Influences of body weight, body composition, and substrate oxidation rate on resting postabsorptive glucose production and gluconeogenesis.

OBJECTIVE: To determine the influence of body weight, fat mass, and fat distribution on resting endogenous glucose production in healthy lean and overweight individuals. DESIGN: measurements were performed in the resting postabsorptive state in individuals receiving an unrestricted diet. SETTING: Institute of Physiology of Lausanne University. MEASUREMENTS: resting post absorptive glucose production, glycogenolysis and gluconeogenesis; resting energy expenditure and net substrate oxidation. RESULTS: Endogenous glucose production was positively correlated with body weight, lean body mass, energy expenditure and carbohydrate oxidation. Gluconeogenesis was positively correlated with net lipid oxidation and energy expenditure, and negatively correlated with net carbohydrate oxidation. No correlation with body fat or fat distribution was observed. CONCLUSIONS: Gluconeogenesis shows a large interindividual variability. Net lipid oxidation and not body fat appears to be a major determinant of gluconeogenesis.

Substrate specificity of human kallikrein 2 (hK2) as determined by phage display technology.

Human glandular kallikrein 2 (hK2) is a trypsin-like serine protease expressed predominantly in the prostate epithelium. Recently, hK2 has proven to be a useful marker that can be used in combination with prostate specific antigen for screening and diagnosis of prostate cancer. The cleavage by hK2 of certain substrates in the proteolytic cascade suggest that the kallikrein may be involved in prostate cancer development; however, there has been very little other progress toward its biochemical characterization or elucidation of its true physiological role. In the present work, we adapt phage substrate technology to study the substrate specificity of hK2. A phage-displayed random pentapeptide library with exhaustive diversity was generated and then screened with purified hK2. Phages displaying peptides susceptible to hK2 cleavage were amplified in eight rounds of selection and genes encoding substrates were transferred from the phage to a fluorescent system using cyan fluorescent protein (derived from green fluorescent protein) that enables rapid determination of specificity constants. This study shows that hK2 has a strict preference for Arg in the P1 position, which is further enhanced by a Ser in P'1 position. The scissile bonds identified by phage display substrate selection correspond to those of the natural biological substrates of hK2, which include protein C inhibitor, semenogelins, and fibronectin. Moreover, three new putative hK2 protein substrates, shown elsewhere to be involved in the biology of the cancer, have been identified thus reinforcing the importance of hK2 in prostate cancer development.

New human kallikrein 14: enzymatic characterization and inhibitors development.

