The role of the c-myc gene in pigment cell development and homeostasis

Résumé La dérégulation de c-Myc est un événement fréquent de la transformation cellulaire. Une régulation positive de cette oncoprotéine a été démontrée dans divers mélanomes cutanés primaires et métastatiques et est associée à un pronostic défavorable (Grover et al., 1996; Zhuang et al., 2008). c-Myc est considéré comme une molécule centrale impliquée dans plusieurs processus de l'homéostasie cellulaire. En raison de sa contribution importante dans la progression tumorale, la fonction de c-Myc a été étudiée intensément. Cependant nous connaissons peu le rôle de ce facteur de transcription dans l'embryogenèse et dans la spécification tissulaire. Un déficit total de c-Myc pendant l'embryogenèse conduit à la mort embryonnaire avant 10.5 jours de gestation. Cette mort est causée par de multiples imperfections du développement touchant la taille de l'embryon, le coeur, le péricarde, le tube neural et les cellules sanguines (Davis et al., 1993; Trumpp et al., 2001). Récemment, il a été montré que la plupart de ces anomalies sont secondaires et résultent d'une insuffisance du placenta dans les embryons c-myc-/- (Dubois et al., 2008). Sachant que c-Myc est important dans la maintenance des lignées de la crête neurale (Wei et al., 2007), nous nous sommes intéressés au rôle de c-Myc dans le développement des cellules pigmentaires et à leur homéostasie après la naissance. Un allèle floxé de c-myc (Trumpp et al., 2001) a été utilisé pour supprimer ce gène spécifiquement dans la lignée mélanocytaire à l'aide d'une souris transgénique Tyr::Cre (Delmas et al., 2003). L'ablation des deux allèles de c-myc dans les mélanocytes des souris c-myccKO conduit au phénotype de grisonnement des poils, observé directement après la naissance et associé à une diminution du nombre de mélanocytes dans le bulbe des follicules pileux. Les cellules pigmentaires restantes expriment les marqueurs mélanogéniques (Tyr, TRP-1, Dct and MITF) et semblent être fonctionnelles puisqu'elles peuvent produire et transférer la mélanine. De plus, la capacité de prolifération des mélanocytes déficients en c-Myc dans le bulbe des follicules pileux ne semble pas être affectée chez les nouveaux-nés. Les cellules souches mélanocytaires sont présentes, mais en nombre réduit, dans le bulge des follicules pileux à la fin de la morphogenèse chez les souris c-myccKO âgées de huit jours. Ces cellules sont maintenues sans changement durant le premier cycle pileux (vérifié à l'âge de trente jours), ce qui sous-entend que la fonction de c-Myc n'est pas nécessaire pour ce processus. Ceci explique pourquoi, en supposant que des cellules souches mélanocytaires fonctionnelles sont présentes dans la peau, nous n'observons pas de dilution de couleur de la robe liée à l'âge. Cependant, la présence de ces cellules souches mélanocytaires dans la peau c-myccKO ne suffit pas à assurer une quantité normale de mélanocytes différenciés dans le bulbe des follicules pileux. Cette population de cellules pigmentaires matures est sévèrement affectée par la suppression de c-Myc, ce qui contribue amplement au phénotype de grisonnement des poils. De plus, c-Myc paraît être important pour le développement des mélanocytes. Ainsi, le nombre de mélanoblastes diminue dans les embryons c-myccKO à partir du douzième jour de gestation. A treize jours de gestation, au stade où les mélanoblastes pénètrent dans l'épiderme et prolifèrent, les mélanoblastes déficients en c-Myc ne s'adaptent pas aux signaux de prolifération et se retrouvent en nombre réduit dans l'épiderme. Finalement, nous nous sommes intéressés, au rôle de N-Myc, un homologue proche de c-Myc, dans la lignée mélanocytaire. Nos expériences ont montré que. N-Myc était superflu pour le développement et l'homéostasie des mélanocytes, une seule copie du gène c-myc étant suffisante pour maintenir une pigmentation normale de la robe des souris c-mycc-myccKO/+~N_ myccKO/KO. Cependant, le rôle essentiel de N-Myc dans la maintenance des cellules mélanocytaires précurseurs apparaît lorsque c-Myc est absent, puisque la suppression simultanée des deux Myc résulte en une perte complète de la coloration de la robe. Ceci implique la présence d'un mécanisme compensatoire entre c- et N-Myc dans la lignée mélanocytaire, avec un rôle prédominant de c-Myc. Summary Deregulation of c-Myc is known to be a common event in cellular transformation. Upregulation of this oncoprotein was shown in a variety of primary and metastatic cutaneous melanomas and has been associated with a poor prognosis (Grover et al., 1996; Zhuang et al., 2008). c-myc is seen as a central molecule involved in many aspects of cellular homeostasis. c-Myc function has been intensively studied mostly because of its significant contribution to tumour progression. However little is known on the role of this transcription factor in embryogenesis and tissue specification. Complete loss of c-Myc during embryogenesis results in embryonic death before E10.5 due to multiple developmental defects including embryonic size, heart, pericardium, neural tube and blood cells (Davis et al., 1993; Trumpp et al., 2001). Recently it was discovered that most of these abnormalities are secondary and results of placental insufficiency in c-Myc-/- embryos (Dubois et al., 2008). Here, we focused on the role of c-Myc in pigment cell development and homeostasis after birth, knowing that c-Myc is important in the maintenance of neural crest lineages (Wei et al., 2007). A floxed allele of c-Myc (Trumpp et al., 2001) was used to specifically delete this gene in the melanocyte lineage using Tyr::Cre transgenic mice (Delmas et al., 2003). Removal of both c-Myc alleles in melanocytes of c-MyccKO mouse led to the grey hair phenotype which is seen directly after birth and was associated with a decrease in the melanocyte number in the bulb of the hair follicle. The remaining population of pigment cells express melanogenic markers (Tyr, TRP-1, Dct and MITF) and seem functionally normal since they can produce and transfer melanin. Furthermore proliferation capacity of c-Myc deficient melanocytes in the bulb of hair follicle seems not to be affected in newborn animals. Melanocyte stem cells (MSCs) are present but reduced in numbers in the bulge of the hair follicle at the end of morphogenesis in 8 days old c-MyccKO mice. These cells are maintained through the first hair cycle (as verified at P30) without any further changes, suggesting that c-Myc function is not required for this process. This explains why we did not detect any agerelated coat color dilution, assuming a presence of functional MSCs in the skin. Importantly, presence of MSCs in c-MyccKO skin was not sufficient for assuring a normal number of differentiated melanocytes in the bulb of the hair follicle. This population of mature pigmented cells is severely affected upon c-myc deletion thus largely contributing to the grey hair phenotype. Moreover, c-Myc appears to be important for melanocyte development. Thus, melanoblast number is affected in c-MyccKO embryos day 12 of gestation onwards. At E13.5, when melanoblasts enter the epidermis and proliferate, c-myc deficient melanoblasts failed to adapt to proliferation signals and are therefore reduced in number in the epidermis. Finally, we addressed the role of N-Myc, a closest homologue of c-Myc, in the melanocyte lineage. In these experiments, N-Myc was dispensable for melanocyte development and homeostasis, and even one copy of the c-myc gene was sufficient to maintain normal coat color pigmentation in c-mycc-mycCKO/+ ,N-myccKO/KO mice. However the crucial role of N-Myc in maintenance of melanocyte precursor cells became apparent when c-myc is eliminated since simultaneous deletion of both Myc results in complete loss of coat color pigmentation. This suggests compensatory mechanisms between c- and N-Myc with a predominant role of c-Myc in melanocyte lineage.

Role of lymph node fibroblasts in T cell priming

SummarySecondary lymphoid organs, such as lymph nodes or spleen, are the only places in our body where primary adaptive immune responses are efficiently elicited. These organs have distinct Β and Τ cell rich zones and Τ lymphocytes constantly migrate from the bloodstream into Τ zones to scan dendritic cells (DCs) for antigens they present. Specialized fibroblasts, the Τ zone reticular cells (HR.Cs), span the Τ zone in the form a three-dimensional network. lK.Cs guide incoming Τ cells in their migration, both chemically, by the secretion of the chemokines CCL19 and CCL21, and physically, by construction of a road system to which also DCs adhere. In this way TRCs are thought to facilitate encounters of Τ cells with antigen-bearing DCs and thereby accelerate the selection of rare antigen-specific Τ cells. The resulting Τ cell activation, proliferation and differentiation all take place within the TRC network. However, the influence of TRCs on Τ cell activation has so fer not been elucidated with the possible reasons being that TRCs represent a relative rare cell population and that mice devoid of TRCs have not been described.To circumvent these technical limitations, we established TRC clones and lines to have an abundant source to functionally characterize TRCs. Both the clones and lines show a fibroblastic phenotype, express a surface marker profile comparable to ex vivo TRCs and produce extracellular matrix molecules. However, expression of Ccl19, Ccl21 and ZL-7 is lost and could not be restored by cytokine stimulation. When these TRC clones or lines were cultured in a three-dimensional cell culture system, their morphology changed and resembled that of in vivo TRCs as they formed networks. By adding Τ cells and antigen-loaded DCs to these cultures we successfully reconstructed lymphoid Τ zones that allowed antigen-specific Τ cell activation.To characterize the role of TRCs in Τ cell priming, TRCs were co-cultured with antigen-specific Τ cells in the presence antigen-loaded DCs. Surprisingly, the presence of TRC lines and ex vivo TRCs inhibited rather than enhanced CD8+ Τ cell activation, proliferation and effector cell differentiation. TRCs shared this feature with fibroblasts from non-lymphoid tissues as well as mesenchymal stromal cells. TRCs were identified as a strong source of nitric oxide (NO) thereby directly dampening Τ cell expansion as well as reducing the Τ cell priming capacity of DCs. The expression of inducible NO synthase (iNOS) was up- regulated in a subset of TRCs by both DC-signals as well as interferon-γ produced by primed CD8+ Τ cells. Importantly, iNOS expression was induced during viral infection in vivo in both lymph node TRCs and DCs. Consistent with a role for NO as a negative regulator, the primary Τ cell response was exaggerated in iNOS-/- mice. Our findings highlight that in addition to their established positive roles in Τ cell responses TRCs and DCs cooperate in a negative feedback loop to attenuate Τ cell expansion during acute inflammation.RésuméLes organes lymphoïdes secondaires, comme les ganglions lymphoïdes ou la rate, sont les seuls sites dans notre corps où la réponse primaire des lymphocytes Β et Τ est initiée efficacement. Ces organes ont des zones différentes, riches en cellules Β ou T. Des lymphocytes Τ circulent constamment du sang vers les zones T, où ils échantillonent la surface des cellules dendritiques (DCs) pour identifier les antigènes qu'ils présentent. Des fibroblastes spécialisés - nommés Τ zone reticular cells (TRCs)' forment un réseau tridimensionnel dans la zone T. Les TRCs guident la migration des cellules Τ par deux moyens: chimiquement, par la sécrétion des chimiokines CCL19 et CCL21 et physiquement, par la construction d'un réseau routier en trois dimensions, auquel adhèrent aussi des DCs. Dans ce? cas, on pense que la présence des TRCs facilite les rencontres entre les cellules Τ et les DCs chargées de l'antigène et accélère la sélection des rares cellules Τ spécifiques. Ensuite, l'activation de cellules T, ainsi que la prolifération et la différenciation se produisent toutes à l'intérieur du réseau des TRCs. L'influence des TRCs sur l'activation des cellules T n'est que très peu caractérisée, en partie parce que les TRCs représentent une population rare et que les souris déficientes dans les TRCs n'ont pas encore été découvertes.Pour contourner ces limitations techniques, nous avons établi des clones et des lignées cellulaires de TRC pour obtenir une source indéfinie de ces cellules permettant leur caractérisation fonctionnelle. Les clones et lignées établis ont un phénotype de fibroblaste, ils expriment des molécules de surface similaires aux TRCs ex vivo et produisent de la matrice extracellulaire. Mais l'expression de Ccl19, Ccl21 et 11-7 est perdue et ne peut pas être rétablie par stimulation avec différentes cytokines. Les clones TRC ou les lignées cultivées en un système tridimensionnel de culture cellulaire, montrent une morphologie changée, qui ressemble à celle de TRC ex vivo inclus la construction de réseaux tridimensionnels.Pour caractériser le rôle des TRC dans l'activation des cellules T, nous avons cultivé des TRCs avec des cellules T spécifiques et des DCs chargées avec l'antigène. Etonnamment, la présence des TRC (lignées et ex vivo) inhibait plutôt qu'elle améliorait l'activation, la prolifération et la différenciation des lymphocytes T CDS+. Les TRCs partageaient cette fonction avec des fibr-oblastes des organes non lymphoïdes et des cellules souches du type mésenchymateux. Dans ces conditions, les TRCs sont une source importante d'oxyde nitrique (NO) et par ce fait limitent directement l'expansion des cellules T et réduisent aussi la capacité des DCs à activer les cellules T. L'expression de l'enzyme NO synthase inductible (ïNOS) est régulée à la hausse par des signaux dérivés des DCs et par l'interféron-γ produit par des cellules T de type CD8+ activées. Plus important, l'expression d'iNOS est induite pendant une infection virale in vivo, dans les TRCs et dans les DCs. Par conséquent, la réponse primaire de cellules T est exagérée dans des souris iNOS-/-. Nos résultats mettent en évidence qu'en plus de leur rôle positif bien établi dans la réponse immunitaire, les TRCs et les DCs coopèrent dans une boucle de rétroaction négative pour atténuer l'expansion des cellules T pendant l'inflammation aigiie pour protéger l'intégrité et la fonctionnalité des organes lymphoïdes secondaires.

