Plasma ionized magnesium during acute hyperventilation in humans.

1. Respiratory alkalosis accompanies the clinical syndrome of tetany, precipitates cardiac arrhythmias and predisposes to coronary vasoconstriction. Magnesium plays a critical role in the maintenance of membrane function, and magnesium depletion is often associated with cardiac arrhythmias or vasoconstriction. 2. As technology for detecting circulating ionized magnesium (the most interesting form with respect to physiological and biological properties) is now available in the form of new magnesium-selective electrodes, the effect of respiratory alkalosis induced by voluntary overbreathing for 30 min on circulating ionized magnesium was studied in eight healthy subjects. 3. The total plasma magnesium concentration was not modified by hyperventilation. On the contrary, hyperventilation was associated with a significant reduction in the ionized magnesium concentration of 0.05 (0.02-0.15) mmol/l (median and range) and in the free magnesium fraction of 0.06 (0.01-0.19). During hyperventilation the relative intravascular magnesium mass, calculated from changes in total plasma magnesium concentration and haematocrit, decreased significantly. 4. It is concluded that acute overbreathing reduces the circulating ionized magnesium concentration and the intravascular magnesium mass. It is therefore conceivable that extracellular magnesium deficiency is at least a subsidiary cause of the syndrome of tetany and the cardiac complications that are precipitated by hyperventilation.

Environmental and biological controls on the geochemistry (δ18O, δ13C, Mg/Ca, and Sr/Ca) of living ostracods from Lake Geneva

