SOURCE, FATE AND FUNCTION OF EARLY GLIAL CELLS EXPRESSING NKX2.1 IN MOUSE EMBRYONIC BRAINS

The brain tissue is made of neuronal and glial cells generated in the germinal layer bordering the ventricles. These cells divide, differentiate and migrate following specific pathways. The specification of GABAergic interneurons and glutamatergic neurons has been broadly studied but little is known about the origin, the fate and the function of early glial cells in the embryonic telencephalon. It has been commonly accepted since long that the glial cells and more particularly the astrocytes were generated after neurogenesis from the dorsal telencephalon. However, our work shows that, unlike what was previously thought, numerous glial cells (astroglia and polydendrocytes) are generated during neurogenesis in the early embryonic stages from E14.5 to E16.5, and originate from the ventral Nkx2.1-expressing precursors instead. NK2 homeobox 1 (Nkx2.1) is a member of the NK2 family of homeodomaincontaining transcription factors. The specification of the MGE precursors requires the expression of the Nkx2.1 homeobox gene. Moreover, Nkx2.1 is previously known to regulate the specification of GABAergic interneurons and early oligodendrocytes in the ventral telencephalon. Here, in my thesis work, I have discovered that, in addition, Nkx2.1 also regulates astroglia and polydendrocytes differentiation. The use of Nkx2.1 antibody and Nkx2.1 riboprobe have revealed the presence of numerous Nkx2.1-positive cells that express astroglial markers (like GLAST and GFAP) in the entire embryonic brain. Thus, to selectively fate map MGE-derived GABAergic interneurons and glia, we crossed Nkx2.1-Cre mice, Glast-Cre ERT+/- inducible mice and NG2-Cre mice with the Cre reporter Rosa26-lox-STOP-lox-YFP (Rosa26-YFP) mice. The precise origin of Nkx2.1-positive astroglia has been directly ascertained by combining glial immunostaining and focal electroporation of the pCAG-GS-EGFP plasmids into the subpallial domains of organotypic slices, as well as, by using in vitro neurosphere experiments and in utero electroporation of the pCAG-GS-tomato plasmid into the ventral pallium of E14.5 Nkx2.1-Cre+/Rosa-YFP+/- embryos. We have, thus, confirmed that the three germinal regions of the ventral telencephalon i.e. the MGE, the AEP/POA and the triangular septal nucleus are able to generate early astroglial cells. Moreover, immunohistochemistry for several astroglial cells and polydendrocyte markers, both in the Nkx2.1-/- and control embryos and in the neurospheres, has revealed a severe loss of both glial cell types in the Nkx2.1 mutants. We found that the loss of glia corresponded to a decrease of Nkx2.1-derived precursor division capacity and glial differentiation. There was a drastic decrease of BrdU+ dividing cells labeled for Nkx2.1 in the MGE*, the POA* and the septal nucleus* of Nkx2.1 mutants. In addition, we noticed that while some remaining Nkx2.1+ precursors still succeeded to give rise to post-mitotic neurons in vitro and in vivo in the Nkx2.1-/-, they completely lost the capacity to differentiate in astrocytes. Altogether, these observations indicate for the first time that the transcription factor Nkx2.1 regulates the proliferation and differentiation of precursors in three subpallial domains that generate early embryonic astroglia and polydendrocytes. Furthermore, in order to investigate the potential function of these early Nkx2.1- derived glia, we have performed multiple immunohistochemical stainings on Nkx2.1-/- and wild-type animals, and Nkx2.1-Cre mice that were crossed to Rosa-DTA+/- mice in which the highly toxic diphtheria toxin aided to selectively deplete a majority of the Nkx2.1-derived cells. Interestingly, in these two mutants, we observed a drastic and significant loss of GFAP+, GLAST+, NG2+ and S100ß+ astroglial cells at the telencephalic midline and in the medial cortical areas. This cells loss could be directly correlated with severe axonal guidance defects observed in the corpus callosum (CC), the hippocampal commissure (HIC), the fornix (F) and the anterior commissure (AC). Axonal guidance is a key step allowing neurons to form specific connections and to become organized in a functional network. The contribution of guidepost cells inside the CC and the AC in mediating the growth of commissural axons have until now been attributed to specialized midline guidepost astroglia. Previous published results in our group have unravelled that, during embryonic development, the CC is populated in addition to astroglia by numerous glutamatergic and GABAergic guidepost neurons that are essential for the correct midline crossing of callosal axons. Therefore, the relative contribution of individual neuronal or glial populations towards the guidance of commissural axons remains largely to be investigated to understand guidance mechanisms further. Thus, we crossed Nkx2.1-Cre mice with NSE-DTA+/- mice that express the diphtheria toxin only in neurons and allowed us to selectively deplete Nkx2.1-derived GABAergic neurons. Interestingly, in the Nkx2.1-/- mice, the CC midline was totally disorganized and the callosal axons partly lost their orientation, whereas