitre XIX). Le chapitre XX aura pour but d'établir le lien et l'adéquation entre les caractéristiques du discours descriptif ainsi mises en évidence et les fondements véritables de l'histoire naturelle seiziémiste.

Interaction between dietary lipids an physical inactivity on insulin sensitivity and on intramyocellular lipids in healthy men

Résumé Interaction entre les lipides alimentaires et l'inactivité physique sur la sensibilité à l'insuline et les lipides intramyocellulaires chez le sujet masculin en bonne santé Ces deux dernières décennies, l'incidence de la résistance à l'insuline n'a cessé de progresser dans les pays industrialisés. Un grand nombre de travaux suggèrent que ce trouble métabolique joue un rôle important dans la pathogenèse de maladies propres au monde industrialisé, telles que le diabète, l'hypertension et les maladies cardiovasculaires. Malgré de nombreuses études, les mécanismes à l'origine de la résistance à l'insuline restent encore incomplètement élucidés. En plus d'une composante génétique, de nombreux facteurs environnementaux semblent impliqués parmi ces derniers, nous nous sommes intéressés à l'effet d'une alimentation riche en graisses associée à une période d'inactivité physique de courte durée. Nous nous sommes également penchés sur la corrélation décrite entre la résistance à l'insuline et la concentration de graisses présentes à l'intérieur des cellules musculaires squelettiques, appelées lipides intramyocellulaires. Pour ce faire, 8 volontaires masculins ont été étudiés à deux occasions. Après deux jours de diète équilibrée associée à une activité physique, les participants étaient confinés au lit strict pour 60 heures et devaient manger une alimentation soit riche en graisses saturées soit riche en hydrates de carbones. Pour évaluer l'effet de l'alimentation seule, 6 des 8 volontaires ont été réétudiés après deux jours de diète équilibrée suivie par 60 heures d'alimentation riche en graisses saturées associées à une activité physique contrôlée. Nous avons estimé la sensibilité à l'insuline par la technique du clamp hyperinsulinémique euglycémique alors que la concentration de lipides intramyocellulaires a été déterminée par spectroscopie par résonance magnétique. Après 60 heures d'inactivité physique associée à une alimentation riche en lipides, nous avons observé une diminution de l'utilisation de glucose dépendante de l'insuline (-24±6%; p<0.05), alors qu'aucune modification significative de ce même paramètre n'a été constatée lorsque l'inactivité physique était associée à une alimentation riche en hydrates de carbones (+19±10%). Ces deux conditions se sont accompagnées d'une augmentation des lipides intramyocellulaires (+32±7% et +17±8% respectivement). Bien que l'augmentation des lipides intramyocellulaires observée après 60 heures d'une alimentation riche en graisses saturées associée à une activité physique modérée fût d'une ampleur similaire à celle de la condition associant une alimentation riche en graisses et inactivité physique, l'utilisation de glucose induite par l'insuline n'a pas été modifiée de manière significative (-7±9%) Ces résultats indiquent que l'inactivité physique et une alimentation riche en graisses saturées semblent interagir, induisant une diminution de la sensibilité à l'insuline globale. La concentration de lipides intramyocellulaires a été influencée par les lipides issus de l'alimentation et l'inactivité physique, sans être toutefois corrélée à la résistance à l'insuline. Abstract OBJECTIVE - To assess the effect of a possible interaction between dietary fat and physical inactivity on whole-body insulin sensitivity and intramyocellular lipids (IMCLs). RESEARCH DESIGN AND METHODS - Eight healthy male volunteers were studied on two occasions. After 2 days of an equilibrated diet and moderate physical activity, participants remained inactive (bed rest) for 60 h and consumed either a high-saturated fat (45% fat, of which ~60% was saturated fat [BR-HF]) or a high-carbohydrate (70% carbohydrate [BR-HCHO]) diet. To evaluate the effect of a high-fat diet alone, six of the eight volunteers were restudied after a 2-day equilibrated diet followed by 60 h on a high-saturated fat diet and controlled physical activity (PA-HF). Insulin sensitivity was measured by hyperinsulinemic-euglycemic clamp and IMCL concentrations by H-magnetic resonance spectroscopy. RESULTS - Insulin-mediated glucose disposal was decreased by BR-HF condition (-24 ± 6%, P < 0.05) but did not change with BR-HCHO ( + 19 ± 10%, NS). BR-HF and BR-HCHO increased IMCL levels (+32 ± 7%, P < 0.05 and +17 ± 8%, P < 0.0011, respectively). Although the increase in IMCL levels with PA-HF (+31 ± 19%, P = 0.12) was similar to that during BR-HF, insulin-mediated glucose disposal ( -7 ± 9%, NS) was not decreased. CONCLUSIONS - These data indicate that physical inactivity and a high-saturated fat diet may interact to reduce whole-body insulin sensitivity. IMCL content was influenced by dietary lipid and physical inactivity but was not directly associated with insulin resistance.