Cellular and viral factors implicated in persistent infection in canine distemper virus

Summary SLAM (signalling lymphocyte activation molecule, CD150) serves as a cellular receptor for different morbiliviruses, including measles virus and canine distemper virus. Laboratory cell lines that do not express dog SLAM are therefore quite refractory to infection by wildtype CDV. SLAM expression is not only required for CDV virion attachment, but also for the establishment of cytolytic infection characterized by syncytia formation. In order to determine if SLAM has a direct influence on CDV replication, we compared wild-type and mutated SLAM variants for their capacity to influence viral polymerase activity and syncytia formation. Deletion of immunoreceptor tyrosine-based signalling motif (ITSM) in the cytoplasmic tail of SLAM did not seem to influence viral replication, viral polymerase activity or cell-to cell fusion. Instead, it was the level of cell surface expression of SLAM, which was important. Additional experiments corroborated the importance of SLAM for efficient cell-to cell fusion: Both SLAM, as well as viral fusion (F) and attachment (H) glycoproteins, were found to be required for efficient cell-to-cell fusion, which, in turn, enhanced the activity of the viral polymerase and, viral replication. Wild-type A75/17 canine distemper virus (CDV) strain is known to induce a persistent infection in the central nervous system and in dog footpad keratinocytes in vivo. Recently, it has been shown that the A75/17 virus could also infect canine footpad keratinocytes (CFKs) in vitro. CFK infection with A75/17 was initially inefficient and produced very little virus progeny, however, after only three passages the adapted virus produced more progeny and induced limited syncytia formation. Sequence comparison between the A75/17 and the CFKadapted A75/17-K virus revealed three amino acid differences, one in the phosphoprotein (P), one in the matrix protein (M) and one in the H protein. In order to identify viral determinants of A75/17-K adaptation, recombinant viruses containing one, two or three nucleotides substitutions were analyzed. The amino acid substitution in the M protein was without effect on viral particle formation. In contrast, the amino acid substitution in the cytoplasmic tail of H protein was clearly important for syncytia formation. Concerning the mutation in the P protein, it led to an increase in viral replication. However, we cannot rule out that the observed effect is due to the amino acid substitutions in the overlapping accessory proteins C and V, also affected by the P mutation. The adaptation of wild-type CDV strains to cell culture almost always involves modifications of M protein. In order to understand the influence of these modifications, we tested recombinant A75/17 viruses bearing different M proteins. Preliminary results demonstrated that the M protein from the Vero-adapted strain reduced syncytia formation. Future studies will focus on the M mRNA and protein stability, its expression level, localisation and its effect on viral particles formation and on the phenotype of infection. Résumé La protéine SLAM (signalling lymphocyte activation molecule ou CD150) est utilisée comme récepteur cellulaire par les morbillivirus parmi lesquels on trouve le virus de la rougeole (VR) ainsi que le virus de la maladie de Carré (CDV). Les lignées cellulaires qui n'expriment pas la protéine SLAM du chien à leur surface sont réfractaires à l'infection par les souches sauvages de CDV. Le récepteur SLAM n'est pas seulement requis pour l'attachement du virion à la surface de la cellule, mais il participe également de façon active à l'établissement d'une infection cytolytique à travers la formation de syncytia. Afin de déterminer si la protéine SLAM exerce une influence directe sur la réplication virale du virus de la maladie de Carré, nous avons généré différentes protéines tronquées de SLAM et comparé leurs capacités à influencer l'activité de la polymérase ainsi que la formation de syncytia. Nos résultas ont montré que la réplication virale, l'activité de la polymérase ainsi que la fusion cellulaire ne semblent pas être influencées par les délétions dans les régions cytoplasmiques du récepteur SLAM. Cependant, ces délétions agissent sur l'expression de la protéine SLAM à la surface des cellules. Les expériences additionnelles ont permis de souligner l'importance de la protéine SLAM dans le phénomène de fusion entre cellules. En effet, la protéine SLAM ainsi que les deux glycoprotéines virales F et H sont requises pour la formation de syncytia, laquelle induit une augmentation de l'activité de la polymérase ainsi que de la réplication virale. La souche virulente A75/17 du virus, de la Maladie de Carré est connue pour induire une infection persistante au niveau du système nerveux central ainsi que dans les kératinocytes de pattes chez le chien. Des études récentes ont montré que des cultures primaires de kératinocytes de chien pouvaient aussi êtres infectées par la souche A75/17 de CDV. En effet, le virus induit une infection persistante en produisant très peu de progéniture. Cependant, trois passages du virus sauvage A75/17 dans ces cultures aboutissent à la sélection d'un virus produisant plus de progéniture et favorisant la formation limitée de syncytia. La comparaison des séquences génomique entre la souche A75/17 et la souche adaptée A75/17-K montre une différence de trois nucléotides. La première mutation, située dans le gène P, modifie la phosphoprotéine (P) ainsi que les protéines V et C. La deuxième se situe dans le gène de la protéine matricielle (M) et la dernière dans celui de la protéine d'attachement (H). Afin de déterminer les facteurs viraux impliqués lors de l'adaptation virale dans la culture primaire de kératinocytes, des virus recombinants contenant une, deux ou trois de ces mutations ont été analysés. La substitution d'un acide aminé dans la protéine M reste sans effet sur la production de particules virales. En revanche, la substitution d'un acide aminé dans la queue cytoplasmique de la protéine H s'avère clairement importante pour la formation de syncytia. Quant à la mutation dans le gène P, elle permet une augmentation de la réplication virale. Cependant, nous ne pouvons pas écarter l'hypothèse que l'augmentation de la réplication virale soit due aux substitutions d'un acide aminé dans les protéines accessoires V et C qui sont, elles aussi, affectées par la mutation dans le gène P. L'adaptation des souches sauvages de CDV aux cultures de cellules induit presque toujours des modifications de la protéine matricielle M. Afin de comprendre l'influence de ces modifications, nous avons testé 'des virus A75/17 recombinants contenant différentes protéines M. Les résultats préliminaires ont démontré que la protéine M de la souche adaptée aux cellules Vero réduisait la formation de syncytia. Les études futures seront axées sur la stabilité de l'ARN messager, celle de la protéine M, de son niveau d'expression, de sa localisation cellulaire et de son effet sur la formation de particules virale ainsi que sur le phénotype de l'infection.

L'implication des cellules de type cellules souches cancéreuses dans la résistance aux drogues du neuroblastome

Le neuroblastome (NB), tumeur spécifique de l'enfant, se situe au second rang en terme de¦fréquence des tumeurs solides dans la population pédiatrique (1). Il dérive des cellules¦primitives de la crête neurale, une population de cellules embryonnaires dotées d'une¦capacité de différentiation en une panoplie de tissus très variés, dont le système nerveux¦sympathique (2). Cette origine explique la très grande hétérogénéité du NB, tant du point de¦vue biologique que clinique (3). Malgré un traitement intensif et multimodal (chirurgie,¦chimiothérapie à haute dose, greffe de moelle osseuse et immunothérapie), seuls 30 % des¦patients de haut risque (stade IV) survivent sans rechute. La forte résistance du¦neuroblastome de haut grade aux diverses thérapies est une des causes probable du¦pronostic sombre de cette tumeur. Les thérapies actuelles étant insuffisamment efficaces, il¦est primordial de comprendre les mécanismes impliqués dans le processus de résistance¦afin d'élaborer de nouveaux traitements, mieux ciblés, capables de contrer toute résistance¦(4).¦Il a été démontré que certains cancers, tels que les tumeurs du poumon, du sein, de la¦prostate ou du colon, possédaient des cellules souches cancéreuses (CSCs) (5). Ces¦dernières, définies comme étant une petite sous-population de cellules malignes, jouent un¦rôle prépondérant dans l'initiation et la progression tumorale. Elles partagent certaines¦propriétés avec les cellules souches physiologiques, telles que la capacité d'autorenouvellement,¦un potentiel de prolifération indéfini, une dépendance à un¦microenvironnement spécifique, une faculté de pluripotence et une résistance accrue aux¦drogues (6). Ce modèle de CSCs a également été étudié pour le NB (7), permettant ainsi¦d'avancer l'hypothèse selon laquelle cette population de CSCs serait responsable de la¦résistance aux chimiothérapies des cellules tumorales du NB.¦Afin de tenter d'éclaircir le caractère résistant aux drogues des CSCs du NB, nous avons¦sélectionné des sous-populations cellulaires résistantes, en traitant par divers agents¦cytotoxiques (cisplatine, doxorubicine, rapamycine et vincristine) cinq lignées différentes de¦neuroblastes. Dans le but d'établir un potentiel enrichissement en CSCs au sein de ces¦sous-populations par rapport aux populations contrôles non traitées, nous avons testé leurs¦fonctions d'auto-renouvellement et de clonogénicité. Ces propriétés ont été respectivement¦mises en évidence par la capacité des cellules à former des sphères de plusieurs¦générations dans des conditions de culture inhibant l'adhésion cellulaire et par la mesure de¦la croissance cellulaire en milieu semi-solide (soft agar assay). Une analyse d'expression¦génique effectuée préalablement par microarray (Human Genome U133Plus 2.0 Affymetrix¦GeneChip oligonucleotide) dans le laboratoire avait révélé une liste de gènes surexprimés¦dans les CSCs, dont fait partie mdr1 (8). Ce gène code la protéine de transport Pgp (Pglycoprotein),¦impliquée dans le mécanisme de résistance (9,10). Une étude par cytométrie¦en flux de l'expression de MDR1 dans nos diverses populations a également été réalisée¦afin de mettre en évidence une potentielle surexpression de ce gène au sein des cellules¦résistantes aux chimiothérapies.