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC En biologie, si une découverte permet de répondre à quelques questions, en général elle en engendre beaucoup d'autres. C'est ce qui s'est produit récemment dans le monde des kallicréines. De la famille des protéases, protéines ayant la faculté de couper plus ou moins spécifiquement d'autres protéines pour exercer un rôle biologique, la famille des kallicréines humaines n'était composée que de 3 membres lors du siècle dernier. Parmi eux, une kallicréine mondialement utilisée pour détecter le cancer de la prostate, le PSA. En 2000, un chercheur de l'hôpital universitaire Mont Sinaï à Toronto, le Professeur Eleftherios Diamandis, a découvert la présence de 12 nouveaux gènes appartenant à cette famille, situés sur le même chromosome que les 3 premières kallicréines. Cette découverte majeure a placé les spécialistes des kallicréines face à une montagne d'interrogations car les fonctions de ces nouvelles protéases étaient totalement inconnues. La kallicréine humaine 14 (hK14) présente un intérêt particulier, car elle se retrouve associée à différents cancers, notamment les carcinomes ovariens et mammaires. Cette association ne répond cependant pas à la fonction de cette protéase. L'objectif de ce travail de thèse était donc de découvrir, dans un premier temps, la spécificité de cette nouvelle kallicréine, c'est-à-dire le type de coupure qu'elle engendre au niveau des protéines qu'elle cible. Utilisant une technologie de pointe qui exploite la propriété des bactériophages à se répliquer dans les bactéries à l'infini, des dizaines de millions de combinaisons protéiques aléatoires ont été présentées à hK14, qui a pu sélectionner celles qui lui étaient favorables pour la coupure. Cette technique qualitative porte le nom de Phage Display Substrate. Une fois la sélection réalisée, il fallait transférer ces séquences coupées ou substrats dans un système permettant de donner une valeur quantitative à l'efficacité de coupure. Pour cela nous avons développé une technologie qui permet d'évaluer cette efficacité en utilisant des protéines fluorescentes de méduse, modifiées génétiquement, dont l'excitation de la première (CFP : cyan fluorescent protein) par la lumière à une certaine longue d'onde permet le transfert d'énergie à la seconde (YFP : yellow fluorescent protein), via un substrat qui les lie. Pour que ce transfert d'énergie se produise, il faut que les deux protéines fluorescentes soient proches, comme c'est le cas lorsqu'elles sont liées par un substrat. La coupure de ce lien provoque un changement de transfert d'énergie qui est quantifiable en utilisant un spectrofluoromètre. Cette technologie permet donc de suivre la réaction d'hydrolyse (coupure) des protéases. Afin de poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre la fonction biologique d'hK14 ainsi que son éventuelle implication dans le cancer, nous avons développé des inhibiteurs spécifiques d'hK14. Les séquences qui on été le plus efficacement coupées par hK14 ont été utilisées pour transformer deux types d'inhibiteurs classiques, qui circulent dans notre sang, en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Selon les résultats obtenus in vitro, ils pourront être évalués in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. RESUME Les protéases sont des enzymes impliquées dans des processus physiologiques mais aussi parfois pathologiques. La famille des kallicréines tissulaires humaines représente le plus grand groupe de protéases humaines, dont plusieurs pourraient participer au développement de certaines maladies. D'autre part, ces protéases sont apparues comme des marqueurs de pathogénicité potentiels, notamment dans les cas de cancers hormono-dépendants. La kallicréine humaine 14 a été récemment découverte et son implication dans quelques maladies, particulièrement dans le cas de tumeurs, semble probable. En effet, son expression génique est augmentée au niveau des tissus cancéreux de la prostate et du sein et son expression protéique s'est révélée plus élevée dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein ou des ovaires. Cependant, comme c'est le cas pour la plupart des kallicréines, sa fonction est encore inconnue. Afin de mieux connaître son rôle biologique et/ou pathologique, nous avons décidé de caractériser son activité enzymatique. Nous avons tout d'abord mis au point un système de substrats entièrement biologique permettant d'étudier in vitro l'activité des protéases. Ce système est basé sur le phénomène de FRET, à savoir le transfert d'énergie de résonance fluorescente qui intervient entre deux molécules fluorescentes voisines si le spectre d'émission de la protéine donneuse chevauche le spectre d'excitation de la protéine receveuse. Nous avons fusionné de manière covalente une protéine fluorescente bleue (CFP) et une jaune (YFP) en les liant avec diverses séquences. Par clivage de la séquence de liaison, une perte du transfert d'énergie peut être mesurée par un spectrofluoromètre. Cette technologie représente un moyen facile de suivre la réaction d'hydrolyse des protéases. Les conditions optimales de production de ces substrats CFP-YFP ont été déterminées, de même que les paramètres pouvant éventuellement influencer le FRET. Ce système possède une grande résistance à la protéolyse non spécifique et est applicable à un grand nombre de protéase. Contrairement aux substrats fluorogéniques, il permet