Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction reference genes in the spared nerve injury model of neuropathic pain : validation and literature search

La douleur neuropathique est définie comme une douleur causée par une lésion du système nerveux somato-sensoriel. Elle se caractérise par des douleurs exagérées, spontanées, ou déclenchées par des stimuli normalement non douloureux (allodynie) ou douloureux (hyperalgésie). Bien qu'elle concerne 7% de la population, ses mécanismes biologiques ne sont pas encore élucidés. L'étude des variations d'expressions géniques dans les tissus-clés des voies sensorielles (notamment le ganglion spinal et la corne dorsale de la moelle épinière) à différents moments après une lésion nerveuse périphérique permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. Elles se détectent de manière sensible par reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction (RT- qPCR). Pour garantir des résultats fiables, des guidelines ont récemment recommandé la validation des gènes de référence utilisés pour la normalisation des données ("Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments", Bustin et al 2009). Après recherche dans la littérature des gènes de référence fréquemment utilisés dans notre modèle de douleur neuropathique périphérique SNI (spared nerve injury) et dans le tissu nerveux en général, nous avons établi une liste de potentiels bons candidats: Actin beta (Actb), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal proteins 18S (18S), L13a (RPL13a) et L29 (RPL29), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) et hydroxymethyl-bilane synthase (HMBS). Nous avons évalué la stabilité d'expression de ces gènes dans le ganglion spinal et dans la corne dorsale à différents moments après la lésion nerveuse (SNI) en calculant des coefficients de variation et utilisant l'algorithme geNorm qui compare les niveaux d'expression entre les différents candidats et détermine la paire de gènes restante la plus stable. Il a aussi été possible de classer les gènes selon leur stabilité et d'identifier le nombre de gènes nécessaires pour une normalisation la plus précise. Les gènes les plus cités comme référence dans le modèle SNI ont été GAPDH, HMBS, Actb, HPRT1 et 18S. Seuls HPRT1 and 18S ont été précédemment validés dans des arrays de RT-qPCR. Dans notre étude, tous les gènes testés dans le ganglion spinal et dans la corne dorsale satisfont au critère de stabilité exprimé par une M-value inférieure à 1. Par contre avec un coefficient de variation (CV) supérieur à 50% dans le ganglion spinal, 18S ne peut être retenu. La paire de gènes la plus stable dans le ganglion spinal est HPRT1 et Actb et dans la corne dorsale il s'agit de RPL29 et RPL13a. L'utilisation de 2 gènes de référence stables suffit pour une normalisation fiable. Nous avons donc classé et validé Actb, RPL29, RPL13a, HMBS, GAPDH, HPRT1 et 18S comme gènes de référence utilisables dans la corne dorsale pour le modèle SNI chez le rat. Dans le ganglion spinal 18S n'a pas rempli nos critères. Nous avons aussi déterminé que la combinaison de deux gènes de référence stables suffit pour une normalisation précise. Les variations d'expression génique de potentiels gènes d'intérêts dans des conditions expérimentales identiques (SNI, tissu et timepoints post SNI) vont pouvoir se mesurer sur la base d'une normalisation fiable. Non seulement il sera possible d'identifier des régulations potentiellement importantes dans la genèse de la douleur neuropathique mais aussi d'observer les différents phénotypes évoluant au cours du temps après lésion nerveuse.

Etude des mécanismes de la calcification artérielle des membres inférieurs dans le diabète dans une perspective thérapeutique "Etude DIACART"