Providing more informative projections of climate change impact on plant distribution in a mountain environment

Summary Due to their conic shape and the reduction of area with increasing elevation, mountain ecosystems were early identified as potentially very sensitive to global warming. Moreover, mountain systems may experience unprecedented rates of warming during the next century, two or three times higher than that records of the 20th century. In this context, species distribution models (SDM) have become important tools for rapid assessment of the impact of accelerated land use and climate change on the distribution plant species. In my study, I developed and tested new predictor variables for species distribution models (SDM), specific to current and future geographic projections of plant species in a mountain system, using the Western Swiss Alps as model region. Since meso- and micro-topography are relevant to explain geographic patterns of plant species in mountain environments, I assessed the effect of scale on predictor variables and geographic projections of SDM. I also developed a methodological framework of space-for-time evaluation to test the robustness of SDM when projected in a future changing climate. Finally, I used a cellular automaton to run dynamic simulations of plant migration under climate change in a mountain landscape, including realistic distance of seed dispersal. Results of future projections for the 21st century were also discussed in perspective of vegetation changes monitored during the 20th century. Overall, I showed in this study that, based on the most severe A1 climate change scenario and realistic dispersal simulations of plant dispersal, species extinctions in the Western Swiss Alps could affect nearly one third (28.5%) of the 284 species modeled by 2100. With the less severe 61 scenario, only 4.6% of species are predicted to become extinct. However, even with B1, 54% (153 species) may still loose more than 80% of their initial surface. Results of monitoring of past vegetation changes suggested that plant species can react quickly to the warmer conditions as far as competition is low However, in subalpine grasslands, competition of already present species is probably important and limit establishment of newly arrived species. Results from future simulations also showed that heavy extinctions of alpine plants may start already in 2040, but the latest in 2080. My study also highlighted the importance of fine scale and regional. assessments of climate change impact on mountain vegetation, using more direct predictor variables. Indeed, predictions at the continental scale may fail to predict local refugees or local extinctions, as well as loss of connectivity between local populations. On the other hand, migrations of low-elevation species to higher altitude may be difficult to predict at the local scale. Résumé La forme conique des montagnes ainsi que la diminution de surface dans les hautes altitudes sont reconnues pour exposer plus sensiblement les écosystèmes de montagne au réchauffement global. En outre, les systèmes de montagne seront sans doute soumis durant le 21ème siècle à un réchauffement deux à trois fois plus rapide que celui mesuré durant le 20ème siècle. Dans ce contexte, les modèles prédictifs de distribution géographique de la végétation se sont imposés comme des outils puissants pour de rapides évaluations de l'impact des changements climatiques et de la transformation du paysage par l'homme sur la végétation. Dans mon étude, j'ai développé de nouvelles variables prédictives pour les modèles de distribution, spécifiques à la projection géographique présente et future des plantes dans un système de montagne, en utilisant les Préalpes vaudoises comme zone d'échantillonnage. La méso- et la microtopographie étant particulièrement adaptées pour expliquer les patrons de distribution géographique des plantes dans un environnement montagneux, j'ai testé les effets d'échelle sur les variables prédictives et sur les projections des modèles de distribution. J'ai aussi développé un cadre méthodologique pour tester la robustesse potentielle des modèles lors de projections pour le futur. Finalement, j'ai utilisé un automate cellulaire pour simuler de manière dynamique la migration future des plantes dans le paysage et dans quatre scénarios de changement climatique pour le 21ème siècle. J'ai intégré dans ces simulations des mécanismes et des distances plus réalistes de dispersion de graines. J'ai pu montrer, avec les simulations les plus réalistes, que près du tiers des 284 espèces considérées (28.5%) pourraient être menacées d'extinction en 2100 dans le cas du plus sévère scénario de changement climatique A1. Pour le moins sévère des scénarios B1, seulement 4.6% des espèces sont menacées d'extinctions, mais 54% (153 espèces) risquent de perdre plus 80% de leur habitat initial. Les résultats de monitoring des changements de végétation dans le passé montrent que les plantes peuvent réagir rapidement au réchauffement climatique si la compétition est faible. Dans les prairies subalpines, les espèces déjà présentes limitent certainement l'arrivée de nouvelles espèces par effet de compétition. Les résultats de simulation pour le futur prédisent le début d'extinctions massives dans les Préalpes à partir de 2040, au plus tard en 2080. Mon travail démontre aussi l'importance d'études régionales à échelle fine pour évaluer l'impact des changements climatiques sur la végétation, en intégrant des variables plus directes. En effet, les études à échelle continentale ne tiennent pas compte des micro-refuges, des extinctions locales ni des pertes de connectivité entre populations locales. Malgré cela, la migration des plantes de basses altitudes reste difficile à prédire à l'échelle locale sans modélisation plus globale.

Sensing pheromones : a role for the CNGA4 and TRPC2 proteins

Chez les mammifères, les phéromones sont des molécules clés dans la régulation des comportements sociaux au sein d'une espèce. Chez la souris, la détection de ces molécules se fait dans l'organe voméronasal (VNO] et implique le canal TRPC2 afin de dépolariser les neurones. Des différences de comportement entre des souris Trpc2-/- et des souris sans VNO suggèrent l'implication d'une autre protéine effectrice dans la voie de signalisation des phéromones. L'hypothèse étant que cette protéine formerait un canal hétéromérique avec TRPC2. CNGA4 est une protéine sans fonction connue dans le VNO des rongeurs. Elle appartient à la famille des protéines CNG qui joue un rôle important dans différentes voies de signalisation comme la vision ou l'olfaction. Etant donné sa présence dans le VNO, son rôle inconnu dans cet organe et son rôle important dans de nombreuses voies de signalisation, nous avons décidé d'étudier CNGA4 afin de connaître sa localisation, ses propriétés ou encore sa structure. Nous avons découvert que CNGA4 est exprimée dans les axons, les neurones immatures ainsi que sur les microvillosités des neurones de VNO. A l'aide de souris portant une version non fonctionnelle de CNGA4, nous avons pu montrer que cette protéine joue un rôle majeur dans la voie de signalisation des phéromones. Ainsi, les neurones du VNO portant une version non fonctionnelle de CNGA4 répondent moins fréquemment aux phéromones et par conséquent les phéromones activent également moins de neurones dans le bulbe olfactif accessoire, premier relais du VNO avec le cortex. Cette détection défaillante se traduit par une absence d'agressivité des souris mutantes ainsi que par une incapacité de ces souris à discriminer le sexe de leur conspécifique. Etant donné les propriétés similaires de CNGA4 et de TRPC2, nous avons supposé que les deux protéines pourraient interagir. Cette hypothèse a été confortée par l'observation que CNGA4 n'est plus exprimée dans les microvillosités du VNO des souris Trpc2-/-. A l'aide d'expériences d'expression hétérologue, nous avons pu observer que les deux protéines interagissent et forment un canal activé par un analogue du diacylglycérol suggérant que ce canal est fonctionnel. Ces résultats indiquent que CNGA4 formerait un canal hétéromérique avec TRPC2 et aurait dans ce canal une fonction modulatrice. Des expériences complémentaires sont nécessaires afin de connaître le rôle de chacune de ces protéines dans la voie de signalisation des phéromones. Sensing pheromones: a role for the CNGA4 and TRPC2 proteins Mammalian pheromones are key chemical signals in the regulation of intraspecies social behaviors. Detection of these pheromones, which takes place in sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO), implies the activation of the transient receptor potential canonical channel 2 (TRPC2) as the final effector. Interestingly, discrepancies between Trpc2 /- mice and mice lacking a VNO suggest the implication of another protein in the pheromone signaling pathway. This protein could either form a heteromeric channel with TRPC2 or a separate homomeric ion channel. The cyclic nucleotide-gated channel subunit CNGA4 is also expressed in the rodent VNO but its role and properties in this organ remain unknown. CNGA4 belongs to the CNG channel family which is playing an important role in different sensory pathways such as in light and odorant detection. We thus decided to study the role of the CNGA4 protein in the mouse VNO. We found CNGA4 to be expressed in axons, dendrites and in the sensory microvilli. Using mice bearing a non-functional form of CNGA4 we further demonstrated the importance of the CNGA4 protein for the pheromone signaling pathway as neurons from mutant mice were responding less frequently to chemosensory cues. As a result, mutant mice displayed a non-aggressive behavior and an impaired sexual discrimination ability. Based on the CNGA4 localization and its role in the pheromone signaling pathway we hypothesized a possible interaction between CNGA4 and TRPC2 forming a heteromeric channel. First evidences for this interaction came from the absence of CNGA4 expression in the sensory microvilli of Trpc2-/- mice. Second, using transfected HEK cells as an expression system we could observe that CNGA4 and TRPC2 interact and translocate to the plasma membrane. Perfusion of a DAG analogue on co-transfected HEK cells resulted in a strong calcium entry suggesting that the two proteins form a functional channel. These results might suggest a modulatory role for CNGA4 in a heteromeric TRPC2+CNGA4 ion channel. Further experiments will give more insights on the combined role of these transduction ion channels in pheromone detection.

Metastatic leishmaniasis. A chronic inflammatory response to Leishmania's viral endosymbiont.