ABSTRACT : Ostracods are benthic microcrustaceans enclosed in low-Mg calcite bivalves. Stable isotope compositions, Mg/Ca, and Sr/Ca ratios of ostracod fossil valves have proven useful to reconstruct past environmental conditions. Yet, several discrepancies persist and the influence of many factors remains unclear. It is the aim of this study to improve the use of ostracod valve geochemistry as palaeoenvironmental proxies by examining the extent of isotope fractionation and trace element partitioning during valve calcification. To achieve this, the environmental parameters (pH, temperature) and chemical composition of water (C-and O-isotope composition and calcium, magnesium, and strontium content) were measured at sites where living ostracods were sampled. The sampling was on a monthly basis over the course of one year at five different water depths (2, 5, 13, 33, and 70 m) in Lake Geneva, Switzerland. The one-year sampling enabled collection of environmental data for bottom and interstitial pore water. In littoral to sublittoral zones, C-isotope composition of DIC and the Mg/Ca and Sr/Ca ratios of water are found to vary concomitantly with water temperature. This is due to the precipitation of calcite, which is induced by higher photosynthetic activity as temperature and/or solar radiation intensify in summer. In deeper zones, environmental parameters remain largely constant throughout the year. Variations of pH, DIC concentrations and C-isotope compositions in interstitial water result from aerobic as well as anaerobic respiration, calcite dissolution and methanogenesis. Bathymetric distribution, life cycles, and habitats were derived for 15 ostracod species and are predominantly related to water temperature and sediment texture. O-isotope compositions of ostracod valves in Lake Geneva reflect that of water and temperature. However, offsets of up to 3 permil are observed in comparison with proposed inorganic calcite precipitation equilibrium composition. Deprotonation of HCO3- and/or salt effect at crystallisation sites may explain the disequilibrium observed for O-isotopic compositions. C-isotope compositions of ostracod valves are not as well constrained and appear to be controlled by a complex interaction between habitat preferences and seasonal as well as spatial variations of the DIC isotope composition. For infaunal forms, C-isotope compositions reflect mainly the variation of DIC isotope composition in interstitial pore waters. For epifaunal forms, C-isotope compositions reflect the seasonal variation of DIC isotope compositions. C-isotope compositions of ostracod valves is at equilibrium with DIC except for a small number of species (L. inopinata, L. sanctipatricii and possibly C. ophtalmica, and I. beauchampi). Trace element uptake differs considerably from species to species. For most epifaunal forms, trace element content follows the seasonal cycle, recording temperature increases and/or variations of Mg/Ca and Sr/Ca ratios of water. In contrast, infaunal forms are predominantly related to sediment pore water chemistry. RÉSUMÉ EN FRANÇAIS : Les ostracodes sont de petits crustacés benthiques qui possèdent une coquille faite de calcite à faible teneur en magnésium. La composition isotopique et les rapports Mg/Ca et Sr/Ca d'ostracodes fossiles ont été utilisés maintes fois avec succès pour effectuer des reconstructions paléoenvironnementales. Néanmoins, certains désaccords persistent sur l'interprétation de ces données. De plus, l'influence de certains facteurs pouvant biaiser le signal reste encore inconnue. Ainsi, le but de cette étude est de rendre plus performant l'emploi de la composition géochimique des ostracodes comme indicateur paléoenvironnemental. Pour réaliser cela, cinq sites situés dans le Léman à 2, 5, 13, 33 et 70 m de profondeur ont été choisis pour effectuer les échantillonnages. Chaque site a été visité une fois par mois durant une année. Les différents paramètres environnementaux (pH, température) ainsi que la composition géochimique de l'eau (composition isotopique de l'oxygène et du carbone ainsi que teneur en calcium, magnésium et strontium) ont été déterminés pour chaque campagne. Des ostracodes vivants ont été récoltés au cinq sites en même temps que les échantillons d'eau. Ce travail de terrain a permis de caractériser la géochimie de l'eau se trouvant juste au-dessus des sédiments ainsi que celle de l'eau se trouvant dans les interstices du sédiment. Dans les zones littorales à sublittorales, la composition isotopique du carbone inorganique dissout (CID) ainsi que les rapports Mg/Ca et Sr/Ca de l'eau varient linéairement avec la température. Ceci peut être expliqué par la précipitation de calcite qui est contrôlée par l'activité photosynthétique, variant elle même linéairement avec la température. Dans les zones plus profondes, les paramètres environnementaux restent relativement constants tout au long de l'année. Les variations du pH, de la concentration et de la composition isotopique du CID dans les sédiments résultent de la libération de carbone engendrée par la dégradation de la matière organique avec présence d'oxygène ou via réduction de nitrates et de sulfates, par la dissolution de carbonates, ainsi que par la méthanogenèse. La distribution bathymétrique, le cycle de vie ainsi que l'habitat de 15 espèces ont été déterminés. Ceux-ci sont principalement reliés à la température de l'eau et à la texture des sédiments. La composition isotopique de l'oxygène des valves d'ostracodes reflète celle de l'eau et la température qui régnait lors de la calcification. Néanmoins, des écarts pouvant aller jusqu'à 3 0/00 par rapport à l'équilibre théorique ont été obtenus. La déprotonation de HCO3 ou un 'effet de sel' pourrait être à l'origine du déséquilibre observé. La composition isotopique du carbone des valves d'ostracodes n'est pas aussi bien cernée. Celle-ci semble être principalement