in the Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/- and the Nkx2.1Cre+/NSE-DTA+/- mice, the axonal organization of the CC was not affected. In the three types of mice, hippocampal axons of the fornix were not properly fasciculated and formed disoriented bundles through the septum. Additionally, the AC formation was completely absent in Nkx2.1-/- mice and the AC was divided into two/three separate paths in the Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/- mice that project in wrong territories. On the other hand, the AC didn't form or was reduced to a relatively narrower tract in the Nkx2.1Cre+/NSE-DTA+/- mice as compared to wild-type AC. These results clearly indicate that midline Nkx2.1-derived cells play a major role in commissural axons pathfinding and that both Nkx2.1-derived guidepost neurons and glia are necessary elements for the correct development of these commissures. Furthermore, during our investigations on Nkx2.1-/- and Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/- mice, we noticed similar and severe defects in the erythrocytes distribution and the blood vessels network morphology in the embryonic brain of both mutants. As the Cre-mediated recombination was never observed to occur in the blood vessels of Nkx2.1-Cre mice, we inferred that the vessels defects observed were due to the loss of Nkx2.1-derived cells and not to the cells autonomous effects of Nkx2.1 in regulating endothelial cell precursors. Thereafter, the respective contribution of individual Nkx2.1-regulated neuronal or glial populations in the blood vessels network building were studied with the use of transgenic mice strains. Indeed, the use of Nkx2.1Cre+/NSE-DTA+/- mice indicated that the Nkx2.1-derived neurons were not implicated in this process. Finally, to discriminate between the two Nkx2.1-derived glial cell populations, the GLAST+ astroglia and the NG2+ polydendrocytes, an NG2-Cre mouse strain crossed to the Rosa-DTA+/- mice was used. In that mutant, the blood vessel network and the erythrocytes distribution were similarly affected as observed in Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/- animals. Therefore, this result indicates that most probably, the NG2+ polydendrocytes are involved in helping to build the vessels network in the brain. Taken altogether, these observations show that during brain development, Nkx2.1- derived embryonic glial cells act as guidepost cells on the guidance of axons as well as forming vessels. Both Nkx2.1-regulated guidepost GABAergic neurons and glia collaborate to guide growing commissural axons, while polydendrocytes are implicated in regulating brain angiogenesis. - Le tissu cérébral est composé de cellules neuronales et gliales générées dans les couches germinales qui bordent les ventricules. Ces cellules se divisent, se différencient et migrent selon des voies particulières. La spécification des interneurones GABAergiques et des neurones glutamatergiques a été largement étudiée, par contre, l'origine, le destin et la fonction des cellules gliales précoces du télencéphale embryonnaire restent peu élucidées. Depuis longtemps, il était communément accepté que les cellules gliales, et plus particulièrement les astrocytes, sont générés après la neurogénèse à partir du télencéphale dorsal. Toutefois, notre travail montre que de nombreuses cellules gliales sont générées à partir de précurseurs ventraux qui expriment le gène Nkx2.1, entre E14.5 et E16.5, c'est-à dire,à des stades embryonnaires très précoces. Le gène NK2 homéobox 1 (Nkx2.1) appartient à une famille de facteurs de transcription appelée NK2. Il s'agit de protéines qui contiennent un homéo-domaine. La spécification des précurseurs de la MGE requiert l'expression du gène homéobox Nkx2.1. De plus, la fonction du gène Nkx2.1 dans la régulation de la spécification des interneurones GABAergiques et des oligodendrocytes dans le télencéphale ventral était déjà connue. Au cours de mon travail de thèse, j'ai également mis en évidence que, Nkx2.1 régule aussi les étapes de prolifération et de différenciation de divers sous-types de cellules gliales soit de type astrocytes ou bien polydendrocytes. L'utilisation d'un anticorps contre la protéine Nkx2.1 ainsi qu'une sonde à ribonucléotides contre l'ARN messager du gène Nkx2.1 ont révélé la présence de nombreuses cellules positives pour Nkx2.1 qui exprimaient des marqueurs astrocytaires (comme GLAST et GFAP) dans le télencéphale embryonnaire. Afin de déterminer de manière sélective le sort des interneurones GABAergiques, des polydendrocytes et des astrocytes dérivés de la MGE, nous avons croisé soit des souris Nkx2.1-Cre, des souris Glast-Cre ERT+/- inductibles ou bien des souris NG2-Cre avec des souris Rosa26-lox-STOP-lox-YFP (Rosa26-YFP) Cre rapportrices. L'origine précise des astroglies positives pour Nkx2.1 a été directement établie en combinant une coloration immunologique pour les glies et une électroporation focale d'un plasmide pCAG-GS-EGFP dans les domaines subpalliaux de tranches organotypiques, puis également, par des cultures de neurosphères in vitro et des expériences d'électroporation in utero d'un plasmide pCAG-GS-tomato dans le pallium