Leishmania parasites have been plaguing humankind for centuries as a range of skin diseases named the cutaneous leishmaniases (CL). Carried in a hematophagous sand fly, Leishmania usually infests the skin surrounding the bite site, causing a destructive immune response that may persist for months or even years. The various symptomatic outcomes of CL range from a benevolent self- healing reddened bump to extensive open ulcerations, resistant to treatment and resulting in life- changing disfiguration. Many of these more aggressive outcomes are geographically isolated within the habitats of certain Neotropical Leishmania species; where about 15% of cases experience metastatic complications. However, despite this correlation, genetic analysis has revealed no major differences between species causing the various disease forms. We have recently identified a cytoplasmic dsRNA virus within metastatic L. guyanensis parasites that acts as a potent innate immunogen capable of worsening lesionai inflammation and prolonging parasite survival. The dsRNA genome of Leishmania RNA virus (LRV) binds and stimulates Toll-Like-Receptor-3 (TLR3), inducing this destructive inflammation, which we speculate as a factor contributing to the development of metastatic disease. This thesis establishes the first experimental model of LRV-mediated leishmanial metastasis and investigates the role of non-TLR3 viral recognition pathways in LRV-mediated pathology. Viral dsRNA can be detected by various non-TLR3 pattern recognition receptors (PRR); two such PRR groups are the RLRs (Retinoic acid-inducible gene 1 like receptors) and the NLRs (nucleotide- binding domain, leucine-rich repeat containing receptors). The RLRs are designed to detect viral dsRNA in the cytoplasm, while the NLRs react to molecular "danger" signals of cell damage, often oligomerizing into molecular scaffolds called "inflammasomes" that activate a potent inflammatory cascade. Interestingly, we found that neither RLR signalling nor the inflammasome pathway had an effect on LRV-mediated pathology. In contrast, we found a dramatic inflammasome independent effect for the NLR family member, NLRP10, where a knockout mouse model showed little evidence of disease. This phenotype was mimicked in an NLR knockout with which NLRP10 is known to interact: NLRC2. As this pathway induces the chronic inflammatory cell lineage TH17, we investigated the role of its key chronic inflammatory cytokine, IL-17A, in human patients infected by L. guyanensis. Indeed, patients infected with LRV+ parasites had a significantly increased level of IL-17A in lesionai biopsies. Interestingly, LRV presence was also associated with a significant decrease in the correlate of protection, IFN-y. This association was repeated in our murine model, where after we were able to establish the first experimental model of LRV-dependent leishmanial metastasis, which was mediated by IL-17A in the absence of IFN-y. Finally, we tested a new inhibitor of IL-17A secretion, SR1001, and reveal its potential as a Prophylactic immunomodulator and potent parasitotoxic drug. Taken together, these findings provide a basis for anti-IL-17A as a feasible therapeutic intervention to prevent and treat the metastatic complications of cutaneous leishmaniasis. -- Les parasites Leishmania infectent l'homme depuis des siècles causant des affections cutanées, appelées leishmanioses cutanées (LC). Le parasite est transmis par la mouche des sables et réside dans le derme à l'endroit de la piqûre. Au niveau de la peau, le parasite provoque une réponse immunitaire destructrice qui peut persister pendant des mois voire des années. Les symptômes de LC vont d'une simple enflure qui guérit spontanément jusqu' à de vastes ulcérations ouvertes, résistantes aux traitements. Des manifestations plus agressives sont déterminées par les habitats géographiques de certaines espèces de Leishmania. Dans ces cas, environ 15% des patients développent des lésions métastatiques. Aucun «facteur métastatique» n'a encore été trouvé à ce jour dans ces espèces. Récemment, nous avons pu identifier un virus résidant dans certains parasites métastatiques présents en Guyane française (appelé Leishmania-virus, ou LV) et qui confère un avantage de survie à son hôte parasitaire. Ce virus active fortement la réponse inflammatoire, aggravant l'inflammation et prolongeant l'infection parasitaire. Afin de diagnostiquer, prévenir et traiter ces lésions, nous nous sommes intéressés à identifier les composants de la voie de signalisation anti-virale, responsables de la persistance de cette inflammation. Cette étude décrit le premier modèle expérimental de métastases de la leishmaniose induites par LV, et identifie plusieurs composants de la voie inflammatoire anti-virale qui facilite la pathologie métastatique. Contrairement à l'homme, les souris de laboratoire infectées par des Leishmania métastatiques (contenant LV, LV+) ne développent pas de lésions métastatiques et guérissent après quelques semaines d'infection. Après avoir analysé un groupe de patients atteints de leishmaniose en Guyane française, nous avons constaté que les personnes infectées avec les parasites métastatiques LV+ avaient des niveaux significativement plus faibles d'un composant immunitaire protecteur important, appelé l'interféron (IFN)-y. En utilisant des souris génétiquement modifiées, incapables de produire de l'IFN-y, nous avons observé de telles métastases. Après inoculation dans le coussinet plantaire de souris IFN-y7" avec des parasites LV+ ou LV-, nous avons démontré que seules les souris infectées avec des leishmanies ayant LV développent de multiples lésions secondaires sur la queue. Comme nous l'avons observé chez l'homme, ces souris sécrètent une quantité significativement élevée d'un composant inflammatoire destructeur, l'interleukine (IL)-17. IL-17 a été incriminée pour son rôle dans de nombreuses maladies inflammatoires chroniques. On a ainsi trouvé un rôle destructif similaire pour l'IL-17 dans la leishmaniose métastatique. Nous avons confirmé ce rôle en abrogeant IL-17 dans des souris IFN-y7- ce qui ralentit l'apparition des métastases. Nous pouvons donc conclure que les métastases de la leishmaniose sont induites par l'IL-17 en absence d'IFN-v. En analysant plus en détails les voies de signalisation anti-virale induites par LV, nous avons pu exclure d'autres voies d'activation de la réponse inflammatoire. Nous avons ainsi démontré que la signalisation par LV est indépendante de la signalisation inflammatoire de type « inflammasome ». En revanche, nous avons pu y lier plusieurs autres molécules, telles que NLRP10 et NLRC2, connues pour leur synergie avec les réponses inflammatoires. Cette nouvelle voie pourrait être la cible pour des médicaments inhibant l'inflammation. En effet, un nouveau médicament qui bloque la production d'IL-17 chez la souris s'est montré prometteur dans notre modèle : il a réduit le gonflement des lésions ainsi que la charge parasitaire, indiquant que la voie anti-virale /inflammatoire est une approche thérapeutique possible pour prévenir et traiter cette infection négligée.

Regulation of dendritic development by neurotrophic factors

AbstractEstablishment of a functional nervous system occurs through an orchestrated multistep process during embryogenesis. As dendrites are the primary sites of synaptic connections, development of dendritic arborization is essential for the formation of functional neural circuits. Maturation of dendritic arbor occurs through dynamic processes that are regulated by intrinsic genetic factors and external signals, such as environmental stimuli, neuronal activity and growth factors. Among the latter, the neurotrophic factor BDNF is a key regulator of dendritic growth. However, the mechanisms by which BDNF controls dendritic development remain elusive.In this study, we first showed that activation of the MAPK signaling pathway and phosphorylation of the transcription factor CREB are required to mediate the effects of BDNF on dendritic development of cortical neurons. However, phosphorylation of CREB alone is not sufficient to induce dendritic growth in response to BDNF. Thus, by using a mutant form of CREB unable to bind its coactivator CRTC1, we demonstrated that BDNF-induced dendritic elaboration requires the functional interaction between CREB and CRTC1. Consistent with these observations, inhibition of CRTC1 expression by shRNA-mediated knockdown was found to suppress the effects of BDNF on dendritic length and branching of cortical neurons.The nuclear translocation of CRTC1, a step necessary for the interaction between CREB and CRTC1, was shown to result from the activation of NMD A receptors by glutamate, leading to the dephosphorylation of CRTC1 by the protein phosphatase calcineurin. In line with these findings, prevention of CRTC1 nuclear translocation in the absence of glutamate, or by inhibiting NMDA receptors or calcineurin suppressed the promotion of dendritic growth by BDNF.Increasing evidence supports a role for the growth factor HGF in the regulation of dendritic morphology during brain development. Despite these observations, little is known about the cellular mechanisms underlying the effects of HGF on dendritic elaboration of cortical neurons. The second part of this study was aimed at elucidating the cellular processes that mediate the effects of HGF on dendritic differentiation. We found that HGF increases cortical dendritic growth through mechanisms that involve MAPK-dependent phosphorylation of CREB, and interaction of CREB with its coactivator CRTC1. These data indicate that the mechanisms underlying the promotion of dendritic growth by HGF are similar to those that mediate the effects of BDNF, suggesting that the role of CREB and CRTC1 in the regulation of dendritic development may not be limited to HGF and BDNF, but may extend to other neurotrophic factors that control dendritic differentiation.Together, these results identify a previously unrecognized mechanism by which CREB and its coactivator CRTC1 mediate the effects of BDNF and HGF on dendritic growth of cortical neurons. Moreover, these data highlight the important role of the cooperation between BDNF/HGF and glutamate that converges on CREB to stimulate the expression of genes that contribute to the development of dendritic arborization.RésuméL'établissement d'un système nerveux fonctionnel s'accomplit grâce à des mécanismes précis, orchestrés en plusieurs étapes au cours de l'embryogenèse. Les dendrites étant les principaux sites de connexions synaptiques, le développement de l'arborisation dendritique est essentiel à la formation de circuits neuronaux fonctionnels. La maturation de l'arbre dendritique s'effectue grâce à des processus dynamiques qui sont régulés par des facteurs génétiques intrinsèques ainsi que par des facteurs externes tels que les stimuli environnementaux, l'activité neuronale ou les facteurs de croissance. Parmi ces derniers, le facteur neurotrophique BDNF est - connu pour être un régulateur clé de la croissance dendritique. Cependant, les mécanismes par lesquels BDNF contrôle le développement dendritique demeurent mal connus.Au cours de cette étude, nous avons montré dans un premier temps que l'activation de la voie de signalisation de la MAPK et la phosphorylation du facteur de transcription CREB sont nécessaires aux effets du BDNF sur le développement dendritique des neurones corticaux. Toutefois, la phosphorylation de CREB en tant que telle n'est pas sûffisante pour permettre la pousse des dendrites en réponse au BDNF. Ainsi, en utilisant une forme mutée de CREB incapable de se lier à son coactivateur CRTC1, nous avons démontré que l'élaboration des dendrites induite par le BDNF nécessite également une interaction fonctionnelle entre CREB et CRTC1. Ces résultats ont été confirmés par d'autres expériences qui ont montré que l'inhibition de l'expression de CRTC1 par l'intermédiaire de shRNA supprime les effets du BDNF sur la longueur et le branchement dendritique des neurones corticaux.Les résultats obtenus au cours de ce travail montrent également que la translocation nucléaire de CRTC1, qui est une étape nécessaire à l'interaction entre CREB et CRTC1, résulte de l'activation des récepteurs NMDA par le glutamate, entraînant la déphosphorylation de CRTC1 par la protéine phosphatase calcineurine. De plus, le blocage de la translocation nucléaire de CRTC1 en absence de glutamate, ou suite à l'inhibition des récepteurs NMDA ou de la calcineurine, supprime complètement la pousse des dendrites induite par le BDNF.De nombreuses d'évidences indiquent que le facteur de croissance HGF joue également un rôle important dans la régulation de la morphologie dendritique au cours du développement cérébral. Malgré ces observations, peu d'éléments sont connus quant aux mécanismes cellulaires qui sous-tendent les effets du HGF sur la croissance dendritique des neurones corticaux. Le but de la seconde partie de cette étude a eu pour but d'élucider les processus cellulaires responsables des effets du HGF sur la différenciation dendritique des neurones corticaux. Au cours de ces expériences, nous avons pu mettre en évidence que le HGF induit la pousse dendritique par des mécanismes qui impliquent la phosphorylation de CREB par la MAPK, et l'interaction de CREB avec son coactivateur CRTC1. Ces données indiquent que les mécanismes impliqués dans la stimulation de la croissance dendritique par le HGF sont similaires à ceux régulant les effets du BDNF, ce qui suggère que le rôle de CREB et de CRTC1 dans la régulation du développement dendritique n'est vraisemblablement pas limité aux effets du HGF ou du BDNF, mais pourrait s'étendre à d'autres facteurs neurotrophiques qui contrôlent la différenciation dendritique.En conclusion, ces résultats ont permis l'identification d'un nouveau mécanisme par lequel CREB et son coactivateur CRTC1 transmettent les effets du BDNF et du HGF sur la croissance dendritique de neurones corticaux. Ces observations mettent également en évidence le rôle important joué par la coopération entre BDNF/HGF et le glutamate, dans l'activation de CREB ainsi que dans l'expression de gènes qui participent au développement de l'arborisation dendritique des neurones corticaux.