d'étudier les acides aminés se trouvant des deux côtés du site de clivage. Ce système étant entièrement biologique, il est le reflet des interactions protéine-protéine et représente un outil biologique facile, bon marché et rapide pour caractériser les protéases. Dans un premier temps, hK14 a été mise en présence d' une banque de haute diversité de pentapeptides aléatoires présentée à la surface de phages afin d'identifier des substrats spécifiques. Ensuite, le système CFP-YFP a été employé pour trier les peptides sélectionnés afin d'identifier les séquences de substrats les plus sensibles et spécifiques pour hK14. Nous avons montré, qu'en plus de sa prévisible activité de type trypsine, hK14 possède aussi une très surprenante activité de type chymotrypsine. Les séquences les plus sensibles ont été choisies pour cribler la banque de donnée Swissprot, permettant ainsi l'identification de 6 substrats protéiques humains potentiels pour hK14. Trois d'entre eux, la laminine α-5, le collagène IV et la matriline-4, qui sont des composants de la matrice extracellulaire, ont démontré une grande susceptibilité à l'hydrolyse par hK14. De plus, la séparation éléctrophorétique a montré que la dégradation de la laminine α-5 et de la matriline-4 par hK14 devait se produire aux sites identifiés par la technologie du phage display. Pour terminer, nous avons transformé, par mutagenèse dirigée, deux serpines (inhibiteurs de protéases de type sérine) connues, AAT et ACT (alpha anti-trypsine et alpha anti-chymotrypsine), qui inhibent un vaste éventail d'enzymes humaines en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Ces inhibiteurs pourront être utilisés d'une part pour poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre l'implication d'hK14 dans des voies physiologiques ou dans le cancer et d'autre part pour les évaluer in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. SUMMARY Proteases consist of enzymes involved in physiological events, but also, in case of dysregulation, in pathogenicity. The human tissue kallikrein family represents the largest human protease cluster and includes several members that either could participate in the course of certain diseases or emerged as potential biological markers, especially in hormone dependent cancers. The human kallikrein 14 has been recently discovered and suggested implications in some disorders, particularly in tumors since its gene expression is up-regulated in prostate and breast cancer tissues and its protein expression increased in the serum of patients with breast and ovarian cancers. However, like most kallikreins, its function remains unknown. To better understand hK14 biological and/or pathological role, we decided to characterize its enzymatic activity. First of all, we developped a biological system suitable for in vitro study of protease activity. This system is based on the so-called FRET phenomenon, that is the Fluorescence Resonance Energy Transfer that occurs between two nearby fluorescent proteins if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. We fused covalently a cyan fluorescent protein (CFP) and a yellow fluorescent protein (YFP) with diverses sequences. Upon cleavage of the linker sequence by protease, the loss of energy transfer can be measured by a spectrofluorometer allowing an easy following of hydrolysis reaction. The optimal conditions to produce in bacterial system these CFP-YFP substrates were determined as well as the parameters that could eventually influence the FRET. This system demonstrated a high degree of resistance to non-specific proteolysis and applicability to various conditions corresponding to a great number of existing proteases. Other avantages are the possibility to study the amino acids located both sides of the cleavage site as well as the interest to work in a full biological system reflecting protein-protein interaction. A phage substrate library with exhaustive diversity was used prior to CFP-substrate-YFP system to isolate specific human kallikrein 14 substrates. After that the CFP-YFP system was used to sort peptides and identify highly sensitive and specific substrate sequences for hK14. We showed that besides its predictable trypsin-like activity, hK14 also possesses a surprising chymotrypsin-like activity. The screening of the Swissprot database was achieved with the most sensitive sequences and allowed the identification of 6 potential human protein substrates for hK14. Three of them, laminin α-5, collagen IV and matrilin-4, which are components of the extracellular matrix were incubated with hK14, by which they were efficiently hydrolyzed. Moreover, electrophoretic separation revealed that degradation of laminin α-5 and matrilin-4 by hK14 generated fragments with identical molecular size than the predicted N-terminal fragments that would result from hK14 specific cleavage, proving the value of phage display substrate to identify potential substrates. Finally, with site-directed mutagenesis, we transformed two well-known serpins (serine protease inhibitors), AAT and ACT (alpha anti-trypsin and alpha anti-chymotrypsin), which inhibit a vast spectrum of human enzymes into highly efficient and specific hK14 inhibitors. These inhibitors will be used to pursue experiments that could help understand hK14 implication in physiological pathways as well as in cancer biology and also to perform their in vivo evalution as potential cancer treatment.