ventral d'embryons Nkx2.1-Cre+/Rosa- YFP+/- au stade E14.5. Nous avons donc confirmé que les trois régions germinales du télencéphale ventral, c'est-à-dire, la MGE, l'AEP/POA et le noyau triangulaire septal sont capables de générer des cellules astrogliales. D'autre part, l'immunohistochimie pour plusieurs marqueurs d'astrocytes ou de polydendrocytes, dans les embryons Nkx2.1-/- et contrôles ainsi que dans les neurosphères, a révélé une sévère perte de ces deux types gliaux chez les mutants. Nous avons trouvé que la perte de glies correspondait à une diminution de la capacité de division des précurseurs dérivés de Nkx2.1, ainsi que l'incapacité de ces précurseurs de se différencier en cellules gliales. Nous avons en effet observé une diminution importante des cellules BrdU+ en division exprimant Nkx2.1dans la MGE*, la POA* et le noyau septal* des mutants pour Nkx2.1. D'autre part, nous avons pu mettre en évidence aussi bien in vitro, qu'in vivo, que certains précurseurs Nkx2.1+ chez le mutant gardent la capacité à se différencier en neurones tandis qu'ils perdent celle de se différencier en cellules gliales. Prises dans leur ensemble, ces observations indiquent pour la première fois que le facteur de transcription Nkx2.1 régule les étapes de prolifération et de différentiation des précurseurs des trois domaines subpalliaux qui génèrent les astroglies et polydendrocytes embryonnaires précoces. Par la suite, dans le but de comprendre la fonction potentielle de ces glies précoces, nous avons procédé à de multiples colorations immunohistochimiques sur des animaux Nkx2.1-/- et sauvages, ainsi que sur des souris Nkx2.1-Cre croisées à des souris Rosa-DTA+/- dans lesquelles la toxine diphthérique hautement toxique a permis de supprimer sélectivement la majorité des cellules dérivées de Nkx2.1. De manière intéressante, nous avons observé dans ces deux mutants, une perte drastique et significative de cellules astrogliales GFAP+, GLAST+ et polydendrocytaires NG2+ et S100ß+ dans le télencéphale, à la midline et dans les aires corticales médianes. Ces pertes ont pu être directement corrélées avec des défauts de guidage axonal observés dans le corps calleux (CC), la commissure hippocampique (HIC), le fornix (F) et la commissure antérieure (AC). Le guidage axonal est une étape clé permettant aux neurones de former des connections spécifiques et de s'organiser dans un réseau fonctionnel. La contribution des cellules « guidepost » dans le CC et dans la AC comme médiateurs de la croissance des axones commissuraux à jusqu'à aujourd'hui été attribuée spécifiquement à des astroglies « guidepost » de la midline. Des résultats publiés précédemment dans notre groupe, ont permis de montrer que, pendant le développement embryonnaire, le CC est peuplé en plus de la glie par de nombreux neurones « guidepost » glutamatergiques et GABAergiques qui sont essentiels pour le croisement correct des axones callosaux à la midline. Ainsi, la contribution relative des populations individuelles neuronales ou gliales pour le guidage des axones commissuraux demande à être approfondie afin de mieux comprendre les mécanismes de guidage. A ces fins, nous avons croisé des souris Nkx2.1-Cre avec des souris NSE-DTA+/- qui expriment la toxine diphthérique uniquement dans les neurones et ainsi, nous avons pu sélectivement supprimer les neurones dérivés de domaines Nkx2.1+. Dans les souris Nkx2.1-/-,nous avons découvert que le CC était désorganisé avec des axones callosaux perdant partiellement leur orientation, alors que dans les souris Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/- et Nkx2.1Cre+/NSE-DTA+/-, l'organisation axonale n'était pas affectée. De plus, les faisceaux hippocampiques du fornix étaient défasciculés dans les trois types de mutants. Par ailleurs, la formation de la commissure antérieure (AC) était complètement absente dans les souris Nkx2.1-/- d'une part, et d'autre part, celle-ci était divisée en deux à trois voies séparées dans les souris Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/-. Finalement, la AC était soit absente, soit réduite de manière ne former plus qu'un faisceau relativement plus étroit dans les souris Nkx2.1Cre+/NSE-DTA+/- en comparaison avec la AC sauvage. Ces derniers résultats indiquent clairement que les cellules dérivées de Nkx2.1 à la midline, jouent un rôle majeur dans le guidage des axones commissuraux et que, autant les neurones, que les astrocytes « guidepost » dérivés de Nkx2.1, sont des éléments nécessaires au développement correct de ces commissures. En outre, lors de nos investigations sur les souris Nkx2.1-/- et Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/-, nous avons remarqués des défauts sévères et similaires dans la distribution des erythrocytes et dans la morphologie du réseau de vaisseaux sanguins dans le cerveau embryonnaire des deux mutants précités. Puisque nous n'avons jamais observé de recombinaison de la Cre recombinase dans les vaisseaux sanguins des souris Nkx2.1Cre, nous en avons déduit que les défauts de vaisseaux observés étaient dus à la perte de cellules dérivées de Nkx2.1. Il existerait donc en plus de la fonction cellulaire autonome de Nkx2.1 reconnue pour régulée