TLR 2 modulates inflammation in zymosan-induced arthritis in mice

Résumé L'objectif de cette étude est la compréhension des mécanismes sous-jacents à l'inflammation articulaire dans un modèle murin d'arthrite induite par le zymosan (ZIA). En particulier, la participation du récepteur Toll 2 (TLR2) et du complément C3 a été recherchée. L'inflammation articulaire a été quantifiée par l'accumulation de Technetium (Tc) in vivo, et par histologie des articulations arthritiques. Les réponses humorales et cellulaires induites par le zymosan ont été quantifiées par la prolifération lymphocytaire in vitro et par la mesure de la production d'anticorps dirigés contre le zymosan in vivo. L'inflammation associée à l'arthrite induite au zymosan est, d'après le Tc-uptake, d'aspect biphasique, avec un pic après 1 jour, puis une deuxième phase plus tardive. La deuxième phase persiste jusqu'au 24 ème jour et est associée au développement d'une immunité spécifique contre le zymosan. Les souris déficientes pour TLR-2 présentent une réduction significative de l'inflammation articulaire précoce (jour 1) et tardive (jour 24), ainsi qu'une nette diminution de l'infiltrat inflammatoire dans la membrane synoviale. De plus, la prolifération de cellules du ganglion lymphatique ainsi que le taux d'IgG dirigés contre le zymosan sont diminués de façon significative après 25 jour d'arthrite chez les souris déficientes en TLR2 par rapport aux souris sauvages contrôles. Par contraste, chez les souris déficientes pour C3 on n'observe pas de différence dans l'uptake de Tc ou le scoring histologique par rapport à la lignée sauvage. Ces résultats montrent que l'arthrite induite au zymosan n'est pas seulement un modèle d'inflammation aigue, mais que l'inflammation synoviale persiste même après 25 jours. Ce modèle implique à la fois des mécanismes d'immunité innée et acquise. Le signalling via TLR 2 semble jouer in rôle dans l'immunité au zymosan et pourrait être responsable de la nature biphasique de ce modèle d'arthrite. Abstract The interplay between the innate and acquired immune systems in chronic inflammation is not well documented. We have investigated the mechanisms of inflammation in murine zymosan-induced arthritis (ZIA) in the light of recent data on the roles of Toll-like receptor 2 (TLR2) and Dentin-1 in the activation of monocyte/macrophages by zymosan. The severity of inflammation, joint histology, lymphocyte proliferation and antibody production in response to zymosan were analyzed in mice deficient in TLR2 and complement C3, and the effects of Dentin-1 inhibition by laminarin were studied. In comparison with wild-type animals, TLR2-deficient mice showed a significant decrease in the early (day 1) and late phases (day 24) of joint inflammation. C3-deficient mice showed no differences in technetium uptake or histological scoring. TLR2-deficient mice also showed a significant decrease in lymph node cell proliferation in response to zymosan and a lower IgG antibody response to zymosan at day 25 in comparison with wild-type controls, indicating that TLR2 signalling has a role in the development of acquired immune responses to zymosan. Although laminarin, a soluble β-glucan, was able to significantly inhibit zymosan uptake by macrophages in vitro, it had no effect on ZIA in vivo. These results show that ZIA is more prolonged than was originally described and involves both the innate and acquired immune pathways. C3 does not seem to have a major role in this model of joint inflammation.