1. Contexte La physiopathologie de l'artériopathie diabétique a fait l'objet de nombreuses études qui ont révélé l'importance des voies de l'ostéogenèse et de la glycation. Ces nouvelles connaissances s'avèrent prometteuses, notamment dans une perspective thérapeutique. Mais peu d'études se sont intéressées à l'artériopathie des membres inférieurs en présence de diabète. 2. Objectifs L'objectif principal est d'étudier l'association entre marqueurs de remodelage osseux, glycation avancée et calcification artérielle des membres inférieurs en présence de diabète afin de pouvoir par la suite et sur la base d'un bon niveau de preuves, mettre en place des protocoles à visée thérapeutique ciblant spécifiquement ces mécanismes physiopathologiques. Le processus ciblé est la calcification artérielle, particulièrement prévalente en présence de diabète, mais dont la localisation aux membres inférieurs est encore peu étudiée en clinique. Nous étudions également la relation de la calcification artérielle avec de nombreux autres paramètres, notamment des marqueurs inflammatoires, l'adiponectine, le métabolisme phosphocalcique et la neuropathie diabétique. 3. Méthodologie Notre protocole est intitulé DIACART (« DIAbète et Calcification ARTérielle »). Il s'agit d'une étude transversale et prospective menée par le groupe hospitalier universitaire Pitié-Salpêtrière (GHPS) à Paris, sous la direction du Professeur Agnès Hartemann, cheffe du service de diabétologie. J'ai été le médecin responsable des visites d'inclusion. Ma thèse se décline en 3 parties : la 1ère partie s'intéresse aux données actuelles de la littérature sur l'artériopathie diabétique : épidémiologie, facteurs de risque, traitement, physiopathologie ; la 2e partie décrit la mise en oeuvre du protocole DIACART et présente les résultats de la partie transversale de cette étude. La 3e partie présente les 3 études ancillaires au protocole DIACART, qui ont donné lieu à 3 articles dont l'un a été accepté pour publication le 3.02.2013, alors que les 2 autres ont été soumis en mars 2013 et sont en revue. 4. Résultats et conclusion Les résultats transversaux de notre étude suggèrent que l'ostéoprotégérine (OPG), la fétuine A et la glycation avancée sont impliquées dans le processus de calcification des artères des membres inférieurs chez les patients diabétiques. Par ailleurs, nous observons une relation positive très forte entre adiponectine et artériopathie périphérique. Notre étude confirme également le lien connu entre calcification artérielle et différents marqueurs et/ou facteurs de risque cardiovasculaire (RCV) : âge, sexe, durée du diabète, tabagisme, neuropathie, néphropathie, rétinopathie. L'analyse prospective apportera des notions complémentaires quant aux liens dynamiques de ces variables avec la calcification artérielle, aidera à préciser leur rôle comme marqueurs et/ou facteurs de RCV, et permettra peut-être la mise en place d'essais thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Evaluation de la filière coordonnée de prise en charge des patients diabétiques «Diabaide» : période 2004-2006

La filière coordonnée "diabaide" a été mise en place à fin 2004 dans l'objectif d'améliorer la prise en charge des patients diabétiques par une organisation des soins fondée sur la collaboration, le partage de l'information et la coordination des prestations, afin de renforcer l'autonomie des patients (éducation et auto-prise en charge), d'améliorer la qualité des soins (recommandations thérapeutiques et protocoles de soins) et de maîtriser les coûts. La filière, à ses débuts, était constituée principalement de la cellule multidisciplinaire "diabaide", qui offrait des consultations ambulatoires et hospitalières par des professionnels spécialisés. Cette évaluation, intermédiaire, avait pour objectif d'estimer si le programme avait atteint ses objectifs après deux années d'activités. [....] Le développement de programmes de prise en charge des maladies chroniques est encore à ses débuts en Suisse et "diabaide" fait image de pionnier dans ce domaine. Après cette évaluation, le programme a été modifié en 2007 et ne correspond plus à la description fournie dans ce document. De nouveaux programmes ont également été mis en place en Suisse depuis 2007 (par exemple makora Diabetes-Disease Management Programm à Zürich). Dans le canton de Vaud, le département de la santé de l'action sociale a créé en 2010 un programme cantonal visant à réduire l'impact du diabète sur la population en agissant sur la prévention et sur l'amélioration de la prise en charge des personnes diabétiques. Le programme cantonal a pour objectif notamment de développer une prise en charge globale, inspirée en partie du programme "diabaide", qui sera stratifiée en fonction de la sévérité de la maladie et des besoins des patients, intégrera l'auto-gestion (self-management), sera organisée en filières interdisciplinaires, et sera fondée sur les preuves. [Auteurs, p. 5]