Characterization of SKI-1/S1P-mediated processing of Arenavirus glycoprotein precursors

Arenaviruses are rodent-born world-wide distributed negative strand RNA viruses that comprise a number of important human pathogens including Lassa virus (LASV) which causes more than 3 00'000 infections annually in Western Africa. Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) is the prototypic member of the arenavirus family, which is divided in two major subgroups according to serological properties and geographical distribution, the Old World and New World arenaviruses. The envelope glycoprotein precursors (GPCs) of arenaviruses have to undergo proteolytic processing to acquire biological function and to be incorporated into progeny virions. A cellular enzyme is responsible for this processing: the Subtilisin Kexin Isozyme-1 or Site-1 protease (SKI- 1/S1P). In this thesis we have studied the relationship between SKI-1/S1P and the envelope GPs of arenaviruses. In a first project, we investigated the molecular interactions between SKI-1/SIP and arenavirus GPCs. Using SKI-1/SIP mutants, we confirmed previously published observations locating LCMV GPC and LASV GPC processing in the Late Golgi/TGN and ER/cis-Golgi, respectively. A single mutation in the cleavage site of LCMV was sufficient to re-locate SKI- 1/SIP-mediated processing from the late Golgi/TGN to the ER/cis-Golgi. We then demonstrated that the transmembrane domain, the C-terminal tail and the phosphorylation sites of SKI-1/S1P are dispensable for GPC processing. Additionally we identified a SKI- 1/S1P mutant defective for autoprocessing at site Β, B' that was selectively impaired in processing of viral GPCs but not cellular substrates. We also showed that a soluble variant of SKI-1/SIΡ was unable to cleave envelope GPs at the cell surface when added in the culture medium. This study highlighted a new target for small molecule inhibitors that would specifically impair GPC but not cellular substrate processing. In a second project, we identified and characterized two residues: LASV GPC Y253 and SKI-1/S1P Y285 that are important for the SKI-1/SIP-mediated LASV GPC cleavage. An alignment of GPC sequences revealed a conserved aromatic residue in P7 position in the GPCs of Old World and Clade C of New World arenaviruses. Mutations in GPC at position P7 impaired processing efficiency. In SKI-1/S1P, mutating Y285 into A negatively affected processing of substrates containing aromatic residues in P7, without affecting others. This property could be used to develop specific drugs targeting SKI-1/SIP-mediated cleavage of LASV GPC without affecting cellular substrates. As a third project we studied the role of the SKI-1/SIP-mediated processing and the unusual stable signal peptide (SSP) for the folding and secretion of soluble forms of the ectodomain of LASV and LCMV glycoproteins. We provide evidence that the transmembrane domain and the cytosolic tail are crucial for the stability of the prefusion conformation of arenavirus GP and that the SSP is required for transport and processing of full-length GP, but not the soluble ectodomain per se. Taken together, these results will lead to a better understanding of the complex interactions between arenavirus GPCs and SKI-1/S IP, paving the avenue for the development of novel anti-arenaviral therapeutics. - Les Arenavirus sont des virus à ARN négatif distribués mondialement et portés par les rongeurs. Cette famille de virus comprend des virus hautement pathogènes pour l'homme comme le virus de Lassa (LASV) qui cause plus de 300Ό00 infections par année en Afrique de l'Ouest. Le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) est le représentant de cette famille qui est divisée en deux sous-groupes selon des critères sérologiques et de distributions géographiques: arenavirus du Nouveau et de l'Ancien monde. Les glycoprotéines d'enveloppe de ces virus (GPCs) doivent être clivées pour être incorporées dans le virus et ainsi lui permettre d'être infectieux. Une enzyme cellulaire est responsable de ce clivage : la Subtilisin Kexin Isozyme-1 ou protéase Site-1 (SKI-l/SlP). Dans cette thèse, nous avons étudié la relation entre cette enzyme cellulaire et les GPs des arenavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié les interactions moléculaires entre SKI- 1/S1P et GPC. A l'aide de mutants de SKI-l/SlP, nous avons confirmé des résultats précédemment publiés montrant que les glycoprotéines d'enveloppe de LASV sont clivés dans le réticulum endoplasmique/cis-Golgi alors que celles de LCMV sont clivées dans le Golgi tardif/TGN. Une seule mutation dans le site de clivage de la glycoprotéine de LCMV est suffisante pour changer le compartiment cellulaire dans lequel est clivée cette glycoprotéine. Ensuite, nous avons démontré que le domaine transmembranaire, la partie cytosolique C-terminale ainsi que les sites de phosphorylations de cette enzyme ne sont pas indispensables pour permettre le clivage de GPC. De plus, nous avons identifié un mutant de SKI-l/SlP dans lequel Γ autoprocessing au site B,B' est impossible, incapable de cliver GPC mais toujours pleinement fonctionnelle envers ses substrats cellulaires. Nous avons également démontré qu'une forme soluble de SKI-l/SlP ajoutée dans le milieu de culture n'est pas capable de couper GPC à la surface de la cellule. Cette étude a défini une nouvelle cible potentielle pour un médicament qui inhiberait le clivage des glycoprotéines des arenavirus sans affecter les processus normaux de la cellule. Dans un second project, nous avons identifié deux acides aminés, LASV GPC Y253 et SKI-l/SlP Y285, qui sont important pour le clivage de LASV GPC. Un alignement des séquences de clivage des GPCs a montré qu'un résidu aromatique est conservé en position P7 du site de clivage chez tous les arenavirus de l'Ancien monde et dans le clade C des arenavirus du Nouveau monde. Une mutation de cet acide aminée dans GPC réduit l'efficacité de clivage par SKI-l/SlP. Mutation de la tyrosine 285 de SKI-l/SlP en alanine affecte négativement le clivage des substrats contenant un résidu aromatique en position P7 sans affecter les autres. Cette propriété pourrait être utilisée pour le développement de médicaments spécifiques ciblant le clivage de GPC. Finalement, nous avons étudié le rôle du processing accomplit par SKI-l/SlP et du signal peptide pour le pliage et la sécrétion de formes solubles des glycoprotéines de LASV et LCMV. Nous avons montré que le domaine transmembranaire et la partie cytosolique de GP sont crucials pour la stabilité de la conformation pre-fusionnelle des GPs et que SSP est nécessaire pour le transport et le processing de GP, mais pas de son ecto-domaine soluble. En conclusion, les résultats obtenus durant cette thèse permettrons de mieux comprendre les interactions complexes entre SKI-l/SlP et les glycoprotéines des arenavirus, ouvrant le chemin pour le développement de nouveaux médicaments anti-arénaviraux.