directement la spécification des cellules endothéliales, une fonction indirecte de Nkx2.1. Afin de déterminer la contribution respective des populations individuelles neuronales ou gliales régulées par Nkx2.1 dans la construction du réseau de vaisseaux sanguins, nous avons utilisé diverses lignées de souris transgéniques. L'utilisation de souris Nkx2.1Cre+/NSE-DTA+/- a indiqué que les neurones dérivés de Nkx2.1 n'étaient pas impliqués dans ce processus. Finalement, afin de discriminer entre les deux populations de cellules gliales dérivées de Nkx2.1, les astroglies et les polydendrocytes, nous avons croisé une lignée de souris NG2-Cre avec des souris Rosa-DTA+/-. Dans ce dernier mutant, le réseau de vaisseaux sanguins du cortex ainsi que la distribution des erythrocytes étaient affectés de la même manière que dans le cortex des souris Nkx2.1Cre+/Rosa-DTA+/-. Par conséquent, ce résultat indique que très probablement, les polydendrocytes NG2+ sont impliqués dans la mise en place du réseau de vaisseaux dans le cerveau. Prises dans leur ensemble, ces observations montrent que durant le développement embryonnaire du cerveau, des sous-populations de glies régulées par Nkx2.1 jouent un rôle de cellules « guidepost » dans le guidage des axones, ainsi que des vaisseaux. Les polydendrocytes sont impliquées dans la régulation de l'angiogenèse tandis que, autant les neurones GABAergiques que les astrocytes collaborent dans le guidage des axones commissuraux en croissance.

Molecular characterization of Unc5CL/ZUD

Résumé : Au cours de l'évolution, les organismes multicellulaires ont développé le système immunitaire afin de pouvoir se défendre contre les pathogènes tel que les bactéries, les virus, et les parasites. La réponse immunitaire doit être finement régulée par différentes voies de signalisation moléculaire, afin d'assurer une efficacité optimale, et d'éviter des dommages tissulaires indésirables. Les résultats expérimentaux décrits dans ce manuscrit, mettent en évidence que la protéine Unc5CL, qui contient un death domain (DD), est impliquée dans la régulation de la réponse immunitaire des muqueuses. Il a été démontré que cette protéine contient aussi un domaine transmembranaire de type III dans sa partie N-terminale, permettant ainsi de l'ancrer et d'exposer sa partie C-terminale dans le cytosol, un prérequis pour la signalisation dans ce compartiment cellulaire. De plus, cette protéine a la capacité d'activer le facteur de transcription NFxB, qui joue un rôle important dans le système immunitaire, ainsi que dans d'autres processus cellulaires essentiels. Le profil transcriptionnel révèle que l'activation de NF-κB induite par Unc5CL conduit principalement à une réponse inflammatoire, qui se caractérise par la production de diverses chimiokines (e.g. CXCL-1, IL-8 et CCL20). Il a également été démontré que Unc5CL requiert les mêmes molécules qui sont utilisées dans la voie de signalisation des récepteurs de la famille toll et de l'interleukine-1. De manière similaire à leur protéine adaptatrice MyD88, Unc5CL a la capacité de recruter, via une interaction homotypique DD-DD, les kinases IRAK1 et IRAK4 qui contiennent elles aussi un DD, permettant ainsi au signal d'être transmis. La production d'un anticorps polyclonal contre le DD de Unc5CL a permis d'identifier des lignées cellulaires et des tissus exprimant cette protéine, ainsi que de déterminer sa localisation sub-cellulaire. Unc5CL a été détecté dans les cellules de la muqueuse utérine et intestinale, ainsi que dans une lignée cellulaire issue d'un adénocarcinome colorectal humain, les CaCo-2. Dans chacun de ces cas, Unc5CL a été principalement détectée au niveau apical des cellules épithéliales polarisées. De manière similaire à PIDD, une protéine impliquée dans la réponse aux dommages à l'ADN, et au constituant des pores nucléaires Nup98, Unc5CL est constitutivement clivé de manière autoprotéolytique, au niveau d'un site HFS. Il est intéressant d'observer que les deux fragments ainsi générés restent fortement associés l'un à l'autre après clivage. Finalement, un criblage protéomique pour identifier un partenaire d'interaction, a mis en évidence l'ubiquitin ligase E3 ITCH, qui régule de manière négative Unc5CL en augmentant sa dégradation. Summary : Multicellular organisms have evolved the immune system in order to defend themselves against pathogens such as bacteria, viruses and eukaryotic parasites. Immune responses have to be tightly orchestrated by signaling mechanisms to achieve optimal effectiveness and minimal tissue damage. The experimental results in this thesis manuscript provide evidence that the death domain (DD)-containing protein Unc5CL might be involved in the regulation of mucosal immune responses. It could be shown that the protein contains an N-terminal type-III transmembrane domain that anchors the protein with its C-terminus exposed to the cytosol, a prerequisite for signaling events in this compartment. Furthermore, the protein has the capacity to activate the transcription factor NF-κB, which plays an important role in the immune system as well as in other essential cellular processes. Transcriptional profiling revealed that Unc5CL-mediated