contrôlée par une interaction complexe entre l'habitat des ostracodes et les variations saisonnières et spatiales de la composition isotopique du CID. Pour les espèces endofaunes, la composition isotopique du carbone reflète principalement la variation de la composition isotopique du CID à l'intérieur des sédiments. Pour les formes épifaunes, c'est la variation saisonnière de la composition du CID qui contrôle celle de la coquille des ostracodes. En général, la composition isotopique du carbone des valves d'ostracodes est en équilibre avec celle de CID, hormis pour quelques rares espèces (L. inopinata, L. sanctipatricii et peut-être C. ophtalmica et I. beauchampi). L'incorporation des éléments traces diffère passablement d'une espèce à l'autre. Pour la plupart des espèces épifaunes, la teneur en éléments traces des coquilles reflète les variations saisonnières. Ces espèces semblent enregistrer les variations soit de la température soit des rapports Mg/Ca et Sr/Ca de l'eau. La teneur en élément traces des formes infaunales, au contraire, est principalement reliée à la chimie de l'eau interstitielle. RÉSUMÉ GRAND-PUBLIC : La connaissance de l'évolution du climat dans le futur est primordiale pour notre société, car elle permet de développer différentes stratégies pour faire face aux problèmes engendrés pas le changement climatique : stratégies environnementale, humanitaire, ou encore économique. Cette problématique est actuellement, à juste titre, sujet d'une vive préoccupation. La géologie peut-elle contribuer à l'effort communautaire entrepris? Naturellement, ce sont les climatologues qui sont sur le devant de la scène. Il n'empêche que ces derniers, pour pouvoir prédire l'avenir, doivent s'appuyer sur le passé. La géologie est alors d'un grand intérêt car c'est effectivement la seule science qui permette d'estimer les variations climatiques à grande échelle sur de longues périodes. Ainsi, voulant moi-même contribuer aux recherches menées dans ce domaine, je me suis tourné à la fin de mes études vers la paléoclimatologie, science qui a pour but de reconstruire le climat des temps anciens. Nous nous sommes rendu compte que l'évolution climatique de la région où nous habitons n'avait pas encore fait le sujet d'études approfondies. Il est pourtant important de connaître la variation locale des changements climatiques pour obtenir des modèles climatiques fiables. En conséquence, un vaste projet a vu le jour : reconstruire, à l'aide des sédiments du lac Léman, les variations paléoclimatiques et paléo-environnementales depuis le retrait du Glacier de Rhône, il y a environ 15'000 ans, jusqu'à nos jours. Pour ce genre de travail, la géochimie, qui est une forme de chimie, utilisée en science de la terre regroupant la chimie classique et la chimie isotopique, est une alliée particulièrement efficace. Elle permet en effet, via différentes mesures faites sur des archives géologiques (par exemple des fossiles ou des sédiments) d'obtenir des informations, souvent quantitatives, sur les conditions (le climat, la flore ou encore la bio productivité, etc...) qui régnaient il y a fort longtemps. Les coquilles d'ostracodes, qui sont de petits animaux vivant au fond des lacs, sont une des archives les plus prometteuses. Ces animaux sont des petits crustacés s'entourant d'une coquille calcaire qu'ils sécrètent eux-mêmes. A la mort de l'animal, la coquille est intégrée dans les sédiments et reste intacte à travers les âges. Des études ont montré qu'en analysant la géochimie de ces coquilles fossiles, il est possible de reconstruire les conditions environnementales qui régnaient à l'époque de vie de ces fossiles. Cette démarche nécessite qu'une condition bien précise soit remplie: la composition géochimique de la coquille doit enregistrer de manière fidèle la chimie de l'eau et/ou la température de l'eau présentes au moment de la sécrétion de la coquille. Le but spécifique de notre recherche a précisément été d'étudier la façon dont la chimie de l'eau ainsi que sa température sont enregistrées dans la coquillé des ostracodes. Une fois les relations entre ces divers paramètres dans l'étant actuel du système établies, il sera alors possible de les utiliser pour interpréter des données issues de coquilles fossiles. Pour ce faire, nous avons mesuré la température de l'eau de manière continue et récolté mensuellement des échantillons d'eau et des ostracodes vivants pendant une année. Cinq sites situés à 2, 5, 13, 33 et 70 mètres de profondeur ont été choisis pour effectuer ces échantillonnages dans le Léman. Le travail de terrain nous a amené à étudier la biologie de 15 espèces. Nous avons pu établir la profondeur à laquelle vivent ces animaux, leur période de développement ainsi que leur habitat respectifs. Ces résultats ont permis de mieux cerner la relation qu'il existe entre la chimie de l'eau, sa température et la composition géochimique des coquilles d'ostracodes. Nous avons ainsi pu confirmer que les coquilles d'ostracodes enregistrent de manière fidèle la composition chimique et isotopique de l'eau. De même, nous avons pu établir de manière plus précise l'effet de la température sur la géochimie des coquilles. Néanmoins, les relations trouvées entre ces trois éléments sont plus complexes pour certaines espèces, cette complexité étant souvent liée à un caractère spécifique de leur écologie. Nous avons mis en lumière certains effets qui biaisent les résultats et défini précisément les conditions dans lesquelles on peut s'attendre à avoir des difficultés dans leur interprétation. Maintenant que nous avons établi les relations entre le climat actuel et la composition géochimique des coquilles d'ostracodes actuels, nous pouvons, sur la base de ce modèle, reconstruire le climat depuis le retrait du Glacier du Rhône jusqu'à nos jours à l'aide d'ostracodes fossiles. Mais cela est une autre histoire et fera, je l'espère, le sujet de nos futures recherches.