Lentiviral vector-mediated gene transfer in adult mouse photoreceptors is impaired by the presence of a physical barrier

RESUME L'utilisation de la thérapie génique dans l'approche d'un traitement des maladies oculaires dégénératives, plus particulièrement de la rétinite pigmentaire, semble être très prometteuse (Acland et al. 2001). Parmi les vecteurs développés, les vecteurs lentiviraux (dérivé du virus humain HIV-1), permettent la transduction des photorécepteurs après injection sous-rétinienne chez la souris durant les premiers jours de vie. Cependant l'efficacité du transfert de gène est nettement plus limitée dans ce type cellulaire après injection chez l'adulte (Kostic et al. 2003). L'objet de notre étude est de déterminer si la présence d'une barrière physique produite au cours du développement, située entre les photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire ainsi qu'entre les photorécepteurs eux-mêmes, est responsable de: la diminution de l'entrée en masse du virus dans les photorécepteurs, minimisant ainsi son efficacité chez la souris adulte. De précédentes recherches, chez le lapin, ont décrit la capacité d'enzymes spécifiques comme la Chondroïtinase ABC et la Neuraminidase X de modifier la structure de la matrice entourant les photorécepteurs (Inter Photoreceptor Matrix, IPM) par digestion de certains de ses constituants suite à leur injection dans l'espace sous-rétinien (Yao et al. 1990). Considérant l'IPM comme une barrière physique, capable de réduire l'efficacité de transduction des photorécepteurs chez la souris adulte, nous avons associé différentes enzymes simultanément à l'injection sous-rétinienne de vecteurs lentiviraux afin d'améliorer la transduction virale en fragilisant I'IPM, la rendant ainsi plus perméable à la diffusion du virus. L'injection sous-rétinienne de Neuraminidase X et de Chondroïtinase ABC chez la souris induit des modifications structurales de l'IPM qui se manifestent respectivement par la révélation ou la disparition de sites de liaison de la peanut agglutinin sur les photorécepteurs. L'injection simultanée de Neuraminidase X avec le vecteur viral contenant le transgène thérapeutique augmente significativement le nombre de photorécepteurs transduits (environ cinq fois). Nous avons en fait démontré que le traitement enzymatique augmente principalement la diffusion du lentivirus dans l'espace situé entre l'épithélium pigmentaire et les photorécepteurs. Le traitement à la Chondroïtinase ABC n'entraîne quant à elle qu'une légère amélioration non significative de la transduction. Cette étude montre qu'une meilleure connaissance de l'IPM ainsi que des substances capables de la modifier (enzymes, drogues etc.) pourrait aider à élaborer de nouvelles stratégies afin d'améliorer la distribution de vecteurs viraux dans la rétine adulte.

Characterization of BMP signaling in breast development and tumorigenesis

Résumé L'influence des hormones reproductives sur le développement du cancer du sein a été établie au travers de nombreuse études épidémiologiques. Nous avons précédemment démontré que le gène Wnt-4 est un médiateur essentiel de la progestérone dans le développement lobulo-alvéolaire de l'épithélium mammaire. De plus, le rôle de la voie de signalisation Wnt dans la tumorigénèse de la glande mammaire mutine est largement établi. Pour comprendre sa fonction dans le cancer du sein, nous avons activée cette voie en surexprimant le gène Wnt-1 dans des cellules épithéliales primaires de sein, au moyen d'un rétrovirus. Ceci a conduit à la transformation oncogénique de ces cellules et à l'obtention d'un modèle de carcinogénèse du sein dénommé Wnt-1 HMEC. L'analyse de l'expression des gènes induits par la surexpression de Wnt-1 dans ces cellules, a permis d'identifier les gènes BMP4 et 7. Alors que des analyses de RT-PCR ont montré leur forte expression dans les cellules Wnt-1-HMECs, la présence d'une grande quantité de la protéine BMP7 a été constatée dans les tumeurs dérivées de ces cellules. L'importante phosphorylation des Smad 1, 5, S dans les Wnt-1 HMECs indique l'activation de la voie BMP, possiblement due à la stimulation ce celle-ci par BMP7. L'activation de la voie Wnt par la ß-Caténine, conduit à la transcription de BMP7, identifiant ainsi ce gène comme un gène cible de la voie canonique. La pertinence de nos observations a par ailleurs été confirmée par le fait que BMP7 est surexprimé dans les tumeurs de seins humains. Afin d'élucider la fonction de la voie BMP dans le sein, nous avons utilisé le modèle mutin. L'expression du gène BMP7 dans les souris transgéniques MMTV Wnt-1 s'est avérée élevée, démontrant qu'il est aussi un gène cible de la voie Wnt in-vivo. L'expression de l'ARN messager .codant pour la protéine BMP7 est induite lors du développement lobulo-alvéolaire, qui se fait sous l'influence de la progestérone et de Wnt-4. Ensemble, ces observations corroborent le fait qu'une stimulation avec de la progestérone suffit à induire la transcription du gène dans les 24h. Nos résultats coïncident d'autre part avec le fait que BMP7 est exprimé dans la couche myoépithéliale de l'épithélium où la voie Wnt est activée. L'analyse de souris reportrices de l'activité de la voie BMP, suggère une activation dans la couche luminale de l'épithélium durant tout le développement de la glande mammaire. Curieusement, cette même voie est active dans le mésenchyme lors de la mammogénèse embryonnaire. Finalement, nos analyses d'immunofluorescence démontrent la capacité de prolifération des cellules ayant activé BMP, ainsi que leur nette ségrégation d'avec les cellules exprimant le récepteur à la progestérone. Nos résultats démontrent que le gène BMP7 est un gène cible de la voie Wnt canonique dans le sein. Son expression dans la couche myoépitheliale est induite par Wnt-4, lui-même sécrété par les cellules luminales sensibles à la progestérone. La sécrétion de la protéine BMP7 conduit finalement à l'activation de la voie BMP dans les cellules négatives pour le récepteur à la progestérone. Abstract Epidemiological studies highlight the repetitive exposure to circulating progesterone as a major risk in the development of breast cancer. Work in our laboratory showed that Wnt-4 is an essential mediator of progesterone-driven side-branch formation, while Wnt signaling has long been established as strongly oncogenic in the mouse mammary gland. To address the role of Wnt in breast tumorigenesis we activated the pathway in primary human breast epithelial cells by means of refroviral Wnt-1 expression. This resulted in a Wnt1-induced breast carcinogenesis model, being referred to as Wnt-1-HMECs. Gene expression profiling revealed the Bone Morphogenetic Protein 4 and 7 (BMP4 and 7) a mong the most upregulated gene by ectopic Wnt-1 expression in primary HMECs. RT-PCR analysis confirmed elevated BMP4 and 7 mRNA levels in Wnt-1-infected HMECs, as well as strong BMP7 expression in the tumors derived from these cells. Smad 1, 5, 8 phosphorylation was high in Wnt-1HMECs whereas below detection limit in primary HMECs suggesting that the increased expression of BMP-7 results in activation of downstream signaling. Ectopic expressíon of a stabilized form of ßcatenin in primary HMECs resulted in increased transcription of BMP-7 suggesting that it is a target of canonical Wnt signaling. The clinical relevance of our observations was confirmed by the finding of BMP7 being upregulated in human breast tumor samples. To elucidate the role of BMP ligands in the breast in-vivo, we made use of the mouse model. Expression of the BMP7 gene was found to be increased in MMTV-Wnt-1 transgenic animals, suggesting that BMP7 may also be a Wnt 1 target gene in vivo. Expression of BMP7 was upregulated in mid-pregnancy which coincides with progesterone/Wnt induced side branching. BMP7 was induced within 24 hours by progesterone. Consistent with it being a target of canonical Wnt signaling, we demonstrated preferential expression of this ligand in the myoepithelial cells, the target cells of Wnt signals. In-vivo analysis of BMP signaling using a reporter mouse revealed the activation of the pathway in the luminal layer of the epithelium throughout postnatal development. Interestingly, during embryonic mammogenesis the pathway was found to be active in the mesenchyme. Immunofluorescence studies demonstrated that cells with BMP activity can proliferate. They also revealed a clear segregation between progesterone receptor positive cells and cells with active BMP signaling. Together our observations suggest that BMP-7 is a canonical Wnt signaling target both in HMECs and in the mouse mammary gland in-vivo. It is expressed in the myoepithelium possibly in response to Wnt-4, which is secreted by steroid receptor positive cells in response to progesterone. BMP-7 in turn may impinge on lumina) epithelial cells and activate BMP signaling in PR negative cells.