activation of NF-κB mainly leads to an inflammatory response, characterized by the production of chemokines (e.g. CXCL-l, IL-8 and CCL20). Furthermore, it could be shown that Unc5CL requires the same downstream signaling molecules as the evolutionarily ancient tolUinterleukin-1 receptor family. Similar to their adapter protein MyD88, Unc5CL has the capacity to recruit the DD-containing kinases IRAKI and IRAK4 for signaling and can interact with these proteins via homotypic DD-DD interactions. Generation of polyclonal antibodies raised against the DD of Unc5CL allowed the identification of cell lines and tissues that express the endogenous protein as well as to confine its subcellular localization. Unc5CL was detected in primary mucosal uterine and intestinal epithelial cells as well as in the human colorectal adenocarcinoma cell line CaCo-2. In all cases, the protein was mainly localized to the apical face of these polarized epithelial cells. Similar to PIDD, a protein critically involved in responses to DNA damage, and the nuclear pore component Nup98, Unc5CL is constitutively autoproteolytically processed at an HFS site. Interestingly, the two generated cleavage fragments remain tightly associated after processing. Finally, a proteomics screen for interaction partners identified the E3 ubiquitin ligase ITCH as a negative regulator of Unc5CL by targeting the protein for degradation.

Highly parallel genetic approaches in Mendelian and complex diseases

The recent advance in high-throughput sequencing and genotyping protocols allows rapid investigation of Mendelian and complex diseases on a scale not previously been possible. In my thesis research I took advantage of these modern techniques to study retinitis pigmentosa (RP), a rare inherited disease characterized by progressive loss of photoreceptors and leading to blindness; and hypertension, a common condition affecting 30% of the adult population. Firstly, I compared the performance of different next generation sequencing (NGS) platforms in the sequencing of the RP-linked gene PRPF31. The gene contained a mutation in an intronic repetitive element, which presented difficulties for both classic sequencing methods and NGS. We showed that all NGS platforms are powerful tools to identify rare and common DNA variants, also in case of more complex sequences. Moreover, we evaluated the features of different NGS platforms that are important in re-sequencing projects. The main focus of my thesis was then to investigate the involvement of pre-mRNA splicing factors in autosomal dominant RP (adRP). I screened 5 candidate genes in a large cohort of patients by using long-range PCR as enrichment step, followed by NGS. We tested two different approaches: in one, all target PCRs from all patients were pooled and sequenced as a single DNA library; in the other, PCRs from each patient were separated within the pool by DNA barcodes. The first solution was more cost-effective, while the second one allowed obtaining faster and more accurate results, but overall they both proved to be effective strategies for gene screenings in many samples. We could in fact identify novel missense mutations in the SNRNP200 gene, encoding an essential RNA helicase for splicing catalysis. Interestingly, one of these mutations showed incomplete penetrance in one family with adRP. Thus, we started to study the possible molecular causes underlying phenotypic differences between asymptomatic and affected members of this family. For the study of hypertension, I joined a European consortium to perform genome-wide association studies (GWAS). Thanks to the use of very informative genotyping arrays and of phenotipically well-characterized cohorts, we could identify a novel susceptibility locus for hypertension in the promoter region of the endothelial nitric oxide synthase gene (NOS3). Moreover, we have proven the direct causality of the associated SNP using three different methods: 1) targeted resequencing, 2) luciferase assay, and 3) population study. - Le récent progrès dans le Séquençage à haut Débit et les protocoles de génotypage a permis une plus vaste et rapide étude des maladies mendéliennes et multifactorielles à une échelle encore jamais atteinte. Durant ma thèse de recherche, j'ai utilisé ces nouvelles techniques de séquençage afin d'étudier la retinite pigmentale (RP), une maladie héréditaire rare caractérisée par une perte progressive des photorécepteurs de l'oeil qui entraine la cécité; et l'hypertension, une maladie commune touchant 30% de la population adulte. Tout d'abord, j'ai effectué une comparaison des performances de différentes plateformes de séquençage NGS (Next Generation Sequencing) lors du séquençage de PRPF31, un gène lié à RP. Ce gène contenait une mutation dans un élément répétable intronique, qui présentait des difficultés de séquençage avec la méthode classique et les NGS. Nous avons montré que les plateformes de NGS analysées sont des outils très puissants pour identifier des variations de l'ADN rares ou communes et aussi dans le cas de séquences complexes. De plus, nous avons exploré les caractéristiques des différentes plateformes NGS qui sont importantes dans les projets