Novel soluble HLA-A2/MELAN-A complexes selectively stain a differentiation defective subpopulation of CD8+ T cells in patients with melanoma.

Multimeric MHC I-peptide complexes containing phycoerythrin-streptavidin are widely used to detect and investigate antigen-specific CD8+ (and CD4+) T cells. Because such reagents are heterogeneous, we compared their binding characteristics with those of monodisperse dimeric, tetrameric and octameric complexes containing linkers of variable length and flexibility on Melan-A-specific CD8+ T cell clones and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HLA-A*0201(+) melanoma patients. Striking binding differences were observed for different defined A2/Melan-A(26-35) complexes on T cells depending on their differentiation stage. In particular, short dimeric but not octameric A2/Melan-A(26-35) complexes selectively and avidly stained incompletely differentiated effector-memory T cells clones and populations expressing CD27 and CD28 and low levels of cytolytic mediators (granzymes and perforin). This subpopulation was found in PBMC from all six melanoma patients analyzed and proliferated on peptide stimulation with only modest phenotypic changes. By contrast influenza matrix(58-66) -specific CD8+ PBMC from nine HLA-A*0201(+) healthy donors were efficiently stained by A2/Flu matrix(58-61) multimers, but not dimer and upon peptide stimulation proliferated and differentiated from memory into effector T cells. Thus PBMC from melanoma patients contain a differentiation defective sub-population of Melan-A-specific CD8+ T cells that can be selectively and efficiently stained by short dimeric A2/Melan- A(26-35) complexes, which makes them directly accessible for longitudinal monitoring and further investigation.

Efficient in vivo induction of CTL by cell-associated covalent H-2Kd-peptide complexes.

A novel procedure is presented describing the induction of antigen-specific cytolytic T lymphocytes (CTL) in vivo, that uses as immunogen syngeneic Concanavalin A stimulated spleen cells expressing H-2Kd (Kd) molecules photocrosslinked with a photoreactive peptide derivative. The Kd restricted Plasmodium berghei circumsporozoite (PbCS) peptide 253-260 (YIPSAEKI) was conjugated with photoreactive iodo-4-azidosalicylic acid (IASA) at the NH2-terminus and with 4-azidobenzoic acid (ABA) at the TCR contact residue Lys259 to make IASA-YIPSAEK(ABA)I. Selective photoactivation of the IASA group allowed specific photoaffinity labeling of cell-associated Kd molecules. Optimal peptide derivative binding to Kd molecules of concanavalin A stimulated spleen cells was obtained upon 4-6 h incubation at 26 degrees C in the presence of human beta 2 microglobulin. Photocrosslinking prevented the rapid dissociation of cell-associated Kd-peptide derivative complexes at 37 degrees C. The photoaffinity labeled cells were injected i.p. into syngeneic recipients. After 10 days, the peritoneal exudate lymphocytes were harvested and in vitro stimulated with peptide derivative pulsed P815 mastocytoma cells. The resulting bulk cultures displayed high cytolytic activity that was specific for IASA-YIPSAEK(ABA)I and YIPSAEK(ABA)I. In contrast, peritoneal exudate lymphocytes from mice inoculated with concanavalin A blasts that were pulsed, but not photocrosslinked, with IASA-YIPSAEK(ABA)I expressed only marginal levels of IASA-YIPSAEK(ABA)I-specific cytolytic activity. This immunization strategy, using neither adjuvants nor potentially hazardous transfected/transformed cells, is safe and should be universally applicable.

In vivo expansion of T reg cells with IL-2-mAb complexes: induction of resistance to EAE and long-term acceptance of islet allografts without immunosuppression.