Entrer dans le monde du récit

Le propos est d'introduire à l'analyse narrative en présentant son histoire, ses enjeux et ses outils. Après une première définition, l'analyse narrative est comparée aux approches historico-critique et sémiotique. Puis un historique est retracé brièvement, pour faire saisir ce qui a conduit à l'émergence de ce nouveau type de lecture. Les concepts opératoires sont alors passés en revue. La démarche est illustrée d'exemples tirés des évangiles

Pronostic factors in solitary plasmacytoma of the bone: A Rare Cancer Network study

Contexte Le plasmocytome isolé osseux est une tumeur maligne rare des cellules plasmocytaires. Les données issues de la littérature ne permettent pas de se déterminer sur la dose radiothérapeutique optimale. Dans cette perspective nous avons conduit une vaste étude rétrospective dans le but d'évaluer l'évolution, les facteurs pronostiques aunsi que la dose radiothérapeutique optimale chez les patients présentant un plasmocytome isolé. Méthodes Nous avons réunis les données de 206 patients présentant un plasmocytome isolé osseux sans évidence de myélome multiple. Chaque cas a été documenté histopathologiquement. La majorité des patients (n=169) ont été traités par radiothérapie seule, 32 par une combinaison radiothérapie-chimiothérapie, et 5 par chirurgie. La durée de suivi médiane fut de 54 mois (7-245) Résultats A 5 ans, la survie globale est de 70%, la survie sans maladie de 46% et le contrôle local de 88%. La durée médiane de développement vers une myélome multiple est de 21 mois (2-135) avec une probabilité à 5 ans de 51 %. Les analyses multivariées indiquent l'âge (<60 ans) et la taille de la tumeur (<5cm) comme facteur favorables pour survie. L'âge (<60ans) se dégage comme facteur favorable pour la survie sans maladie. La localisation de la tumeur (vertébrale vs autre) indique la probabilité de contrôle local. L'âge plus avancé (>60 ans) est le seul prédicteur de myélome multiple. Aucune relation dose-réponse n'est mise en évidence pour les doses supérieures à 30 Gy, même pour lés tumeurs les plus étendues. Conclusions Les patients les plus jeunes, principalement ceux présentant une localisation vertébrale, présentent la meilleure évolution sous traitement radiothérapeutique modéré. La progression vers le myélome multiple reste le problème thérapeutique principal. Les futures investigations devraient se focaliser sur les chimiothérapies adjuvantes ainsi que sur les nouveaux agents thérapeutiques.

Qohéleth

(Résumé de l'ouvrage) Cinq ans après sa première édition, cette désormais incontournable Introduction à l'Ancien Testament reparaît dans une nouvelle version entièrement révisée et substantiellement augmentée. Organisée sur le principe d'une présentationde chaque livre de l'Ancien Testament (plan, contenu, milieux producteurs, enjeux et orientations bibliographiques), ce manuel accueille aussi des contributions plus générales qui se voient ici largement complétées par des textes sur l'histoire d'Israël, les lois du Pentateuque, la littérature sapientiale, les Apocalypses juives et l'Ancien Testament des Eglises d'Orient. Avec cette nouvelle édition, la perspective initiale s'élargit vers une introduction plus large à l'Ancien Testament, au-delà de ses inscriptions protestantes et catholiques.

Proverbes

(Résumé de l'ouvrage) Cinq ans après sa première édition, cette désormais incontournable Introduction à l'Ancien Testament reparaît dans une nouvelle version entièrement révisée et substantiellement augmentée. Organisée sur le principe d'une présentationde chaque livre de l'Ancien Testament (plan, contenu, milieux producteurs, enjeux et orientations bibliographiques), ce manuel accueille aussi des contributions plus générales qui se voient ici largement complétées par des textes sur l'histoire d'Israël, les lois du Pentateuque, la littérature sapientiale, les Apocalypses juives et l'Ancien Testament des Eglises d'Orient. Avec cette nouvelle édition, la perspective initiale s'élargit vers une introduction plus large à l'Ancien Testament, au-delà de ses inscriptions protestantes et catholiques.