Function and regulation of the scaffold protein IB1/JIP-1 in the uro-genital tract.

RESUME Ce mémoire de thèse traite de l'étude de la « scaffold »protéine ou protéine «échafaud», « Islet-Brain1/ JNK Interacting Protein 1 » (IB1/JIP-1) dans la vessie et la prostate, deux organes importants de l'appareil uro-genital. Cette protéine, mise en évidence dans notre laboratoire à la fin des année 90, a été reconnue pour réguler la voie de signalisation des « Mitogen-Activated Protein Kinases » (MAPKs), et en particulier de la MAPK appelée c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Le réseau de voie de signalisation permet aux cellules de percevoir les changements dans le milieu extracellulaire et de permettre une réponse appropriée à ces différents stimuli. La connaissance des voies de signalisation a permis de mettre en évidence leur rôle crucial tant dans l'homéostase des tissus sains que dans des processus pathologiques comme l'oncogenèse. Parmi une vingtaine de voie de signalisation, la voie de signalisation des «MAPKinases » est une des plus importantes et a été montrée pour participer à diverses fonctions cellulaires telles que la différentiation, la motilité, la division et la mort cellulaire. La voie de signalisation des « MAPKinases » est typiquement constituée d'un module de trois kinases qui s'activent séquentiellement par phosphorylation. On note la présence d'une MAPK, d'un activateur de MAPK et d'un activateur de l'activateur de MAPK. Une fois la MAPK activée, elle permettra la régulation de différentes cibles dont certain facteur de transcription. Chez les mammifères, il existe 3 grands groupes de MAPKs : the extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK 1/2) cascade, qui régule préférentiellement la croissance et la différentiation cellulaire, ainsi que les cascades JNK et p38 qui régulent préférentiellement la réponse à différents stress cellulaires telle que l'inflammation ou l'apoptose. JNK est activé par différents stress cellulaire telle que les cytokines inflammatoires. JNK est également requis au cours du développement embryonnaire et contribue à la mort (apoptose) ou à la prolifération cellulaire. Plusieurs études ont mis en évidence le rôle de JNK durant le processus tumoral, sans que son rôle soit clairement identifié. JNK pourrait avoir des fonctions différentes durant l'initiation puis de la progression tumorale. Chez les mammifères, les voies de signalisation intracellulaires forment un réseau complexe et elles interagissent entre elles, ce qui permet aux cellules une réponse adéquate aux multitudes de stimuli existants dans les organismes pluricellulaires. Parmi plusieurs mécanismes de régulation, les protéines dites « scaffold » ou «échafaud » jouent un rôle crucial dans l'homéostase de la voie de signalisation des «MAPKinase ». L'introduction revoit brièvement ces différents aspects, de la voie de signalisation des «MAPKinase et des connaissance sur IB1/JIP-1. Les premières études effectuées sur IB1/JIP-1 ont montré une expression relativement spécifique de cette protéine dans certains types de neurones ainsi que dans la cellule beta-sécrétrice d'insuline. IB1/JIP-1 régule la voie de signalisation JNK par interaction avec les différents composants du module, modifiant ainsi le spectre de substrats activés par JNK. La fonction précise de IB1/JIP-1 n'était pas encore élucidée, mais plusieurs travaux mettaient en lumière un rôle dans la régulation, et la sous-location cellulaire des composants de la voie de signalisation JNK, ainsi que dans la survie cellulaire à certain stress. Cette expression relativement spécifique est intrigante car elle suggère que sa présence serait nécessaire à une régulation spécifique de la MAPKinase JNK ou à certaines autres fonctions cellulaires également spécifiques de certains tissus. Le premier but de ce travail a consisté à mettre en évidence l'expression de IB1/JIP-1 dans l'appareil uro-génital et plus