Via a transcription factor, Foxp3, immunoregulatory CD4(+)CD25(+) T cells (T reg cells) play an important role in suppressing the function of other T cells. Adoptively transferring high numbers of T reg cells can reduce the intensity of the immune response, thereby providing an attractive prospect for inducing tolerance. Extending our previous findings, we describe an in vivo approach for inducing rapid expansion of T reg cells by injecting mice with interleukin (IL)-2 mixed with a particular IL-2 monoclonal antibody (mAb). Injection of these IL-2-IL-2 mAb complexes for a short period of 3 d induces a marked (>10-fold) increase in T reg cell numbers in many organs, including the liver and gut as well as the spleen and lymph nodes, and a modest increase in the thymus. The expanded T reg cells survive for 1-2 wk and are highly activated and display superior suppressive function. Pretreating with the IL-2-IL-2 mAb complexes renders the mice resistant to induction of experimental autoimmune encephalomyelitis; combined with rapamycin, the complexes can also be used to treat ongoing disease. In addition, pretreating mice with the complexes induces tolerance to fully major histocompatibility complex-incompatible pancreatic islets in the absence of immunosuppression. Tolerance is robust and the majority of grafts are accepted indefinitely. The approach described for T reg cell expansion has clinical potential for treating autoimmune disease and promoting organ transplantation.

CD8beta endows CD8 with efficient coreceptor function by coupling T cell receptor/CD3 to raft-associated CD8/p56(lck) complexes.

The extraordinary sensitivity of CD8+ T cells to recognize antigen impinges to a large extent on the coreceptor CD8. While several studies have shown that the CD8beta chain endows CD8 with efficient coreceptor function, the molecular basis for this is enigmatic. Here we report that cell-associated CD8alphabeta, but not CD8alphaalpha or soluble CD8alphabeta, substantially increases the avidity of T cell receptor (TCR)-ligand binding. To elucidate how the cytoplasmic and transmembrane portions of CD8beta endow CD8 with efficient coreceptor function, we examined T1.4 T cell hybridomas transfected with various CD8beta constructs. T1.4 hybridomas recognize a photoreactive Plasmodium berghei circumsporozoite (PbCS) peptide derivative (PbCS (4-azidobezoic acid [ABA])) in the context of H-2K(d), and permit assessment of TCR-ligand binding by TCR photoaffinity labeling. We find that the cytoplasmic portion of CD8beta, mainly due to its palmitoylation, mediates partitioning of CD8 in lipid rafts, where it efficiently associates with p56(lck). In addition, the cytoplasmic portion of CD8beta mediates constitutive association of CD8 with TCR/CD3. The resulting TCR-CD8 adducts exhibit high affinity for major histocompatibility complex (MHC)-peptide. Importantly, because CD8alphabeta partitions in rafts, its interaction with TCR/CD3 promotes raft association of TCR/CD3. Engagement of these TCR/CD3-CD8/lck adducts by multimeric MHC-peptide induces activation of p56(lck) in rafts, which in turn phosphorylates CD3 and initiates T cell activation.

Molecular characterization of signalling complexes involved in G-protein coupled receptor-induced cardiac hypertrophy

In response to pathological stresses, the heart undergoes a remodelling process associated with cardiac hypertrophy. Since sustained hypertrophy can progress to heart failure, there is an intense investigation about the intracellular signalling pathways that control cardiomyocyte growth. Accumulating evidence has demonstrated that most stimuli known to initiate pathological changes associated with the development of cardiac hypertrophy activate G protein-coupled receptors (GPCRs) including the αl-adrenergic- (αl-AR), Angiotensin II- (AT-R) and endothelin-1- (ET-R) receptors. In this context, we have previously identified a cardiac scaffolding protein, called AKAP-Lbc (Α-kinase anchoring protein), with an intrinsic Rho specific guanine nucleotide exchange factor activity, that plays a key role in integrating and transducing hypertrophic signals initiated by these GPCRs (Appert-Collin, Cotecchia et al. 2007). Activated RhoA controls the transcriptional activation of genes involved in cardiomyocyte hypertrophy through signalling pathways that remain to be characterized. Here, we identified the nuclear factor-Kappa Β (NF-κΒ) activating kinase ΙΚΚβ as a novel AKAP-Lbc interacting protein. This raises the hypothesis that AKAP-Lbc might promote cardiomyocyte growth by maintaining a signalling complex that promotes the activation of the pro-hypertrophic transcription factor NF-κΒ. In fact, the activation of NF- κΒ-dependent transcription has been detected in numerous disease contexts, including hypertrophy, ischemia/reperfusion injury, myocardial infarction, allograft rejection, myocarditis, apoptosis, and more (Hall, Hasday et al. 2006). While it is known by more than a decade that NF-κΒ is a critical mediator of cardiac hypertrophy, it is currently poorly understood how pro-hypertrophic signals controlling NF-κΒ transcriptional activity are integrated and coordinated within cardiomyocytes. In this study, we show that AKAP-Lbc and ΙΚΚβ form a transduction complex in cardiomyocytes that couples activation of αl-ARs to NF-κB-mediated transcriptional reprogramming events associated with cardiomyocyte hypertrophy. In particular, we can show that activation of ΙΚΚβ within the AKAP-Lbc complex promotes NF-κB-dependent production of interleukine-6 (IL-6), which, in turn, enhances foetal gene expression. These findings indicate that the AKAP-Lbc/ΙΚΚβ complex is critical for selectively directing catecholamine signals to the induction of cardiomyocyte hypertrophy.