de re-séquençage. L'objectif principal de ma thèse a été ensuite d'examiner l'effet des facteurs d'épissage de pre-ARNm dans une forme autosomale dominante de RP (adRP). Un screening de 5 gènes candidats issus d'une large cohorte de patients a été effectué en utilisant la long-range PCR comme étape d'enrichissement, suivie par séquençage avec NGS. Nous avons testé deux approches différentes : dans la première, toutes les cibles PCRs de tous les patients ont été regroupées et séquencées comme une bibliothèque d'ADN unique; dans la seconde, les PCRs de chaque patient ont été séparées par code barres d'ADN. La première solution a été la plus économique, tandis que la seconde a permis d'obtenir des résultats plus rapides et précis. Dans l'ensemble, ces deux stratégies se sont démontrées efficaces pour le screening de gènes issus de divers échantillons. Nous avons pu identifier des nouvelles mutations faux-sens dans le gène SNRNP200, une hélicase ayant une fonction essentielle dans l'épissage. Il est intéressant de noter qu'une des ces mutations montre une pénétrance incomplète dans une famille atteinte d'adRP. Ainsi, nous avons commencé une étude sur les causes moléculaires entrainant des différences phénotypiques entre membres affectés et asymptomatiques de cette famille. Lors de l'étude de l'hypertension, j'ai rejoint un consortium européen pour réaliser une étude d'association Pangénomique ou genome-wide association study Grâce à l'utilisation de tableaux de génotypage très informatifs et de cohortes extrêmement bien caractérisées au niveau phénotypique, un nouveau locus lié à l'hypertension a été identifié dans la région promotrice du gène endothélial nitric oxide sinthase (NOS3). Par ailleurs, nous avons prouvé la cause directe du SNP associé au moyen de trois méthodes différentes: i) en reséquençant la cible avec NGS, ii) avec des essais à la luciférase et iii) une étude de population.

Phylogeny of shrews (Soricidae) : taxonomic and biogeographic implications

Résumé Les Soricidae sont l'une des plus grandes familles de mammifères avec plus de 300 espèces décrites. Elle a été récemment divisée en trois sous-familles, les Soricidae, qui sont distribuées dans la région Holarctique, les Crocidurinae en Afrique et en Eurasie, et les Myosoricinae en Afrique. La diversité spécifique de cette famille a conduit à des interprétations taxonomiques multiples, qui sont à l'origine de polémiques entre spécialistes, et même les premiers résultats moléculaires ont été fortement contradictoires. Le but de cette thèse est donc d'appliquer des meilleures techniques sur des échantillons mieux ciblés, afin de résoudre les contradictions taxonomiques et comprendre l'histoire de cette famille. Par le biais de marqueurs génétiques mitochondriaux et nucléaires, j'ai étudié: (i) Les relations taxonomiques à différent niveaux hiérarchiques au sein des Soricidae, c'est-à dire, entre les sous-familles, tribus, et genres, ainsi qu'au sein de deux complexes d'espèces largement distribués, et d'une espèce européenne, le but étant d'établir la congruence entre les données génétiques et les interprétations morphologiques classiques. (ii) Les relations biogéographiques, soit l'origine potentielle des différentes sous-familles, tribus, et genres, le nombre d'échanges intercontinentaux, ainsi que la structure phylogéographique à un niveau (péri)-spécifique, afin d'établir l'histoire de la diversification de cette famille. Les analyses combinées d'ADN mitochondrial et nucléaire ont montré un rapport clair entre les taxa à un niveau taxonomique élevé, mettant en évidence les rapports entre les sous-familles, les tribus, et les genres. Bien que Myosorex constitue un groupe monophylétique distinct, sa définition en tant que sous-famille séparée ne peut pas être reconnue. Ainsi, nous proposons d'attribuer un niveau de tribu pour ce clade (inclus dans les Crocidurinae). Nous avons également montré l'inclusion du genre Anourosorex dans les Soricinae et non en position basale dans les Soricidae. Au sein des Crocidurinae, Suncus s'est révélé être paraphylétique, et le genre Diplomesodon devrait être considéré d'un point de vue génétique comme invalide, puisque il se trouve au sein du clade du genre Crocidura. À un niveau taxonomique plus bas, nous avons montré la monophylie de deux complexes d'espèces largement distribués, le groupe de C. suaveolens et de C. olivieri. Néanmoins à l'intérieur de ceux-ci, des différences majeures avec la classification morphologique se sont révélées. Par exemples, C. sibirica n'est pas une espèce valide, les analyses de phylogénie moléculaire ne montrant pas de variations génétiques entre celle-ci et un échantillon de la localité type de C. suaveolens. D'un point de vue biogéographique, les fluctuations climatiques et les activités tectoniques des 20 derniers millions d'années ont fortement influencé la diversité actuelle des Soricidae. À un niveau taxonomique élevé, l'apparition de connexions de terre temporaires entre le Vieux et le Nouveau Monde au Miocène moyen ont mené à plusieurs colonisations indépendantes de l'Amérique par les Soricinae. Celles-ci ónt conduit à une diversification d'une tribu (Notiosoricini), ainsi