particulièrement dans la vessie et la prostate. Nos résultats ont montré que IB1/JIP-1 est spécifiquement exprimé au niveau de l'urothélium vésical, mais pas dans le muscle lisse. Il en est de même au niveau de la prostate où IB1/JIP-1 est exprimé spécifiquement au niveau de l'épithélium sécrétoire et absent au niveau du stroma fibro-musculaire. La vessie et la prostate sont des organes ou l'activité JNK pourrait être crucial tant dans l' homeostase tissulaire que dans le développement de pathologies bénignes ou malignes. La vessie et la prostate sont le siège fréquent de tumeur. La base pour le développement du cancer est complexe et implique plusieurs anomalies génétiques. Ce processus complexe lié au développement tumoral est encore loin d`être complètement élucidé, raison pour laquelle il est crucial de poursuivre l'étude des différents gènes pouvant être impliqué dans ces processus ou pouvant être utilisé comme outil thérapeutique. Dans l'urothelium de la vessie, la fonction de la MAPK JNK n'a été que très peu étudiée. Il existe quelques études, in vitro, suggérant une implication possible de cette voie de signalisation dans des processus telle que le développement ou la progression tumorale. Le chapitre 1 décrit une étude in vivo dans la vessie un modèle de stress mécanique, connu pour activer les MAPKinase. La dilatation vésicale, due à une obstruction urétrale, a mis en évidence une diminution de l'expression de IB1/JIP-1 ainsi qu'une activation de la MAPKinase JNK. Dans ce modèle, la régulation de IB1/JIP-1, par l'intermédiaire d'un vecteur viral, a permis de démontrer que IB1/JIP-1 régulait l'activité de JNK dans ce tissu. Pour poursuivre l'étude de cette fonction d' IB1/JIP-1 dans l'urothélium, nous avons investigué l'activité JNK dans des souris génétiquement modifiées et porteuse d'une délétion de 1 des 2 allèles du gène codant pour IB1/JIP-1, avec un contenu en IB1/JIP-1 diminué de moitié. L'activation de JNK est également augmentée dans l'urothelium au repos de ces souris, ce qui confirme la fonction régulatrice de JNK par IB1/JIP-1. Ces résultats ont permis de mettre en évidence un rôle critique de celle-ci dans l'homéostase de I`urothelium et suggère une nouvelle cible pour réguler la voie de signalisation dans ce tissu. En outre, la modulation des niveaux d'expression d'IB1/JIP-1 dans la vessie, in vivo, par l'intermédiaire de vecteurs viraux s'est révélée réalisable et indique un moyen élégant pour développer une thérapie génique dans cet organe. Un autre élément de ce travail de thèse, révélée au chapitre 2, a été d'étudier la régulation dans la vessie de rat de la communication intercellulaire de type « GAP ». Les cellules adjacentes partagent des ions, messagers secondaires et des petits métabolites par l'intermédiaire de canaux intercellulaire qui forment les jonctions de type « GAP ». Ce type de communications intercellulaire permet une activité cellulaire coordonnée, une caractéristique importante pour l'homéostase des organismes multicellulaire. Ce type de communication intercellulaire est formé de 2 demi-canaux appelés connexons. Chaque connexon est formé de six protéines appelées connexins (Cx). Il existe environ vingt connexines différentes nommées par leur poids moléculaire respectif. Les jonctions de type canaux "GAP" permettent aux cellules de communiquer avec les cellules voisines au quelles elles sont mécaniquement ou électriquement couplées. La vessie peut être particulièrement dépendante de la communication intercellulaire par les canaux « Gap » qui permettrait de coordonner la réponse de la musculature ainsi que de l'urothélium à l'augmentation de la pression transmurale du à l'accumulation d'urine, situation fréquemment observée dans le cadre de l'hyperplasie bénigne de la prostate. Dans la vessie de rat, la connexine26 est exprimée uniquement dans l'urothelium. La Cx26, a été montrée pour être un possible « tumor suppressor gene » dans le cancer de