Biochemical characterization of FANCD2 and FANCM in the Fanconi Anaemia pathway

Abstract : The maintenance of genome stability is a challenge for all living organisms. DNA is regularly subjected to chemical alterations by both endogenous and exogenous DNA damaging agents. If left unrepaired, these lesions will create mutations or lead to chromosomal instability. DNA crosslinking agents probably bring about the most toxic lesions. By linking covalently the two strands of DNA, crosslinking agents will impede essential cellular processes such as replication and transcription. Cells from Fanconi anaemia patients are extremely sensitive to these agents. Fanconi anaemia (FA) is a rare chromosomal instability disorder that leads to developmental defects, pancytopenia and cancer susceptibility. FA is a genetically heterogeneous disease with thirteen complementation groups identified. Proteins encoded by the FA genes work together in the FA pathway. Eight of these proteins form the FA core complex (FANC-A, B, C,E, F, G, L and -M), whose integrity is required to monoubiquitinate FANCD2 and FANCI in response to DNA damage. The hypersensitivity of FA cells to crosslinking agents, which perturb the progression of replication forks, has led to the hypothesis that FA proteins play a crucial role in the response to replication stress. However, at the molecular level, the functions of the FA pathway remain largely unknown. Our efforts were first focused on the characterization of FANCD2, "the key effector of the FA pathway". Using different substrates, we found that in vitro, purified hFANCD2 preferentially binds single strand DNA and double strand DNA extremities. Concomitantly, FANCM was identified as a new component of the FA core complex. Moreover FANCM was shown to have specific branch migration activities and probably a role as a "landing platform" on DNA for the other components of the core complex. By using FANCM mutants carrying deletions within the internal domain, we investigated the role of FANCM as a DNA anchor protein for the core complex. We observed that indeed, a specific part of the internal domain of FANCM interacts with components of the core complex. Finally, in collaboration with Weidong Wang's lab we characterized two new components of the FA pathway: FAAP10 and FAAP16. As a heterodimer these two proteins show affinity for dsDNA, and anneal complementary oligonucleotides in vitro. Moreover these proteins can associate with FANCM via a part of its internal domain. We find that FANCM, FAAP 10 and FAAP 16 can co-exist on the branch point of replication and recombination intermediates, and that FAAP10 and FAAP16 stimulate replication fork reversal by FANCM. These results suggest that FANCM may function as a landing platform for the core complex. After loading on DNA, the core complex can activate FANCD2 through monoubiquitination leading to its recruitment to the site of damage. Since ssDNA and double strand breaks are intermediates that are generated as a consequence of collapsed replication forks, FANCD2 by binding to ds DNA ends and ssDNA could protect such structures from the recombination repair machinery and prevent unscheduled recombination events. Alternatively, FANCD2 could avoid nucleases from gaining access to collapsed forks, preserving the DNA in state that can be used as a starting point for resumption of DNA synthesis. The overall comprehension of the FA pathway is far from been complete. Our results unravel new aspects of Fanconi Anaemia, which hopefully in the near future will address keys questions leading to a better understanding of the fascinating Fanconi Anaemia. Résumé : Le maintien de l'intégrité du génome est fondamentale chez tous les organismes vivants. L'ADN est constamment altéré par des composés aussi bien endogènes qu'exogènes. Si ces altérations ne sont pas réparées, elles peuvent conduire à l'apparition de mutations, ainsi qu'à une instabilité génomique accrue. Les lésions les plus sévères qui peuvent survenir sur l'ADN, sont les pontages inter caténaires. Des agents pontants en liant de façon covalente les deux brins d'ADN, vont empêcher le déroulement normal de processus cellulaires essentiels tels que la réplication ou la transcription. La compréhension des mécanismes permettant à la cellule de tolérer et réparer ces lésions est primordiale, notamment dans le cas des patients atteints de l'anémie de Fanconi qui présentent une très grande sensibilité à ces composés pontants. L'anémie de Fanconi est une maladie génétique rare appartenant à un groupe de pathologies associées à une grande instabilité chromosomique. Les patients atteints de l'anémie de Fanconi présentent des malformations du squelette, une pancytopénie et une forte propension à la survenue de cancer. L'anémie de Fanconi est génétiquement très hétérogène. À ce jour, 13 gènes codant pour 13 protéines FANC différentes ont été identifiés. Huit de ces protéines fonctionnent ensemble au sein d'un complexe (nommé le complexe FANC) ayant pour but de monoubiquitiner FANCD2 et FANCI en réponse à la formation de lésions sur l'ADN. L'extrême sensibilité des cellules de patients atteints de l'anémie de Fanconi à ces agents pontant l'ADN suggère l'implication des protéines FANC dans la réponse cellulaire suite à une stress réplicatif. Cependant, le rôle moléculaire exact de ces protéines demeure encore inconnu. Après purification, nous avons observé que FANCD2 était capable de lier l'ADN simple brin, ainsi que les extrémités d'ADN in vitro. Dans le même temps, FANCM fut identifié comme appartenant au complexe FANC. FANCM est décrit comme une translocase capable de promouvoir le déplacement de point de jonction dans des structures d'ADN spécifiques in vitro. De plus, en se liant à l'ADN, FANCM peut agir comme une plateforme pour les autres protéines FANC, leur permettant ainsi d'être adressées à l'ADN. En créant des protéines FANCM recombinantes ayant des délétions dans le domaine interne, nous avons pu observer que certaines protéines du complexe FANC se fixent à des sites spécifiques sur le domaine interne de FANCM. Enfin, au travers d'une collaboration, nous avons été amenés à caractériser deux nouvelles protéines appartenant au complexe FANC : FAAP 10 et FAAP16. Elles s'associent à FANCM par l'intermédiaire du domaine interne, et forment ainsi un hétérotrimére. La présence de FAAP10 et FAAP16 n'affecte pas la liaison de FANCM à l'ADN, mais semble potentialiser son activité de régression in vitro. FANCM semble donc fonctionner comme une plateforme pour les autres composants du complexe FANC. Ces derniers, une fois liés à l'ADN permettent la monoubiquitination de FANCD2 et son recrutement au site lésé de l'ADN. FANCD2 en se liant de façon préférentielle à l'ADN simple brin et aux extrémités d'ADN qui sont générés lors de l'arrêt et du démantèlement d'une fourche de réplication, pourrait protéger ces même fourches de réplication arrêtées, d'évènements de recombinaison aléatoires. Nos résultats apportent de nouveaux éléments concernant les mécanismes moléculaires de l'anémie de Fanconi. Enfin, l'étude de l'anémie de Fanconi permet aussi de mieux comprendre les mécanismes mis en place par la cellule pour tolérer des lésions survenant lors de la réplication.

Characterization of the molecular mechanisms of insulin exocytosis and of their adaptation to physiopathological conditions

Résumé large public Le glucose est une source d'énergie essentielle pour notre organisme, indispensable pour le bon fonctionnement des cellules de notre corps. Les cellules β du pancréas sont chargées de réguler l'utilisation du glucose et de maintenir la glycémie (taux de glucose dans le sang) à un niveau constant. Lorsque la glycémie augmente, ces dernières sécrètent l'insuline, une hormone favorisant l'absorption, l'utilisation et le stockage du glucose. Une sécrétion insuffisante d'insuline provoque une élévation anormale du taux de glucose dans le sang (hyperglycémie) et peut mener au développement du diabète sucré. L'insuline est sécrétée dans le sang par un mécanisme particulier appelé exocytose. Une meilleure compréhension de ce mécanisme est nécessaire dans l'espoir de trouver des nouvelles thérapies pour traiter les 170 millions de personnes atteintes de diabète sucré à travers le monde. L'implication de diverses protéines, comme les SNAREs ou Rabs a déjà été démontrée. Cependant leurs mécanismes d'action restent, à ce jour, peu compris. De plus, l'adaptation de la machinerie d'exocytose à des conditions physiopathologiques, comme l'hyperglycémie, est encore à élucider. Le but de mon travail de thèse a été de clarifier le rôle de deux protéines, Noc2 et Tomosyn, dans l'exocytose ; puis de déterminer les effets d'une exposition prolongée à un taux élevé de glucose sur l'ensemble des protéines de la machinerie d'exocytose. Noc2 est un partenaire potentiel de deux Rabs connues pour leur implication dans les dernières étapes de l'exocytose, Rab3 et Rab27. Grâce à l'étude de différents mutants de Noc2, j'ai montré que l'interaction avec Rab27 permet à la protéine de s'associer avec les organelles de la cellule β contenant l'insuline. De plus, en diminuant sélectivement l'expression de Noc2, j'ai déterminé l'importance de cette protéine pour le bon fonctionnement du processus d'exocytose et le relâchement de l'insuline. Quant à Tomosyn, une protéine interagissant avec les protéines SNAREs, j'ai démontré son importance dans la sécrétion d'insuline en diminuant de manière sélective son expression dans les cellules β. Ensuite, grâce à une combinaison d'approches moléculaires et de microscopie, j'ai mis en évidence le rôle de Tomosyn dans les dernières étapes de l'exocytose. Enfin, puisque la sécrétion d'insuline est diminuée lors d'une hyperglycémie prolongée, j'ai analysé l'adaptation de la machinerie d'exocytose à ces conditions. Ceci m'a permis de découvrir que l'expression de quatre protéines essentielles pour le processus d'exocytose, Noc2, Rab3, Rab27 et Granuphilin, est fortement diminuée lors d'une hyperglycémie chronique. L'ensemble de ces données met en évidence l'importance de Noc2 et Tomosyn dans la sécrétion d'insuline. L'inhibition, par un taux élevé de glucose, de l'expression de Noc2 et d'autres protéines indispensables pour l'exocytose suggère que ce phénomène pourrait contribuer au développement du diabète sucré. Résumé L'exocytose d'insuline, en réponse au glucose circulant dans le sang, est la fonction principale de la cellule β. Celle-ci permet de stabiliser le taux de glucose sanguin (glycémie). Le diabète de type 2 est caractérisé par une glycémie élevée due, principalement, à un défaut de sécrétion d'insuline en réponse au glucose. La compréhension des mécanismes qui contrôlent l'exocytose d'insuline est essentielle pour clarifier les causes du diabète sucré. Plusieurs composants impliqués dans ce processus ont été identifiés. Ceux-ci incluent les SNAREs Syntaxin-1, VAMP2 et SNAP25 et les GTPases Rab3 et Rab27 qui jouent un rôle dans les dernières étapes de l'exocytose. Pendant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle de Noc2, un des partenaires de Rab3 et Rab27, dans l'exocytose d'insuline. Nous avons déterminé que Noc2 s'associe aux granules de sécrétion d'insuline grâce à son interaction avec Rab27. La diminution de l'expression de Noc2 dans la lignée cellulaire β INS-1E, par ARN interférence, influence négativement la sécrétion d'insuline stimulée par différents sécrétagogues et prouve que cette protéine Noc2 est essentielle pour l'exocytose d'insuline. L'interaction avec Munc13, une protéine impliquée dans l'arrimage des vésicules, suggère que Noc2 participe au recrutement des granules d'insuline à la membrane plasmique. Ensuite, j'ai analysé l'adaptation de la machinerie d'exocytose à des concentrations supraphysiologiques de glucose. Le niveau d'expression de Rab3 et Rab27 et de leurs effecteurs Granuphilin/S1p4 et Noc2 est fortement diminué par une exposition prolongée des cellules β à haut glucose. L'effet observé est en relation avec l'induction de l'expression de ICER, un facteur de transcription surexprimé dans des conditions d'hyperglycémie et également dans des modèles génétiques de diabète de type 2. La surexpression de ICER dans des cellules INS-1E diminue l'expression de Rab3, Rab27, Granuphilin/Slp4 et Noc2 et par conséquent l'exocytose d'insuline. Ainsi, l'induction de ICER, après une exposition prolongée à haut glucose, régule négativement l'expression de protéines essentielles pour l'exocytose et altère la sécrétion d'insuline. Ce mécanisme pourrait contribuer au dysfonctionnement de l'exocytose d'insuline dans le diabète de type 2. Dans la dernière partie de ma thèse, j'ai investigué le rôle de la protéine Tomosyn-1 dans la formation du complexe SNARE. Cette protéine a une forte affinité pour Syntaxin-1 et contient un domaine SNARE. Tomosyn-1 est concentrée dans les régions cellulaires enrichies en granules de sécrétion. La diminution sélective de l'expression de Tomosyn-1 induit une réduction de l'exocytose stimulée par différents sécrétagogues. Cet effet est dû à un défaut de fusion des granules avec la membrane plasmique. Ceci nous indique que Tomosyn-1 intervient dans une phase importante de la préparation des vésicules à la fusion, qui est nécessaire à l'exocytose. Abstract: Insulin exocytosis from pancreatic β-cells plays a central role in blood glucose homeostasis. Diabetes mellitus is a complex metabolic disorder characterized by secretory dysfunctions in pancreatic β-cells and release of amounts of insulin that are inappropriate to maintain blood glucose concentration within normal physiological ranges. To define the causes of β-cell failure a basic understanding of the molecular mechanisms that control insulin exocytosis is essential. Some of the molecular components involved in this process have been identified, including the SNARE proteins VAMP2, Syntaxin-1 and SNAP25 and the two GTPases, Rab3 and Rab27, that regulate the final steps of insulin secretion. I first investigated the role of Noc2, a potential Rab3 and Rab27 partner, in insulin secretion. I found that Noc2 associates with Rab27 and is recruited by this GTPase on insulin- containing granules. Silencing of the Noc2 gene by RNA interference led to a strong impairment in the capacity of the β-cell line INS-1E to respond to secretagogues, indicating that appropriate levels of the protein are essential for insulin exocytosis. I also showed that Noc2 interacts with Munc13, a protein that controls vesicle priming, suggesting a possible involvement of Noc2 in the recruitment of secretory granules at the plasma membrane. In the second part of my thesis, I investigated the adaptation of the molecular machinery of exocytosis to physiopathological conditions. I found that the expression of Rab3, Rab27 and of their effectors Granuphilin/Slp4 and Noc2 is dramatically decreased by chronic exposure of β-ce1ls to supraphysiological glucose levels. The observed glucotoxic effect is a consequence of the induction of ICER, a transcriptional repressor that is increased by prolonged hyperglycemia and in genetic models of type 2 diabetes. Overexpression of ICER reduced Granuphilin, Noc2, Rab3 and Rab27 levels and inhibited exocytosis. These results suggest that the presence of inappropriate levels of ICER diminishes the expression of a group of proteins essential for exocytosis and contributes to defective insulin release in type 2 diabetes. In the last part of my thesis, I focused my attention on the role of Tomosyn-1, a Syntaxin-1 binding protein possessing a SNARE-like motif, in the control of SNARE complex assembly. I found that Tomosyn-1 is concentrated in cellular compartments enriched in insulin-containing secretory granules. Silencing of Tomosyn-1 did not affect the number of secretory granules docked at the plasma membrane but decreased their release probability, resulting in a reduction in stimulus-induced insulin exocytosis. These findings suggest that Tomosyn-1 is involved in a post-docking event that prepares secretory granules for fusion and is necessary to sustain exocytosis in response to insulin secretagogues.