Probing the different chaperone activities of the bacterial HSP70-HSP40 system using a thermolabile luciferase substrate.

During mild heat-stress, a native thermolabile polypeptide may partially unfold and transiently expose water-avoiding hydrophobic segments that readily tend to associate into a stable misfolded species, rich in intra-molecular non-native beta-sheet structures. When the concentration of the heat-unfolded intermediates is elevated, the exposed hydrophobic segments tend to associate with other molecules into large stable insoluble complexes, also called "aggregates." In mammalian cells, stress- and mutation-induced protein misfolding and aggregation may cause degenerative diseases and aging. Young cells, however, effectively counteract toxic protein misfolding with a potent network of molecular chaperones that bind hydrophobic surfaces and actively unfold otherwise stable misfolded and aggregated polypeptides. Here, we followed the behavior of a purified, initially mostly native thermolabile luciferase mutant, in the presence or absence of the Escherichia coli DnaK-DnaJ-GrpE chaperones and/or of ATP, at 22 °C or under mild heat-stress. We concomitantly measured luciferase enzymatic activity, Thioflavin-T fluorescence, and light-scattering to assess the effects of temperature and chaperones on the formation, respectively, of native, unfolded, misfolded, and/or of aggregated species. During mild heat-denaturation, DnaK-DnaJ-GrpE+ATP best maintained, although transiently, high luciferase activity and best prevented heat-induced misfolding and aggregation. In contrast, the ATP-less DnaK and DnaJ did not maintain optimal luciferase activity and were less effective at preventing luciferase misfolding and aggregation. We present a model accounting for the experimental data, where native, unfolded, misfolded, and aggregated species spontaneously inter-convert, and in which DnaK-DnaJ-GrpE+ATP specifically convert stable misfolded species into unstable unfolded intermediates.

Une Suisse pas si paisible : la violence comme moyen de revendication politique (1950-2000)

L'objectif de cette recherche est d'interroger la place, la valeur et l'appréhension de la violence comme un moyen de revendication politique dans un pays comme la Suisse qui s'est construit un mythe de non-violence. Son système de démocratie directe, son aisance économique, sa stabilité politique et sa neutralité seraient censés l'épargner à la fois des insurrections violentes et des conflits internationaux. Toutefois, une recherche dans les archives de la presse nationale révèle que pour la période étudiée, entre 1950 et 2000, la Suisse a vécu les actions collectives violentes provenant des séparatistes et des anti-séparatistes jurassiens, de l'extrême gauche et de l'extrême droite. Le pays a également été le terrain des actions violentes provenant de mouvements de lutte armée clandestins allemands, italiens ainsi que des attentats organisés par des mouvements arabes, comme le Front Populaire de Libération de la Palestine (FPLP). Avec une approche mettant l'accent sur les acteurs, plusieurs axes de recherches ont été développés, notamment la fonction de l'action violente pour les individus et les mouvements qui y ont recouru afin d'exprimer une revendication, qu'elle ait été politique, sociale ou culturelle, et la façon dont le gouvernement suisse a perçu le danger représenté par les différents courants politiques. La question des réseaux développés avec les organisations de lutte armée clandestines a été abordée avec les cas de l'Allemagne et de l'Italie, pour ce qui est des mouvements établis en Europe, puis, avec les organisations issues des pays arabes, notamment le FPLP. L'analyse articule une réflexion à la fois empirique et théorique, ne perdant jamais de vue que la notion de violence est le lieu privilégié de jugements de valeur et que sa signification varie selon d'où provient le discours.

PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE 1 is a phototropin 1 binding protein required for phototropism.

Phototropism, or plant growth in response to unidirectional light, is an adaptive response of crucial importance. Lateral differences in low fluence rates of blue light are detected by phototropin 1 (phot1) in Arabidopsis. Only NONPHOTOTROPIC HYPOCOTYL 3 (NPH3) and root phototropism 2, both belonging to the same family of proteins, have been previously identified as phototropin-interacting signal transducers involved in phototropism. PHYTOCHROME KINASE SUBSTRATE (PKS) 1 and PKS2 are two phytochrome signaling components belonging to a small gene family in Arabidopsis (PKS1-PKS4). The strong enhancement of PKS1 expression by blue light and its light induction in the elongation zone of the hypocotyl prompted us to study the function of this gene family during phototropism. Photobiological experiments show that the PKS proteins are critical for hypocotyl phototropism. Furthermore, PKS1 interacts with phot1 and NPH3 in vivo at the plasma membrane and in vitro, indicating that the PKS proteins may function directly with phot1 and NPH3 to mediate phototropism. The phytochromes are known to influence phototropism but the mechanism involved is still unclear. We show that PKS1 induction by a pulse of blue light is phytochrome A-dependent, suggesting that the PKS proteins may provide a molecular link between these two photoreceptor families.