vessie. Une augmentation de la Cx26 ainsi que du couplage des cellules urothéliales a été démontré dans notre modèle de stress mécanique sur la vessie de rat et est dépendante de 2 éléments de réponses connues pour interagir avec AP-1. La régulation de IB1/JIP-1 a permis de montrer que celle-ci régulait l'activité JNK, ainsi que l'activité du facteur de transcription AP-1, composé de c-Jun lui-même cible de JNK. Cette réduction de l'activité de AP-1 est associée à une diminution de l'expression du transcipt de la Cx26. En résumé, la Cx26 pourrait être régulée par le complexe AP-1 lui-même dépendant du contenu en IB1/JIP-1. Dans le chapitre 3, l'étude de IB1/J1P-1 s'est portée sur la prostate. Cet organe, siège fréquent de pathologie telle que le cancer ou l'hyperplasie bénigne de la prostate, exprime IB1/JIP-1 au niveau de son épithélium sécrétoire. Cette expression est maintenue dans une lignée cellulaire humaine largement étudiée est reconnue comme un modèle adéquat de cellules tumorales de type androgène-sensible. IB1/JIP-1 a été investigué dans un modèle in vitro d'apoptose en réponse à un agent appelé N-(4-hydroxyphenyl)retinamide (4-HPR) qui induit une activation de la MAPK JNK ainsi que également un diminution du contenu en IB1/JIP-1. La surexpression de IB1/JIP-1 en utilisant à nouveau des virus comme vecteur a démontré que IB1/JIP-1 était capable de réguler l'activité de JNK ainsi que les taux d'apoptose. Dans le cancer de la prostate, certains travaux ont montré que la différentiation neuroendocrine des cellules tumorales est associée à la progression tumorale et à la perte de sensibilité aux androgènes. Ce travail a permis de dévoiler l'augmentation d'expression de IB1/JIP-1 dans un modèle de neurodifferentiation des cellules d'une lignée prostatique humaine (LNCaP). Les mécanismes qui permettent une expression spécifique de IB1/JIP-1 ont été partiellement investiguée dans notre laboratoire. Son promoteur humain contient un « Neuron Restricive Silencer Element » (NRSE) connu pour se lier a répresseur transcriptionel appelé « RE-1 Silencer Transcription Factor » ou « Neuron Restrictive Silencer Factor » (REST/NRSF). NRSF/REST est capable de réprimer l'expression de gènes neuronaux en dehors du système neuronal. Il prend part à la différentiation terminale des gènes neuronaux. Dans le chapitre 3, on observe que l'activité de REST/NRSF est diminuée dans les cellules LNCaP qui se transdifferencient de manière neuroendocrine, et que REST/NRSF est capable de moduler l'expression de ces gènes cibles dans ce type cellulaire. Ces travaux laissent suggérer que NRSF/REST participe à l'acquisition du phénotype neuroendocrinien et pourrait être une cible pour réguler ce phénomène. En conclusion, ce travail de thèse présente l'expression de IB1/JIP-1 dans 2 organes de l'appareil uro-génital ; la vessie et la prostate. La fonction de IB1/JIP-1 a été étudiée in vivo dans la vessie de rat, ce qui a mis en évidence sa fonction régulatrice de l'activité de la MAPKinase JNK, et de l'activité du facteur de transcription AP-1 ; ainsi que sa possible implication régulatrice de gène cible tel que la Connexin 26 (Cx26). AP-1 et la Cx26 pourraient jouer un rôle dans le processus oncologique, tant dans le control de l'invasion cellulaire ou le control de la croissance cellulaire. Dans la prostate, IB1/JIP-1 régule également l'activité JNK; crucial dans la transmission de certains stimulis pro-apoptotiques. Dans un modèle de transdifférenciation neuroendocrinienne, phénotype possiblement lié au caractère agressif du cancer de la prostate, l'expression de IB1/JIP-1 est augmenté, suggérant soit un rôle possible dans le développement du phénotype neuronal ou une implication dans une fonction anti-apoptotique. Ce travail a donc permis d'élargir nos connaissances sur la régulation et le control de la voie de signalisation des MAPKinases par IB1/JIP-1, qui pourrait avoir encore d'autres fonctions dans ces tissus.