The early IL-4 response to Leishmania major responsible for progressive disease in BALB/c mice is subject to the control of autocrine IL-2 production and regulatory CD4+C25+ T cells

Résumé : La majorité des souches de souris de laboratoire sont résistantes à l'infection par le parasite Leishmania major (L. major). A l'opposé, les souris de la souche BALB développent une maladie évolutive. La résistance et la sensibilité sont corrélées avec l'apparition de lymphocytes T CD4+ spécifiques du parasite, Th1 (de l'anglais T helper) ou Th2 respectivement. La réponse aberrante Th2 chez les souris de la souche BALB/c dépend, au moins en partie, de façon critique de la production rapide d'IL-4 suite à l'infection. Ce pic précoce d'IL-4 est produit par une population de lymphocytes T CD4+ restreinte aux molécules du MHC de classe II, exprimant les chaînes du récepteur des cellules T Vß4-Va8. Ces lymphocytes sont spécifiques d'un épitope de l'homologue Leishmania de la molécule RACK1 des mammifères, appelée LACK. Il a été clairement démontré que l'IL-4 rapidement produite par ces cellules T CD4+ Vß4-Va8 induit la maturation Th2 responsable de la sensibilité vis-à-vis de L. major. Des expériences ont été entreprises pour étudier la régulation de cette réponse précoce d'IL-4. Dans ce travail, nous avons documenté, dans les cellules provenant des ganglions de souris sensibles infectées par L. major, une augmentation de la transcription de l'ARNm de l'IL-2 qui précède la réponse précoce d'IL-4. La neutralisation de l'IL-2 durant les premiers jours d'infection induit la maturation des cellules Thl et la résistance vis-à-vis de L. major. Ces effets de l'anticorps anti-IL-2 neutralisant sont liés à sa capacité d'interférer avec la transcription rapide d'IL-4 des cellules CD4+ réactives à l'antigène LACK. Une augmentation similaire d'IL-2 survient chez les souris résistantes C57BL/6 qui sont incapables de générer la réponse précoce d'IL-4. Cependant, la protéiné LACK induit une transcription précoce d'IL-2 uniquement chez les souris sensibles. Des expériences de reconstitution utilisant des souris C.B.-17 SCID et des cellules T CD4+ réactives à LACK provenant de souris BALB/c IL-2-~démontrent un mode d'action autocrine de l'IL-2 sur la régulation de la réponse précoce d'IL4. Par conséquent, chez les souris C57BL/6, l'absence du pic précoce d'ARNm de l'IL-4 important pour la progression de la maladie paraît liée à l'incapacité des cellules T CD4+ réactives à LACK de produire de l'IL-2. Un rôle dans le contrôle de la production précoce d'IL-4 par les cellules T régulatrices CD4+CD25+ a été investigué en déplétant in vivo cette population de cellules. La déplétion induit une élévation du pic précoce de l'ARNm de l'IL-4 dans les ganglions drainant de souris BALB/c, ainsi qu'une exacerbation du cours de la maladie avec des taux augmentés d'IL-4 dans les ganglions. La réponse rapide d'IL-2 vis-à-vis de L. major est aussi significativement augmentée chez les souris BALB/c déplétées en cellules CD4+CD25+. De plus, nous avons démontré que le transfert de 10puissance(7) cellules provenant de la rate de souris BALB/c déplétées en cellules T régulatrices CD4+CD25+ rend les souris SCID sensibles à l'infection et permet la différentiation Th2. Au contraire, les souris SCID reconstituées avec 10' cellules de la rate de souris BALB/c contrôle sont résistantes à infection par L. major et développent une réponse Thl. Chez les souris SCID reconstituées avec des cellules de rate déplétées en cellules exprimant le marqueur CD25, le traitement avec un anticorps neutralisant l'IL-4 au moment de l'infection par L. major prévient le développement de la réponse Th2 et rend ces souris résistantes à l'infection. Ces résultats démontrent que les cellules T régulatrices CD4+CD25+ jouent un rôle dans la régulation du pic précoce d'IL-4 responsable du développement cellulaire Th2 dans ce modèle d'infection. Summary Mice from most strains are resistant to infection with Leishmania major (L. major). In contrast, BALB mice develop progressive disease. Resistance and susceptibility result from parasite-specific CD4+ Thl or Th2 cells, respectively. The aberrant Th2 response in BALB/c mice depends, at least in part, upon the production of IL-4 early after infection. The CD4+ T cells responsible for this early IL-4 response to L. major express a restricted TCR repertoire (Vß4-Va8) and respond to an I-Ad-restricted epitope of the Leishmania homologue of mammalian RACK1, designated LACK. The role of these cells and the IL-4 they produce for subsequent Th2 cell development and disease progression in BALB/c mice was demonstrated. Experiments have been undertaken to study the regulation of the rapid IL-4 production to L. major. In this report, we document an IL-2 mRNA burst, preceding the reported early IL-4 response, in draining lymph nodes of susceptible mice infected with L. major. Neutralization of IL-2 during the first days of infection redirected Thl cell maturation and resistance to L. major, through interference with the rapid IL-4 transcription in LACKreactive CD4+ cells. A burst of IL-2 transcripts also occurred in infected C57BL/6 mice that do not mount an early IL-4 response. However, although the LACK protein induced IL-2 transcripts in susceptible mice, it failed to trigger this response in resistant C57BL/6 mice. Reconstitution experiments using C.B.-17 SCID mice and LACK-reactive CD4+ T cells from IL-2-/- BALB/c mice showed that triggering of the early IL-4 response required autocrine IL2. Thus, in C57BL/6 mice, the inability of LACK-reactive CD4+ T cells to express early IL-4 mRNA transcription, important for disease progression, appears due to an incapacity of these cells to produce IL-2. A role for CD4+CD25+ regulatory T cells in the control of this early IL-4 production was investigated by depleting in vivo this regulatory T cell population. Depletion induced an increase in the early burst of IL-4 mRNA in the draining lymph nodes of BALB/c mice, and exacerbated the course of disease with higher levels of IL-4 mRNA and protein in their lymph nodes. The rapid IL-2 response to L. major is also significantly enhanced in BALB/c mice depleted of CD4+CD25+ cells. We further showed that transfer of 10~ BALB/c spleen cells that were depleted of CD4+CD25+ regulatory T cells rendered SCID mice susceptible to infection and allowed Th2 differentiation while SCID mice reconstituted with 10 control BALB/c spleen cells were resistant to infection with L. major and developed a Thl response. Treatment with a mAb against IL-4 upon infection with L. major in SCID mice reconstituted with CD25-depleted spleen cells prevented the development of Th2 polarization and rendered them resistant to infection. These results demonstrate that CD4+CD25+ regulatory T cells play a role in regulating the early IL-4 mRNA and the subsequent development of a Th2 response in this model of infection.

Role for JIP-1/IB1 in pancreatic β-cell and adipocyte dysfunctions in type 2 diabetes and obesity

L'insuline, produite par les cellules β du pancréas, joue un rôle central dans le contrôle de la glycémie. Un manque d'insuline entraine le diabète de type 2, une maladie répandue au stade d'épidémie au niveau mondial. L'augmentation du nombre de personnes obèses est une des causes principales du développement de la maladie. Avec l'obésité les tissus tels que le foie, le muscle, et le tissu adipeux deviennent résistants à l'insuline. En général, cette résistance est équilibrée par une augmentation de la sécrétion d'insuline. De ce fait, un grand nombre d'individus obèses ne deviennent pas diabétiques. Lorsque les cellules β ne produisent plus suffisamment d'insuline, alors le diabète se développe. Dans l'obésité, les cellules graisseuses sont résistantes à l'insuline et relâchent des lipides et autres produits qui affectent le bon fonctionnement et la vie des cellules β. «c-Jun Ν terminal Kinase» (JNK) est une enzyme qui joue un rôle important dans la résistance de l'insuline des cellules graisseuses. Cette même en2yme contribue aussi au déclin de la cellule β dans les conditions diabétogènes, et représente ainsi une cible thérapeutique potentielle du diabète. L'objectif de cette thèse a été de comprendre le mécanisme conduisant à l'activité de JNK dans les adipocytes et cellules β, dans l'obésité et le diabète de type 2. Nous montrons que les variations de JNK sont la conséquence de taux anormaux de JIP-1/EB1, une protéine qui a été impliquée dans certaines formes génétiques de diabète de type 2. En outre nous décrivons le mécanisme responsable des anomalies de JIP1/IB1 dans les adipocytes et cellules β. La restauration des taux de JIP-1/EB1 dans les deux types cellulaires pourrait être un objectif des thérapeutiques antidiabétiques actuelles et futures. - Le nombre d'individus touchés par le diabète de type 2 atteint aujourd'hui des proportions épidémiques à l'échelle mondiale. L'augmentation de la prévalence de l'obésité est la cause principale du développement de la maladie, qui, en général, survient suite à une perte de la sensibilité à l'insuline des tissus périphériques. Dans un grand nombre des cas, l'insulino-résistance est compensée par une augmentation de la sécrétion de l'insuline par les cellules β pancréatiques. Le diabète apparaît lorsque l'insuline n'est plus produite en quantité suffisante pour contrecarrer la résistance à l'insuline des tissus. Le défaut de production de l'insuline résulte du dysfonctionnement et de la réduction massive des cellules β. Les acides gras libres non estérifiés, en particulier le palmitate, provenant d'une alimentation riche en lipides et libérés par les adipocytes insulino-résistants contribuent au déclin de la cellule β en activant la voie de signalisation «cJun N-terminal kinase» (JNK). L'activation de JNK contribue aussi à la résistance à l'insuline des adipocytes dans l'obésité, soulignant ainsi l'importance de cette voie de signalisation dans la pathophysiologie du diabète. L'objectif de cette thèse a été de comprendre les mécanismes qui régulent JNK dans les cellules β et les adipocytes. Nous montrons que l'activation de JNK dans ces deux types cellulaires est la conséquence de la variation des taux de «JNK interacting protein 1» appelé aussi «islet brain 1» (JEP-1/ΓΒΙ), une protéine qui attache les kinases de la signalisation de JNK et dont des variations génétiques ont été associées avec le diabète de type 2. Dans les cellules β cultivées avec du palmitate, ainsi que dans les adipocytes dans l'obésité, l'expression de JEP-l/BBl est modifiée. Les modulations de l'expression de JEP-1/ΓΒΙ sont réalisées par le facteur de transcription «inducible cAMP early repressor» (ICER). L'expression d'ICER dans les adipocytes est diminuée dans l'obésité, et corrèle avec l'augmentation des niveaux de JEP-1/IB1. A l'inverse, le niveau d'expression d'ICER est augmenté dans les cellules β cultivées avec du palmitate, et cette augmentation perturbe le bon fonctionnement des cellules en réduisant les niveaux de JEP-l/IBl. Comme le palmitate, les particules pro-athérogéniques LDL-cholesterol oxydés, sont élevées chez les personnes obèses et diabétiques et sont délétères aux cellules β. Ces particules modifiées activent JNK dans les cellules β en diminuant l'expression de JIP-1/IB1 via ICER. Tous ces résultats montrent que le dérèglement de l'expression de JIP-l/EBl par ICER joue un rôle central dans l'activation de JNK dans les adipocytes et cellules β en souffrance dans l'obésité et le diabète de type 2. La restauration appropriée des niveaux de JEPl/IBl et d'ICER pourrait être considérée comme un objectif pour mesurer l'efficacité des traitements antidiabétiques actuels et futurs. - Type 2 diabetes has reached epidemic proportions worldwide, and poses a major socio-economic burden on developed and developing societies. The disease is often accompanied by obesity, and arises when β-cells produce insufficient insulin to meet the increased hormone demand, caused by insulin resistance. In obesity, enlargement of adipocytes contribute to their dysfunction, which is characterized by the abnormal release of some bioactive products such as non-esterified free fatty acids (NEF As). Chronic plasma elevation of NEF As elicits β-cell dysfunction and death, thereby, representing a key feature for development of diabetes in obesity (diabesity). Palmitate is the most abundant circulating NEF As in obesity, which triggers adipocytes and β-cell dysfunction. The effects of palmitate rely on the induction of the cJun N-terminal kinase (JNK) pathway. Activation of JNK promotes both β-cells dysfunction and insulin resistance in adipocytes. This thesis was undertaken to investigate the mechanisms accounting for the induction of the JNK pathway caused by palmitate. JNK is regulated by the scaffold protein JNK interacting protein-1, also called islet brain 1 (JIP-1/IB1). The levels of JDM/IB1 are critical for glucose homeostasis, as genetic variations within the gene were associated with diabetes. We found that activation of JNK in both, β-cells exposed to palmitate, and in adipocytes of obese mice, results from variations in the expression of JIP-l/EBl. Modifications in the JIP-1/IB1 levels were the consequence of abnormal expression of the inducible cAMP early repressor (ICER) in the two cell types. In addition, our data show that this repressor plays a key role in abnormal production of adipocyte hormones and β-cell dysfunction evoked by the pro-atherogenic oxidized LDL. Taken together, this study proposes that fine-tuning of appropriate levels of JIP-l/EBl, and ICER could circumvent β-cell failure, adipocyte dysfunction, and thereby, development of diabesity.