que de genres (par ex: Cryptotis, Blarina) et d'un sous-genre (Otisorex) endémique au Néarctique. Dans le Vieux Monde, les barrières entre l'Afrique et Eurasie étaient plus perméables, menant à plusieurs échanges bidirectionnels de Crocidurinae. La diversification des clades principaux s'est produite au Miocène, certains clades étant endémiques d'Afrique ou d'Eurasie, tandis que d'autres se sont diversifiés à travers le Vieux Monde. À un niveau spécifique ou péri-spécifique, la fluctuation climatique du Pliocène et les glaciations du Pléistocène ont fortement divisé les populations dans tout le Paléarctique, menant à des entités génétiques distinctes. En Europe, les populations du groupe de C. suaveolens ont été divisées en une lignée Sud-Ouest et une Sud-Est, alors qu'au Proche-Orient et au Moyen-Orient, la diversité de clades est plus importante. En conclusion, mes études ont révélé que du Miocène à nos jours, la diversification des Soricidae a été provoquée par la colonisation de nouveaux habitats (dispersion), ainsi que par l'isolement des populations par diverses barrières (vicariance). Abstract The Soricidae is one of the largest mammalian families with more than 300 species described. It has been recently divided into three subfamilies, the Soricinae, which are distributed in the Holartic region, the Crocidurinae in Africa and Eurasia, and the Myosoricinae in Africa. The specific diversity of this family have led to multiple systematic interpretations and controversies between authors. Fortunately, today, cytotaxonomic, allozymic and molecular studies have permitted to clarify some uncertainties. Nevertheless, the Soricidae remains still poorly known. In this thesis, we aim at understanding with the use of mitochondrial and nuclear markers: (i) the taxonomic relationships at different hierarchical levels within Soricidae, i.e., between the subfamilies, tribes, and genera, as well as within two largely distributed species complexes, and within a European species, the goal being to establish congruence between the genetic data and traditional morphological interpretations; (ii) the biogeographic relationships, especially the potential origin of the different subfamilies, tribes, and genera, the number of transcontinental exchanges, as well as the phylogeographic structure at a (peri)-specific level, in order to establish the history of the genetic diversification of this family. The combined analyses of mitochondrial and nuclear DNA highlight for the first time a clear relationship between taxa at a high taxonomical level, permitting to distinguish the relationships between subfamilies, tribes, and genera. Although Myosorex formed a distinct monophyletic group, its definition as a distinct sub-family cannot be advocated. Thus, we propose to attribute a tribe level for this Glade (included within the Crocidurinae). Additionally, this combination of genes pleads in favour of the inclusion of the genus Anourosorex within the Soricinae and not in a basal position within the Soricidae. Within the Crocidurinae, Suncus appeared to be paraphyletic, and Diplomesodon should be considered from a genetic point of view as invalid, and is presently considered as Crocidura. At a lower taxonomic level, we showed the monophyly of two widely distributed species complexes, the C. suaveolens group and the C. olivieri group. Nevertheless within those, we showed major differences compared to morphological classification. For examples, C. sibirica revealed to not be a valid species, the molecular phylogenetic analyses failed to evidence genetical variations between it and samples of the type locality of C. suaveolens. In a biogeographic point of view, the climatic fluctuations and the tectonic plate activities of the last 20 Myr have strongly influenced the actual diversity of the family. At a high taxonomic level, the successive land bridge connections between the Old and the New World, which occurred during the Middle Miocene, have led to several independent colonisations of America by Soricinae, and a subsequent diversification of endemic Nearctic's tribe (Notiosoricini), genera (e.g. Cryptotis, Blaring) and sub-genus (Otisorex) within the Soricinae. Within the Old World, the barriers between Africa and Eurasia were more permeable, leading to several bidirectional exchanges within the Crocidurinae. The diversification of major clades occurred through the Miocene, some clades being endemic to Africa or Eurasia, whereas others diversified through the Old World. At a species level or a peri-specific level, the Pliocene climatic fluctuation and the Pleistocene glaciations have strongly divided the populations throughout the Palaearctic, leading to well defined genetic entities. In Europe, populations of the C. suaveolens group were split in a classical south-western and south-eastern lineage. In contrast, the Near East and the Middle East reveal many differentiated clades. In conclusion, our studies revealed that, from the Miocene to present, the diversification and speciation events within the Soricidae were caused by natural colonisation of new habitats (dispersion) and isolation of populations by various barriers (vicariance).