A study of the translational regulation exerted by some neuroactive substances on the expression of the monocarboxylate transporter MCT2 in cultured cortical neurons

Summary of the thesis Glucose has been considered the major, if not the exclusive, energy substrate for the brain. But under certain conditions other substrates, namely monocarboxylates (lactate, pyruvate, and ketone bodies), can contribute significantly to satisfy brain energy demands. These monocarboxylates need to be transported across the blood brain barrier as well as out of astrocytes into the extracellular space and taken up into neurons. It has been shown that monocarboxylates are transported by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, MCT2 is the predominant neuronal form and little is known about the regulation of its expression. The neurotransmitter noradrenaline (NA) was shown previously to enhance the expression of MCT2 in cultured cortical neurons via a translational mechanism. Here, we demonstrate that two other substances, namely, insulin and IGF-1 enhance MCT2 protein expression in cultured mouse cortical neurons in a time- and concentrationdependent manner without affecting MCT2 mRNA levels. This result confirmed that MCT2 protein expression is translationally regulated and extend the observation to different types of neuroactive substances. Then we sought to determine by which signaling pathway(s) NA, insulin and IGF-1 can induce MCT2 protein expression. First, we observed by Western blot that all three substances cause activation of the MAP kinase ERK as well as the kinase Akt via their phosphorylation. Moreover, the mTOR/S6K pathway which is known to play an important role in translation initiation regulation was also strongly stimulated by all three substances. Second, we sought to determine the implication of these signaling pathways on the NA-, insulin- and IGF-1-induced enhancement of MCT2 protein expression and used specific inhibitors of these signaling pathways. We observed that the Pia kinase and mTOR inhibitors LY294002 and rapamycin respectively, strongly prevent the enhancement. of MCT2 expression caused by either NA, insulin ar IGF-1. In contrast, the MEK inhibitor PD98059 and the p38 MAP kinase inhibitor SB202190 had only a slight effect on the enhancement of MCT2 expression in all three cases. These results suggest that NA, insulin and IGF-1 regulate MCT2 protein expression by a common mechanism most likely involving the Akt/PKB pathway and translational activation via mTOR. In conclusion, considering the roles of NA, insulin and IGF-1 in synaptic plasticity, the tight translational regulation of MCT2 expression by these substances may represent a common mechanism through which supply of potentiated synapses with nonglucose energy substrates can be adapted to the level of activity. Résumé du travail de thèse Le glucose représente le substrat énergétique majeur pour le cerveau. Cependant, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques, le cerveau a la capacité d'utiliser des substrats énergétiques appartenant à la classe des monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) afin de satisfaire ses besoins énergétiques. Ces monocarboxylates doivent être transportés à travers la barrière hématoencéphalique mais aussi hors des astrocytes vers l'espace extracellulaire puis re-captés par les neurones. Leur transport est assuré par une famille de transporteurs spécifiques, protons-dépendants, appelés transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, les neurones expriment principalement l'isoforme MCT2 mais peu d'informations sont disponibles concernant la régulation de son expression. Il a été montré que le neurotransmetteur noradrénaline (NA) augmente l'expression de MCT2 dans les cultures de neurones corticaux de souris par le biais d'un mécanisme de régulation traductionnel. La présente étude nous a permis de démontrer que deux autres substances, l'insuline et 17GF-1, induisent une augmentation de la protéine MCT2 dans ces mêmes cultures selon un décours temporel et une gamme de concentrations particulière. Etonnamment, aucun changement n'a été observé concernant les niveaux d'ARNm de MCT2. Ce résultat .confirme que la protéine MCT2 est régulée de manière traductionnelle et révèle que différentes substances neuro-actives peuvent réguler l'expression de MCT2. Compte tenu de ces observations, nous avons voulu déterminer par quelle(s) voie(s) de