Substrate metabolism, nutrient balance and obesity development in children and adolescents: a target for intervention?

Obesity results from the organism's inability to maintain energy balance over a long term. Childhood obesity and its related factors and pathological consequences tend to persist into adulthood. A cluster of factors, including high energy density in the diet (high fat intake), low energy expenditure, and disturbed substrate oxidation, favour the increase in fat mass. Oxidation of three major macronutrients and their roles in the regulation of energy balance, particularly in children and adolescents, are discussed. Total glucose oxidation is not different between obese and lean children; exogenous glucose utilization is higher whereas endogenous glucose utilization is lower in obese compared with lean children. Carbohydrate composition of the diet determines carbohydrate oxidation regardless of fat content of the diet. Both exogenous and endogenous fat oxidation are higher in obese than in lean subjects. The influence of high fat intake on accumulation of fat mass is operative rather over a long term. Several future directions are addressed, such that a combination of increased physical activity and modification in diet composition, in terms of energy density and glycemic index, is recommended for children and adolescents.

The E3 ubiquitin ligase Itch regulates sorting nexin 9 through an unconventional substrate recognition domain.

The level of intracellular proteins is mainly regulated through modifications by ubiquitin ligases that target them for degradation. Members of the NEDD4 family of E3 ubiquitin ligases, such as Itch (atrophin-1 interacting protein 4), possess up to four WW domains for specific association with PY motif-containing substrates. We have identified sorting nexin 9 (SNX9), a protein involved in endocytic processes, as a new substrate of Itch. Itch ubiquitylates SNX9 and regulates intracellular SNX9 levels. Using truncated proteins, we found that the interaction with SNX9 is mediated by the proline-rich domain (PRD) of Itch, a domain distinct from the conventional WW recognition domain, and the SH3 domain of SNX9. Interaction with the PRD of Itch is essential for SNX9 ubiquitylation and degradation. Furthermore, this effect is specific for Itch, as NEDD4, a related PRD-containing E3 ligase, does not bind SNX9. SNX18, a second member of the SNX family containing an SH3 domain, was also found to bind to Itch. Our results indicate that the pool of substrates of NEDD4 family E3 ubiquitin ligases extends beyond proteins containing PY motifs.

Identification, using a siRNA screen approach, and molecular characterization of a new Fas pathway modulator: STK11/