Psychoped, un programme d'entraînement des compétences sociales pour patients psychiatriques chroniques

Dans le domaine de la réhabilitation psycho-sociale de patients psychiatriques chroniques, l'utilité de l'entraînement des compétences sociales est bien connue. Elaboré et expérimenté dans le cadre de l'Unité de réhabilitation du Département universitaire de psychiatrie adulte de Lausanne, le programme de thérapie cognitive et comportementale intitulé Psychoped est une tentative d'intégration face à un champ qui tend à se diversifier. Psychoped comprend six modules thérapeutiques indépendants, pratiqués en groupe, sélectionnés dans l'offre actuelle des modules de réhabilitation, en particulier ceux développés par Libermann et Brenner. Sa modularité permet de le coordonner à l'éventail des soins déjà existants et d'en individualiser les contenus selon les caractéristiques des patients. La structure et le contenu de ce programme sont présentés de manière synthétique. <Auteurs>

Douleurs neuropathiques : quelques pistes pour une évaluation structurée et une prise en charge spécifique et globale [Neuropathic pain: tips and tools for specific and comprehensive pain management]

Les syndromes neuropathiques sont caractérisés par une douleur d'intensité élevée, de longue durée et résistante aux analgésiques classiques. De fait, il existe un risque important de répercussions sur la vie et le bien-être des patients. A travers une vignette clinique, cet article abordera le diagnostic, le traitement spécifique et l'impact de la douleur neuropathique sur la qualité de vie et les conséquences psychologiques associées, comme la dépression et l'anxiété. Nous présenterons des outils validés qui permettent d'objectiver la composante neuropathique aux douleurs et les comorbidités psychiatriques associées. Cette évaluation globale favorise un meilleur dialogue avec les patients ainsi que l'élaboration de stratégies thérapeutiques, notamment par le biais d'antidépresseurs, dont l'efficacité sera discutée en fin d'article. Neuropathic pain syndromes are characterized by intense and long lasting pain that is resistant to usual analgesics. Patients are therefore at high risk of decreased quality of life and impaired well-being. Using a case report, we will consider in this article the diagnosis and treatment of neuropathic pain as well as its impact on the quality of life including psychological consequences such as depression and anxiety. We will present simple and reliable scales that can help the general practitioner evaluate the neuropathic component of the pain syndrome and its related psychiatric co-morbidities. This comprehensive approach to pain management should facilitate communication with the patient and help the practitioner select the most appropriate therapeutic strategy, notably the prescription of antidepressants, the efficacy of which we will discuss at the end of the article.