signalisation la NA, l'insuline et l'IGF-1 exercent leur effet sur l'expression de MCT2. Dans un premier temps, nous avons pu observer par Western blot que ces trois substances activent la MAP kinase ERK ainsi que la kinase Akt via leur phasphorylation. De plus, la voie mTOR/S6K, connue pour son implication dans la régulation de l'initiation de la traduction est aussi fortement activée par ces trois substances. Dans un second temps, nous avons voulu déterminer I implication de chacune de ces voies de signalisation dans l'augmentation de l'expression de la protéine MCT2 observée après stimulation à la NA, à l'insuline et à l'IGF-1. Pour ce faire, nous avons utilisé des inhibiteurs spécifiques de chacune de ces voies. (Vous avons observé que les inhibiteurs des voies PI3 kinase et mTOR (LY294002 et rapamycin respectivement), prévenaient fortement l'augmentation de l'expression de MCT2 induite par la NA, l'insuline ou (IGF-1. A l'inverse, les inhibitions de la MAP kinase .kinase MEK ainsi que de la MAP kinase p38 (par l'utilisation des inhibiteurs spécifiques PD98059 et SB202190 respectivement) n'ont eu qu'un léger effet dans ces mêmes conditions. Ces résultats suggèrent que la NA, 'l'insuline et I~GF-1 régulent l'expression de la protéine MCT2 par un mécanisme commun impliquant probablement la voie Akt/PKB et l'activation de la traduction via mTOR. En conclusion, considérant l'implication de la NA, de l'insuline et de I`IGF-1 dans la plasticité synaptique, le contrôle traductionnel étroit exercé par ces substances sur l'expression de MCT2 pourrait être un moyen d'alimenter en substrats énergétiques autres que le glucose les synapses activées et également d'adapter l'approvisionnement en substrats énergétiques au niveau d'activité. Résumé « grand public » Le cerveau est un organe qui réalise des tâches complexes nécessitant un apport important en énergie. La principale source d'énergie du cerveau est le glucose. Bien que le cerveau ne représente que 2% de la masse corporelle, il consomme à lui seul plus de 25% du glucose et 20% de l'oxygène provenant de la circulation sanguine. La nécessité d'un tel apport en énergie réside dans la nature -même du fonctionnement des milliards de neurones qui utilisent des signaux électriques et chimiques pour communiquer entre eux. Hormis l'utilisation massive du glucose comme source d'énergie, le cerveau est capable de consommer d'autres substrats énergétiques dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. Les monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) font partie de ces autres sources d'énergie. Contrairement au glucose, les monocarboxylates ne diffusent pas facilement de la circulation sanguine vers les neurones. Afin de pouvoir être consommés par les neurones, ils doivent être transportés par un système adapté. Ce sont des transporteurs appelés transporteurs aux monocarboxylates ou MCT qui permettent le passage de ces substrats énergétiques du sang vers les neurones. Le but de ce travail de thèse a été de comprendre comment est régulée l'expression de MCT2, l'un de ces transporteurs exprimé spécifiquement à la surface des neurones. Cette étude nous a permis de mettre en évidence que le neurotransmetteur noradrénaline ainsi que les hormones insuline et IGF-1 (insulinlike growth factor-1) sont capables d'induire une augmentation d'expression de MCT2 à la surface des neurones en culture. Nous avons ensuite voulu déterminer par quels mécanismes de signalisation ces substances agissent sur l'expression de MCT2. Nous avons pu observer que la surexpression de la protéine MCT2 est due à une augmentation d'activité traductionnelle (la traduction étant une des étapes qui permet la synthèse des protéines) induite par le biais d'une voie de signalisation particulière. En conclusion, lorsque la noradrénaline, l'insuline ou 17GF-1 agissent sur les neurones, la traduction de la protéine MCT2 est activée et on observe une augmentation de l'expression de MCT2. Ce mécanisme pourrait permettre d'augmenter l'apport énergétique au niveau des neurones en augmentant le nombre de transporteurs pour les substrats énergétiques que sont les monocarboxylates. D'un point de vue physiologique, cette régulation d'expression pourrait jouer un rôle primordial dans des situations d'apprentissage et de mémorisation. Sur le plan pathologique, cela pourrait permettre de prévenir les dommages causes aux neurones dans certains cas d'atteintes cérébrales.