Abstract : Apoptosis is an evolutionarily conserved cellular suicide mechanism that can be triggered by activation of various pathways, such as the Fas-Pathway. Upon stimulation by its specific ligand (FasL), present at the surface of Cytotoxic Τ lymphocytes, the death receptor Fas initiates a signaling cascade culminating in the activation of cellular caspases, leading thus to cell death of the target cell (e.g. transformed cell). Dysregulation of apoptosis in general, and of Fas pathway in particular, was shown to contribute to pathogenesis of cancers and many human diseases. Even though, during the last decades the molecular mechanisms of apoptosis have been widely studied, it is important to better understand the mechanisms leading to apoptosis, to improve our understanding of pathological processes, and generate more subtle apoptosis-modulating therapies to fight cancer and other diseases. In order to identify new components of the Fas signaling pathway, a screen based on the mechanism of RNA interference was undertaken. After a first and a second manual whole-kinome screen, we identified several strong positive hits that showed a protection against Fas ligand-induced apoptosis with distinct siRNAs, notably STK11, an interesting tumor suppressor mutated in several sporadic and inherited cancers. The STK11 functional characterization reveals that this kinase represents an apically acting general pro-apoptotic modulator of the extrinsic pathway (FasL, TRAIL, TNF-induced apoptosis), but not of the intrinsic apoptotic pathway. The STK11 action on the Fas pathway was shown to be dependent on its kinase activity, but independent of AMPK, a well-characterized STK11 downstream substrate. Furthermore, STK11 was shown to interact with caspase-8, a major mediator of the extrinsic pathway, and modulate its activity through an unclear mechanism that may involve an STK11-dependant caspase-8 phosphorylation. This modification may allow a proper caspase-8 polyubiquitination and activation in p62 sequestosmes aggregates, but may also increase the activation of caspase-8 at the DISC level. In addition, we observed that STK11 modulate not only the apoptotic pathway induced by Fas engagement, but also FasL-induced JNK and NF- KB, sustaining an upstream role of this kinase in the pathway. In conclusion, our report reveals that STK11 is an important pro-apoptotic modulator of the Fas pathway in particular, and extrinsic pathway in general. Our finding could explain, at least partially, why inactivating mutations of the kinase leads to cancer, by allowing resistance to apoptosis and accordingly evasion of immune surveillance. Résumé : L'apoptose est un mécanisme de suicide cellulaire, conservé dans diverses espèces, et qui au niveau moléculaire est déclenché par différentes voies de signalisation, comme par exemple lors de l'activation du récepteur Fas. La liaison du ligand FasL au récepteur de la mort Fas, induit une cascade de signalisation qui conduit à l'activation des caspases. Les lymphocytes Τ cytotoxiques peuvent utiliser la voie Fas pour induire la mort et se débarrasser de cellules dangereuses pour le reste de l'organisme, tel que les cellules transformées. La dysrégulation de l'apoptose en général, et de la voie Fas en particulier, peut contribuer à diverses maladies telles que le cancer. Même si ces dernières décennies, les mécanismes moléculaires conduisant à l'apoptose ont été extensivement étudiés, il reste néanmoins important de mieux comprendre le phénomène d'apoptose, pour améliorer notre compréhension des processus pathologiques, mais surtout dans le but de développer de nouvelles thérapies ciblant l'apoptose contre le cancer et d'autres pathologies. Pour identifier de nouveau constituants de la voie Fas, un criblage génétique basé sur l'interférence à l'ARN a été entrepris. Après un premier et un deuxième criblage d'une librairie du kinome, nous avons identifié différentes protéines qui pourraient jouer un rôle positif dans la voie Fas, et en particulier la protéine suppresseur de tumeur STK11, qui est fréquemment mutée dans divers cancers sporadiques et héréditaires. La caractérisation fonctionnelle de STK11 a révélé que cette kinase était un modulateur apical de la voie extrinsèque de l'apoptose en général (Fas, TNF, TRAIL), mais pas de la voie intrinsèque. L'action de STK11 sur la voie Fas est dépendante de sa fonction kinase, mais indépendante de l'AMPK, un substrat bien caractérisé de STK11. De plus, STK11 interagît avec la caspase-8, un constituant majeur de la voie Fas, et module son activité, par un mécanisme encore peu clair qui pourrait impliquer une phosphorylation de la caspase-8 par STK11. Cette modification pourrait permettre une activation optimale de la caspase-8 en jouant un rôle dans le processus de polyubiquitination de la caspase-8, phénomène qui semble être important pour l'activation de la caspase-8 dans des agrégats protéiques avec p62, mais qui pourrait aussi augmenter son activation au niveau du DISC. Finalement, nous avons observé que STK11 modulait non seulement la voie apoptotique déclenchée par l'activation de Fas, mais aussi les voies non-apoptotiques de Fas, comme JNK et NF-KB. En conclusion notre étude, révèle que STK11 est un important modulateur pro- apoptotique de la voie Fas, et de la voie extrinsèque en général. Cette découverte pourrait expliquer, du moins partiellement, pourquoi les mutations inactivatrices de STK11 conduisent au cancer, par une augmentation de la résistance à l'apoptose et donc par l'évasion de la surveillance immunitaire.