A role for the transcriptional repressor ICER in the molecular pathogenesis of type 2 diabetes

AbstractType 2 diabetes (T2D) is a metabolic disease which affects more than 200 millions people worldwide. The progression of this affection reaches nowadays epidemic proportions, owing to the constant augmentation in the frequency of overweight, obesity and sedentary. The pathogenesis of T2D is characterized by reduction in the action of insulin on its target tissues - an alteration referred as insulin resistance - and pancreatic β-cell dysfunction. This latter deterioration is defined by impairment in insulin biosynthesis and secretion, and a loss of β-cell mass by apoptosis. Environmental factors related to T2D, such as chronic elevation in glucose and free fatty acids levels, inflammatory cytokines and pro-atherogenic oxidized low- density lipoproteins (LDL), contribute to the loss of pancreatic β-cell function.In this study, we have demonstrated that the transcription factor Inducible Cyclic AMP Early Repressor (ICER) participates to the progression of both β-cell dysfunction and insulin resistance. The expression of this factor is driven by an alternative promoter and ICER protein represents therefore a truncated product of the Cyclic AMP Response Element Modulator (CREM) family which lacks transactivation domain. Consequently, the transcription factor ICER acts as a passive repressor which reduces expression of genes controlled by the cyclic AMP and Cyclic AMP Response Element Binding protein (CREB) pathway.In insulin-secreting cells, the accumulation of reactive oxygen species caused by environmental factors and notably oxidized LDL - a process known as oxidative stress - induces the transcription factor ICER. This transcriptional repressor hampers the secretory capacity of β-cells by silencing key genes of the exocytotic machinery. In addition, the factor ICER reduces the expression of the scaffold protein Islet Brain 1 (IB 1 ), thereby favouring the activation of the c-Jun N-terminal Kinase (JNK) pathway. This triggering alters in turn insulin biosynthesis and survival capacities of pancreatic β-cells.In the adipose tissue of mice and human subjects suffering from obesity, the transcription factor ICER contributes to the alteration in insulin action. The loss in ICER protein in these tissues induces a constant activation of the CREB pathway and the subsequent expression of the Activating Transcription Factor 3 (ATF3). In turn, this repressor reduces the transcript levels of the glucose transporter GLUT4 and the insulin-sensitizer peptide adiponectin, thereby contributing to the diminution in insulin action.In conclusion, these data shed light on the important role of the transcriptional repressor ICER in the pathogenesis of T2D, which contributes to both alteration in β-cell function and aggravation of insulin resistance. Consequently, a better understanding of the molecular mechanisms responsible for the alterations in ICER levels is required and could lead to develop new therapeutic strategies for the treatment of T2D.RésuméLe diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique qui affecte plus de 200 millions de personnes dans le monde. La progression de cette affection atteint aujourd'hui des proportions épidémiques imputables à l'augmentation rapide dans les fréquences du surpoids, de l'obésité et de la sédentarité. La pathogenèse du DT2 se caractérise par une diminution de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles - un processus nommé insulino-résistance - ainsi qu'une dysfonction des cellules β pancréatiques sécrétrices d'insuline. Cette dernière détérioration se définit par une réduction de la capacité de synthèse et de sécrétion de l'insuline et mène finalement à une perte de la masse de cellules β par apoptose. Des facteurs environnementaux fréquemment associés au DT2, tels l'élévation chronique des taux plasmatiques de glucose et d'acides gras libres, les cytokines pro-inflammatoires et les lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées, contribuent à la perte de fonction des cellules β pancréatiques.Dans cette étude, nous avons démontré que le facteur de transcription « Inducible Cyclic AMP Early Repressor » (ICER) participe à la progression de la dysfonction des cellules β pancréatiques et au développement de Pinsulino-résistance. Son expression étant gouvernée par un promoteur alternatif, la protéine d'ICER représente un produit tronqué de la famille des «Cyclic AMP Response Element Modulator » (CREM), sans domaine de transactivation. Par conséquent, le facteur ICER agit comme un répresseur passif qui réduit l'expression des gènes contrôlés par la voie de l'AMP cyclique et des « Cyclic AMP Response Element Binding protein » (CREB).Dans les cellules sécrétrices d'insuline, l'accumulation de radicaux d'oxygène libres, soutenue par les facteurs environnementaux et notamment les LDL oxydées - un processus appelé stress oxydatif- induit de manière ininterrompue le facteur de transcription ICER. Ainsi activé, ce répresseur transcriptionnel altère la capacité sécrétoire des cellules β en bloquant l'expression de gènes clés de la machinerie d'exocytose. En outre, le facteur ICER favorise l'activation de la cascade de signalisation « c-Jun N- terminal Kinase » (JNK) en réduisant l'expression de la protéine « Islet Brain 1 » (IB1), altérant ainsi les fonctions de biosynthèse de l'insuline et de survie des cellules β pancréatiques.Dans le tissu adipeux des souris et des sujets humains souffrant d'obésité, le facteur de transcription ICER contribue à l'altération de la réponse à l'insuline. La disparition de la protéine ICER dans ces tissus entraîne une activation persistante de la voie de signalisation des CREB et une induction du facteur de transcription « Activating Transcription Factor 3 » (ATF3). A son tour, le répresseur ATF3 inhibe l'expression du transporteur de glucose GLUT4 et du peptide adipocytaire insulino-sensibilisateur adiponectine, contribuant ainsi à la diminution de l'action de l'insuline en conditions d'obésité.En conclusion, à la lumière de ces résultats, le répresseur transcriptionnel ICER apparaît comme un facteur important dans la pathogenèse du DT2, en participant à la perte de fonction des cellules β pancréatiques et à l'aggravation de l'insulino-résistance. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires responsables de l'altération des niveaux du facteur ICER pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies de traitement du DT2.Résumé didactiqueL'énergie nécessaire au bon fonctionnement de l'organisme est fournie par l'alimentation, notamment sous forme de sucres (glucides). Ceux-ci sont dégradés en glucose, lequel sera distribué aux différents organes par la circulation sanguine. Après un repas, le niveau de glucose sanguin, nommé glycémie, s'élève et favorise la sécrétion d'une hormone appelée insuline par les cellules β du pancréas. L'insuline permet, à son tour, aux organes, tels le foie, les muscles et le tissu adipeux de capter et d'utiliser le glucose ; la glycémie retrouve ainsi son niveau basai.Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique qui affecte plus de 200 millions de personnes dans le monde. Le développement de cette affection est causée par deux processus pathologiques. D'une part, les quantités d'insuline secrétée par les cellules β pancréatiques, ainsi que la survie de ces cellules sont réduites, un phénomène connu sous le nom de dysfonction des cellules β. D'autre part, la sensibilité des tissus à l'insuline se trouve diminuée. Cette dernière altération, l'insulino-résistance, empêche le transport et l'utilisation du glucose par les tissus et mène à une accumulation de ce sucre dans le sang. Cette stagnation de glucose dans le compartiment sanguin est appelée hyperglycémie et favorise l'apparition des complications secondaires du diabète, telles que les maladies cardiovasculaires, l'insuffisance rénale, la cécité et la perte de sensibilité des extrémités.Dans cette étude, nous avons démontré que le facteur ICER qui contrôle spécifiquement l'expression de certains gènes, contribue non seulement à la dysfonction des cellules β, mais aussi au développement de l'insulino-résistance. En effet, dans les cellules β pancréatiques en conditions diabétiques, l'activation du facteur ICER altère la capacité de synthèse et de sécrétion d'insuline et réduit la survie ces cellules.Dans le tissu adipeux des souris et des sujets humains souffrant d'obésité, le facteur ICER contribue à la perte de sensibilité à l'insuline. La disparition d'ICER altère l'expression de la protéine qui capte le glucose, le transoprteur GLUT4, et l'hormone adipocytaire favorisant la sensibilité à l'insuline, nommée adiponectine. Ainsi, la perte d'ICER participe à la réduction de la captation de glucose par le tissue adipeux et au développement de l'insulino-résistance au cours de l'obésité.En conclusion, à la lumière de ces résultats, le facteur ICER apparaît comme un contributeur important à la progression du DT2, en soutenant la dysfonction des cellules β pancréatiques et l'aggravation de l'insulino-résistance. Par conséquent, l'étude des mécanismes responsables de la dérégulation du facteur ICER pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies de traitement du DT2.