Use of fluorescent proteins to monitor the regulation of antifungal activity in root-associated Pseudomonas fluorescens CHA0

SUMMARY Roots of crop plants are the target of soil-borne pathogens, mainly fungi that cause considerable damage to plant health. By antagonizing these pathogens, some root-colonizing pseudomonads provide plants with efficient biological protection from disease. Pseudomonas fluorescens CHAO is a soil bacterium with the ability to suppress a considerable range of root diseases. A major characteristic conferring biocontrol capacity to this strain is the production of antifungal compounds, in particular 2,4-diacetyphloroglucinol (DAPG) and pyoluteorin (PLT). The regulation of the biosyntheses of these metabolites is complex and involves several regulatory systems responding to multiple environmental signals. In the present work, we have developed reporter systems based on green (GFP) and red fluorescent (DsRed) proteins to monitor regulation of antifungal gene expression in vitro and on plant roots. Stable and unstable GFP-based reporter fusions to the DAPG and PLT biosynthetic genes allowed us to demonstrate that P. fluorescens CHAO keeps the two antifungal compounds at a fine-tuned balance that can be affected by environmental signals. A GFP-based screening technique helped us to identify two novel regulators of balanced antibiotic production, i.e. MvaT and MvaV that are functionally and structurally related to the nucleoid-binding protein H-NS. They act in concert as global regulators of DAPG and PLT production and other biocontrol-related traits in P. fluorescens CHAO, and are essential for the bacterium's capacity to control a root disease caused by Pythium. The combined use of autofluorescent reporters, flow cytometry, and epifluorescence microscopy permitted us to visualize and quantify the expression of DAPG and PLT biosynthetic genes on roots. A GFP- and DsRed-based two-color approach was then developed to further improve the sensitivity of the flow cytometric quantitation method. The findings of this study shed more light on the complex regulatory mechanisms controlling antifungal activity of P. filuorescens in the rhizosphere. RESUME 4 e Les racines de plantes de culture sont la cible de divers pathogènes, principalement des champignons, qui nuisent gravement à la santé des plantes. Certains pseudomonades colonisant les racines peuvent avoir un effet antagoniste sur les pathogènes et protéger ainsi les plantes de manière efficace. Pseudomonas fluorescens CHAO est une bactérie du sol ayant la capacité de supprimer une gamme considérable de maladies racinaires. Une des caractéristiques principales conférant la capacité de biocontrôle à cette souche, est la production de composés antifongiques, en particulier le 2,4-diacétyphloroglucinol (DAPG) et la pyolutéorine (PLT). La régulation de la biosynthèse de ces métabolites est complexe et implique plusieurs systèmes régulateurs répondant à de multiples signaux environnementaux. Dans ce travail, nous avons développé des systèmes rapporteurs basés sur des protéines fluorescentes verte (GFP) et rouge (DsRed), afin d'étudier la régulation de l'expression des gènes d'antifongiques in vitro et sur les racines des plantes. Des fusions GFP stables et instables rapportrices de l'expression des gènes de biosynthèse du DAPG et de la PLT nous ont permis de démontrer que P. fluorescens CHAO gère les deux antifongiques dans une balance finement régulée pouvant être affectée par des signaux environnementaux. Une technique de criblage basée sur la GFP nous a permis d'identifier deux nouveaux régulateurs de la production d'antibiotiques, MvaT et MvaV, apparentés à la protéine H-NS liant l'ADN, Elles agissent de concert en tant que régulateurs globaux sur la production de DAPG et de PLT, ainsi que sur d'autres éléments relatifs au biocontrôle chez P. fluorescens CHAO. De plus, elles sont essentielles à la bactérie pour contrôler une maladie racinaire causée par Pythium. L'utilisation combinée de rapporteurs autofluorescents, de cytométrie de flux et de microscopie à épifluorescence nous a permis de visualiser et de quantifier l'expression des gènes de biosynthèse du DAPG et de la PLT sur les racines. Une approche utilisant simultanément la GFP et la DsRed a ensuite été développée afin d'améliorer la sensibilité de la méthode de quantification par cytométrie de flux. Les résultats de cette étude ont apporté plus de lumière sur les mécanismes régulateurs complexes contrôlant l'activité antifongique de P. fluorescens dans la rizosphère.