A dynamic view of hepatitis C virus replication complexes.

Hepatitis C virus (HCV) replicates its genome in a membrane-associated replication complex (RC). Specific membrane alterations, designated membranous webs, represent predominant sites of HCV RNA replication. The principles governing HCV RC and membranous web formation are poorly understood. Here, we used replicons harboring a green fluorescent protein (GFP) insertion in nonstructural protein 5A (NS5A) to study HCV RCs in live cells. Two distinct patterns of NS5A-GFP were observed. (i) Large structures, representing membranous webs, showed restricted motility, were stable over many hours, were partitioned among daughter cells during cell division, and displayed a static internal architecture without detectable exchange of NS5A-GFP. (ii) In contrast, small structures, presumably representing small RCs, showed fast, saltatory movements over long distances. Both populations were associated with endoplasmic reticulum (ER) tubules, but only small RCs showed ER-independent, microtubule (MT)-dependent transport. We suggest that this MT-dependent transport sustains two distinct RC populations, which are both required during the HCV life cycle.

Photoactive sawhorse-type diruthenium tetracarbonyl complexes

Sawhorse-type diruthenium tetracarbonyl complexes incorporating carboxyphenyl porphyrin bridges and pyridine axial ligands have been prepared, characterized and evaluated as potential photosensitizing and chemotherapeutic agents in several human cancer cells (A2780, A549, Me300, HeLa). The mono carboxyphenyl porphyrin derivatives, 5-(4-carboxyphenyl)-10,15,20-triphenyl-21,23H-porphyrin (HOOCR1-H2) and 5-(4-carboxyphenyl)-10,15,20-triphenylporphyrin-Zn (HOOCR1-Zn), after reaction with Ru-3(CO)(12) and pyridine, give the dinuclear complexes [Ru-2(CO)(4)(OOCR1-H2)(2)(NC5H5)(2)] (1) and [Ru-2(CO)(4)-(OOCR1-Zn)(2)(NC5H5)(2)] (2), respectively. Under the same reaction conditions, the di-carboxyphenyl porphyrin derivatives, 5,10-di(4-carboxyphenyl)-15,20-diphenyl-21,23H-porphyrin (HOOCR2-H2COOH) and 5,10-di(4-carboxyphenyl)-15,20-diphenylporphyrin-Zn (HOOCR2-ZnCOOH), give rise to the tetranuclear complexes, [{Ru-2(CO)(4)(NC5H5)(2)}(2)(OOCR2-H2COO)(2)] (3) and [{Ru-2(CO)(4)(NC5H5)(2! )}(2)(OOCR2-ZnCOO)(2)] (4), in which two sawhorse diruthenium tetracarbonyl units are linked by the di-carboxyphenyl porphyrin ligands. When tested in human cancer cell lines, both Zn(II) metallo-porphyrin derivatives 2 and 4 and the tetranuclear derivative 3 show some degree of cytotoxicity in the dark, but seem to present no phototoxicity upon irradiation at 652 nm. These results demonstrate the effect of the Zn(II) ion insertion into the porphyrin core, resulting in increased cytotoxicity and decreased phototoxicity. On the other hand, complex 1, the less cytotoxic derivative with IC50 > 170 mu M in HeLa cervix and A2780 ovarian cancer cell lines, shows an excellent phototoxicity toward these cancer cell lines with LD50 comprised between 4.5 and 7.5 J/cm(2) (irradiance 30 mW/cm(2)) at 5 mu M concentration (incubation time: 24 h). Overall, an excellent ratio between photo-and cytotoxicity has been found for the metal-free porphyrin derivative [Ru-2(CO)(4)(OOCR1-H2)(2)(! NC5H5)(2)] (1).