Study of the proteolytic activity of the paracaspase MALT1 in T cell activation

Summary : Several signalling cascades are initiated through the triggering of the T cell receptor (TCR) by an antigenic peptide expressed at the surface of an antigen presenting cell. These pathways lead to morphological changes controlling T cell adhesiveness and migration to the site of infection, and to the activation of transcription factors that regulate key genes for the proper development of the immune response. Amongst them, the nuclear factor xB (NF-κB) is the subject of intense research since more than twenty years because deregulated NF-κB signalling in lymphocytes can lead to immunodeficiency, autoimmunity or lymphomas. Therefore, the understanding of the molecular mechanisms regulating NF-κB activation is important for the development of new therapeutics aimed at treating various diseases. In T lymphocytes, a complex composed of CARMAI, BCL10 and MALT1 relays signals from TCR proximal events to NF-κB activation. Gene translocations of the BCL10 or MALTI genes or oncogenic mutations affecting CARNA 1 result in constitutive NF-κB activation and are related to the development of certain forms of lymphomas. MALT1 contains acaspase-like domain, but it is unknown whether this domain is proteolytically active. In this study, we found that MALT1 has arginine-directed proteolytic activity. We showed that the proteolytic activity of MALT 1 is key to TCR-induced NF-κB activation and production of interleukin 2. We identified BCL 10 as a MALT 1 substrate, and we showed that its cleavage regulates T cell adhesion to the extracellular matrix protein fibronectin. Furthermore, we identified caspase 10 as another substrate of MALT1. caspase 10 is a close homologue of caspase 8 and is known to be involved in the induction of apoptosis upon Fast or TRAIL stimulation. We showed that caspase 10 is important for TCR-induced NF-κB activation and interleukin 2 production, identifying for the first time a non apoptotic function for caspase 10. These data provide evidence for previously uncharacterized roles of MALT 1 and BCL 10 in the regulation of T cell adhesion and of caspase 10 in the activation of lymphocytes, and allow a better understanding of the molecular mechanisms of T lymphocyte activation. Since the proteolytic activity of MALT1 is essential to T cell activation, it suggests that the targeting of this activity may be relevant for the development of immunomodulatory or anticancer drugs. Résumé : De nombreuses voies de signalisation sont initiées via la stimulation des récepteurs des cellules T (TCR) par un peptide antigénique exprimé à la surface d'une cellule présentatrice d'antigènes. Ces cascades de signalisation produisent des changements morphologiques qui contrôlent l'adhésion des cellules T et leur migration vers le site d'infection. Elles contrôlent également l'activation de facteurs de transcription qui régulent la transcription de gènes importants pour la réponse immunitaire. Parmi ces derniers, le facteur nucléaire KB (NF-κB) joue un rôle essentiel, puisqu'une régulation aberrante de son activité dans les lymphocytes peut causer des immunodéficiences, des maladies autoimmunes ou des lymphomes. C'est pour cela que la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent l'activation de NF-κB est donc importante pour le développement de nouvelles thérapies. Un complexe contenant les protéines CAIZMAI, BCL10 et MALT1 transmet, dans les lymphocytes T, le signal du TCR vers l'activation de NF-κB. Des translocations des gènes qui codent pour BCL10 et MALTI et des mutations affectant la fonction de CARNAI ont été liées au développement de certaines formes de lymphomes. MALTI contient un domaine qui ressemble au domaine catalytique présent dans les caspases, mais il n'est pas connu si ce domaine a une activité protéolytique. Dans cette étude, nous avons découvert que MALTI est une protéase qui a une spécificité pour les acides aminés basiques comme l'arginine. Nous montrons que l'activité protéolytique de MALTI est importante pour l'activation de NF-κB et la production d'interleukine 2 après stimulation du TCR. Nous avons observé que BCL10 est clivé par MALTI pendant l'activation des lymphocytes T, et que ce clivage est impliqué dans la régulation de l'adhésion des lymphocytes T à la fibronectin, une protéine de la matrice extracellulaire. De plus, nous avons identifié que la caspase 10, qui a une grande homologie avec la caspase 8 et qui jusqu'à maintenant est connue pour son rôle dans l'induction de la mort cellulaire en réponse à une stimulation par Fast ou par TRAIL, est également un substrat de MALT 1. En montrant que la caspase 10 est nécessaire à l' activation de NF-icB et à la production de l'interleukine 2 après stimulation du TCR, nous décrivons pour la première fois une fonction non apoptotique de la caspase 10. Ces résultats décrivent de nouveaux rôles pour MALT1 et BCL10 dans le contrôle de l'adhésion des lymphocytes T et de la caspase 10 pour l'activation des lymphocytes T. Puisque l'activité protéolytique de MALT1 est essentielle pour l'activation des lymphocytes T, nous suggérons que cibler cette activité protéolytique de MALT 1 pourrait amener de nouvelles possibilités de traitement de maladies où une activation aberrante des lymphocytes est impliquée.

Sténose oesophagienne non-néoplasique: pas toujours si bénigne [Non-neoplastic esophageal stenosis: not always so benign].

Esophageal intramural pseudodiverticulosis is a rare pathology whose etiology is unknown, but which is frequently associated with three highly prevalent entities: esophageal reflux disease, esophageal candidosis and alcoholic esophagitis. With conservative treatment the course of these pathologies is usually benign. However, some severe cases are resistant to conservative treatment and may require more aggressive management. We here present the case of patient suffering from a severe esophagitis complicated by chronic mediastinitis with life-threatening repercussions, requiring esophagectomy as treatment.