PPAR beta a player in astrocyte metabolism and morphology

AbstractPPARP is a nuclear receptor responding in vivo to several free fatty acids, and implicated in cell metabolism, differentiation and survival. PPARp is ubiquitously expressed but shows high expression in the developing and adult brain. PPARp is expressed in different cell types such as neurons and astrocytes, where it might play a role in metabolism. To study this nuclear receptor the laboratory engineered a PPARP -/- mouse model. The aim of my PhD was to dissect the role of PPARP in astrocytes.Experiments in primary culture revealed that cortical astrocytes from PPARP -/- mouse have an impaired energetic metabolism. Unstimulated PPARP -/- astrocytes exhibit a 30% diminution in glucose uptake, correlating to a 30% decrease in lactate release and intracellular glucose. After acute stimulation by D- aspartate mimicking glutamate exposure, both WT and -/- astrocytes up-regulate their metabolism to respond to the increasing energy needed (ATP) for glutamate uptake. According to the Astrocyte Neuron Lactate Shuttle Hypothesis (ANLSH), the ratio between glucose uptake/ lactate release is 1. However, stimulated PPARp -/- astrocytes display a higher increase in lactate release than glucose uptake which remains lower than in WT. The extra glucose equivalents could come from the degradation of intra cellular glycogen stores, which indeed decrease in PPARP -/- cells upon stimulation. Lower glucose metabolism correlates with a decreased acute glutamate uptake in PPARP -/- astrocytes. Reciprocally, we also observed an increase of glutamate uptake and ATP production after treatment of WT astrocytes with a PPARp agonist. Glutamate transporter protein expression is not affected. However, their trafficking and localization might be altered as PPARp -/- astrocytes have higher cholesterol levels, which may also affect proper transporter structure in the membrane.Metabolism, transporter localization and cholesterol levels are respectively linked to cell mobility, cell cytoskeleton and cellular membrane composition. All three functions are important in astrocytes to in vivo acquire star shaped morphology, in a process known as stellation. PPARP -/- astrocytes showed an impaired acquired stellation in presence of neurons or chemical stimuli, as well as more actin stress fibers and cell adhesion structures. While non stellation of astrocytes is mainly an in vitro phenomenon, it reveals PPARp -/- primary astrocytes inability to respond to different exterior stimuli. These morphological phenotypes correlate with a slower migration in cell culture wound healing assays.This thesis work demonstrates that PPARp is implicated in cortical astrocyte glucose metabolism. PPARp absence leads to an unusual intracellular glycogen use. Added to the effect on acute glutamate uptake and astrocyte migration, PPARp could be an interesting target for neuroprotection therapies.RésuméPPARP est un récepteur nucléaire qui a pour ligands naturels certains acides gras libres. Il est impliqué dans le métabolisme, la différentiation et la survie des cellules. PPARP est ubiquitaire, et a une expression élevée dans le cerveau en développement ainsi qu'adulte. PPARp est exprimé dans différents types cellulaires tels que les neurones et les astrocytes, où il régule potentiellement leurs métabolismes. Pour étudier ce récepteur nucléaire, le laboratoire a créé un modèle de souris PPARp -/-. L'objectif de ma thèse est de comprendre le rôle de PPARp dans les astrocytes.Les expériences montrent un défaut du métabolisme énergétique dans les astrocytes corticaux primaires tirés de souris PPARp -/-. Sans stimulation, l'entrée du glucose dans les astrocytes PPARP -/- est diminuée de 30% ce qui correspond à une diminution de 30% du relargage du lactate. Après stimulation par du D-Aspartate qui mime une exposition au glutamate, les astrocytes WT et -/- augmentent leur métabolisme en réponse à la demande accrue en énergie (ATP) due à l'entrée du glutamate. D'après l'Astrocyte Neuron Lactate Shuttle Hypothesis (ANLSH), le ratio entre le glucose entrant et le lactate sortant est de 1. Cependant le relargage du lactate dans les astrocytes PPARP-/- est plus élevé que l'entrée du glucose. L'apport supplémentaire de glucose transformé en lactate pourrait provenir de la dégradation des stocks de glycogène intracellulaire, qui sont partiellement diminués après stimulation dans les cellules PPARP -/-. Un métabolisme plus faible du glucose corrèle avec une réduction de l'import du glutamate dans les astrocytes PPARp -/-. Réciproquement, nous observons une augmentation de l'import du glutamate et de la production d'ATP après traitement avec l'agoniste pour PPARp. Bien que l'expression des transporteurs de glutamate ne soit pas affectée, nous ne pouvons pas exclure que leur localisation et leur structure soient altérées du fait du niveau élevé de cholestérol dans les astrocytes PPARp -/-.Le métabolisme, la localisation des transporteurs et le niveau de cholestérol sont tous liés au cytosquelette, à la mobilité, et à la composition des membranes cellulaires. Toutes ces fonctions sont importantes pour les astrocytes pour acquérir leur morphologie in vivo. Les astrocytes PPARP -/- présentent un défaut de stellation, aussi bien en présence de neurones que de stimuli chimiques, ainsi qu'un plus grand nombre de fibres de stress (actine) et de structures d'adhésion cellulaire. Bien que les astrocytes non stellaires soient principalement observés in vitro, le défaut de stellation des astrocytes primaires PPARp -/- indique une incapacité à répondre aux différents stimuli extérieurs. Ces phénotypes morphologiques corrèlent avec une migration plus lente en cas de lésion de la culture.Ce travail de thèse a permis de démontrer l'implication de PPARP dans le métabolisme du glucose des astrocytes corticaux. L'absence de ce récepteur nucléaire amène à l'utilisation du glucose intracellulaire, auquel s'ajoutent les effets sur l'import du glutamate et la migration des astrocytes. PPARp aurait des effets neuroprotecteurs, et de ce fait pourrait être utilisé à des fins thérapeutiques.