Antigen-secretory IgA immune complexes are retro-transported into mouse Peyer's patches: immunotargeting to dendritic cells

RÉSUMÉ Les plaques de Peyer (PP) représentent le site d'entrée majeur des pathogènes au niveau des muqueuses intestinales. Après avoir traversé la cellule M, l'antigène est pris en charge par les cellules dendritiques (DC) de la région sub-épithéliale du dôme des PP. Ces dernières activent une réponse immunitaire qui conduit à la production de l'IgA de sécrétion (SIgA), l'anticorps majeur au niveau muqueux. Des études précédentes dans notre laboratoire ont démontré qu'après administration de SIgA dans des anses intestinales de souris, les SIgA se lient spécifiquement aux cellules M, entrent dans les PP, et sont éventuellement internalisées par les DC. Le but de ce travail est de comprendre la relevance biologique de l'entrée des SIgA dans les PP et leur relevance physiologique dans l'homéostasie mucosale. Dans un premier temps, nous avons montré en utilisant une méthode de purification optimisée basée sur une isolation magnétique, que, en plus des DC myéloïdes (CD11c+/CD11b+) et des DC lymphoïdes (CD11c+/CD8+), les PP de souris contiennent un nouveau sous-type de DC exprimant les marqueurs CD11c et CD19. L'utilisation de la microscopie confocale nous a permis de démontrer que les DC myéloïdes internalisent des SIgA, contrairement aux DC lymphoïdes qui n'interagissent pas avec les SIgA, alors que le nouveau sous-type de DC exprimant CD19 lie les SIgA. En plus, nous avons démontré qu'aucune des DC de rate, de ganglion bronchique ou de ganglion inguinal interagit avec les SIgA. Dans le but d'explorer si les SIgA peuvent délivrer des antigènes aux DC des PP in vivo, nous avons administré des complexes immunitaires formés de Shigella flexneri complexées à des SIgA, dans des anses intestinales de souris. Nous avons observé une entrée dans les PP, suivie d'une migration vers les ganglions mésentériques drainants, contrairement aux Shigella flexneri seules, qui n'infectent pas la souris par la voie intestinale. Shigella flexneri délivrée par SIgA n'induit pas de destruction tissulaire au niveau de l'intestin. En plus de l'exclusion immunitaire, ces résultats suggèrent un nouveau rôle des SIgA, qui consiste à transporter des antigènes à l'intérieur des PP dans un contexte non-inflammatoire. RÉSUMÉ DESTINÉ À UN LARGE PUBLIC L'intestin a pour rôle principal d'absorber les nutriments digérés tout au long du tube digestif, et de les faire passer dans le compartiment intérieur sanguin. Du fait de son exposition chronique avec un monde extérieur constitué d'aliments et de bactéries, l'intestin est un endroit susceptible aux infections et a donc besoin d'empêcher l'entrée de microbes. Pour cela, l'intestin est tapissé de "casernes" appelées les plaques de Peyer, qui appartiennent à un système de défense appelé système immunitaire muqueux. Les plaques de Peyer sont composées de différents types de cellules, ayant pour rôle de contrôler l'entrée de microbes et de développer une réaction immunitaire lors d'infection. Cette réaction immunitaire contre les microbes (antigènes) débute par la prise en charge de l'antigène par des sentinelles, les cellules dendritiques. L'antigène est préparé de façon à être reconnu par d'autres cellules appelées lymphocytes T capables d'activer d'autres cellules, les lymphocytes B. La réaction immunitaire résulte dans la production par les lymphocytes B d'un anticorps spécifique appelé IgA de sécrétion (SIgA) au niveau de la lumière intestinale. De manière classique, le rôle de SIgA au niveau de la lumière intestinale consiste à enrober les microbes et donc exclure leur entrée dans le compartiment intérieur. Dans ce travail, nous avons découvert une nouvelle fonction des SIgA qui consiste à introduire des antigènes dans les plaques de Peyer, et de les diriger vers les cellules dendritiques. Sachant que les SIgA sont des anticorps qui ne déclenchent pas de réactions de défense violentes dites inflammatoires, l'entrée des antigènes via SIgA serait en faveur d'une défense intestinale maîtrisée sans qu'il y ait d'inflammation délétère. Ces résultats nous laissent supposer que l'entrée d'antigènes via SIgA pourrait conduire le système immunitaire muqueux à reconnaître ces antigènes de manière appropriée. Ce mécanisme pourrait expliquer les désordres immunitaires de types allergiques et maladies auto-immunitaires que l'on rencontre chez certaines personnes déficientes en IgA, chez qui cette lecture d'antigènes de manière correcte serait inadéquate. ABSTRACT Peyer's patches (PP) represent the primary site for uptake and presentation of ingested antigens in the intestine. Antigens are sampled by M cells, which pass them to underlying antigen-presenting cells including dendritic cells (DC). This leads to the induction of mucosal T cell response that is important for the production of secretory IgA (SIgA), the chief antibody at mucosal surfaces. Previous studies in the laboratory have shown that exogenous SIgA administrated into mouse intestinal loop binds specifically to M cells, enter into PP, and is eventually internalized by DC. The aim of this work is to understand the biological significance of the SIgA uptake by PP DC and its physiological relevance for mucosal homeostasis. As a first step, we have shown by using an optimized MACS method that, in addition to the CD11c+/CD11b+ (myeloid DC) and CD11c+/CD8+ (lymphoid DC) subtypes, mouse PP contain a novel DC subtype exhibiting both CD11c and CD19 markers. By using a combination of MACS isolation and confocal microscopy, we have demonstrated that in contrast to the lymphoid DC which do not interact with SIgA, the myeloid DC internalize SIgA, while the CD19+ subtype binds SIgA on its surface. Neither spleen DC, nor bronchial-lymph node DC, nor inguinal lymph node DC exhibit such a binding specificity. To test whether SIgA could deliver antigens to PP DC in vivo, we administered SIgA-Shigella flexneri immune complexes into mouse intestinal loop containing a PP. We found that (i) SIgA-Shigella flexneri immune complexes enter the PP and are internalized by sub-epithelial dome PP DC, in contrast to Shigella flexneri alone that does not penetrate the intestinal epithelia in mice, (ii) immune complexes migrate to the draining mesenteric lymph node, (iii) Shigella flexneri carried via SIgA do not induce intestinal tissue destruction. Our results suggest that in addition to immune exclusion, SIgA transports antigens back to the PP under non-inflammatory conditions.

Development of a well-defined medium for the in vitro maturation of immature bovine cumulus-oocyte complexes.

PURPOSE: Our purpose was to develop a well-defined medium for the in vitro maturation (IVM) of immature bovine cumulus-oocyte complexes (COC). METHODS: The COC were cultured in the presence of three protein supplementations: fetal bovine serum (FBS), bovine serum albumin, and Synthetic Serum Substitute. The embryos obtained after in vitro fertilization of IVM oocytes were cocultured with Vero cells and their development to the morula and blastocyst stages was studied. RESULTS: When FBS was absent from the IVM medium, a significantly lower fertilization rate was observed, followed by a decrease in the percentage of embryos reaching the blastocyst stage. When FBS was replaced by a defined protein supplementation, the best results were obtained with Synthetic Serum Substitute. CONCLUSIONS: Adequate protein supplementation of the IVM medium optimizes the fertilization rate and the development of bovine IVM oocytes. The implication of these results in the human field is discussed.