Role of ATH5 in the specification of retinal ganglion cells and expression and cell compartmentalization of EFEMP1, a protein associated with Malattia Leventinese

ABSTRACT : The development of the retina is a very complex process, occurring through the progressive restriction of cell fates, from pluripotent cell populations to complex tissues and organs. In all vertebrate species analyzed so far, retinal differentiation starts with the generation of retinal ganglion cells (RGC)s. One of the documented key essential events in the specification of RGCs is the expression of ATHS, an atonal homolog encoding a bHLH transcription factor. Despite the putative role of master regulator of RGC differentiation, the mechanism of integrating its functions into a coherent program underlying the production of this subclass of retinal neurons has not yet been elucidated. By using chromatin immunoprecipitation combined with microarray (ChIP-on-chip) we have screened for ATH5 direct targets in the developing chick retina at two consecutive periods: E3.5 (stage HH22) and E6 (stage HH30), covering the stages of progenitor proliferation, neuroepithelium patterning, RGC specification, cell cycle exit and early neuronal differentiation. In parallel, complementary analysis with Affymetrix expression microarrays was conducted. We compared RGCs versus retina to see if the targets correspond to genes preferentially expressed in RGCs. We also precociously overexpressed ATH5 in the retina of individual embryo, and contralateral retina vas used as a control. Our integrated approach allowed us to establish a compendium of ATH5-targets and enabled us to position ATH5 in the transcription network underlying neurogenesis in the retina. Malattia Leventinese (ML) is an autosomal, dominant retinal dystrophy characterized by extracellular, amorphous deposits known as drusen, between the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch's membrane. On the genetic level, it has been associated with a single missense mutation (R345W) in a widely expressed gene with unknown function called EFEMP1. We determined expression patterns of the EFEMP1 gene in normal and ML human retinas. Our data shown that the upregulation of EFEMP1 is not specific to ML eye, except for the region of the ciliary body. We also analyzed the cell compartmentalization of different versions of the protein (both wild type and mutant). Our studies indicate that both abnormal expression of the EFEMP1 gene and mutation and accumulation of EFEMP 1 protein (inside or outside the cells) might contribute to the ML pathology. Résumé : 1er partie : L'ontogenèse de la rétine est un processus complexe au cours duquel des cellules progénitrices sont engagée, par vagues successives, dans des lignées où elles vont d'abord être déterminées puis vont se différencier pour finalement construire un tissu rétinien composé de cinq classes de neurones (les photorécepteurs, les cellules horizontales, bipolaires, amacrines et ganglionnaires) et d'une seule de cellules gliales (les cellules de Muller). Chez tous les vertébrés, la neurogenèse rétinienne est d'abord marquée par la production des cellules ganglionnaires (RGCs). La production de cette classe de neurone est liée à l'expression du gène ATH5 qui est un homologue du gène atonal chez la Drosophile et qui code pour un facteur de transcription de la famille des protéines basic Helix-Loop-Helix (bHLH). Malgré le rôle central que joue ATH5 dans la production des RGCs, le mécanisme qui intègre la fonction de cette protéine dans le programme de détermination neuronale et ceci en relation avec le développement de la rétine n'est pas encore élucidé. Grâce à une technologie qui permet de combiner la sélection de fragments de chromatine liant ATH5 et la recherche de séquences grâce à des puces d'ADN non-codants (ChIP-on-chip), nous avons recherché des cibles potentielles de la protéine ATH5 dans la rétine en développement. Nous avons conduit cette recherche à deux stades de développement de manière à englober la phase de prolifération cellulaire, la détermination des RGCs, la sortie du cycle cellulaire ainsi que les premières étapes de la différentiation de ces neurones. Des expériences complémentaires nous ont permis de définir les patrons d'expression des gènes sélectionnés ainsi que l'activité promotrice des éléments de régulation identifiés lors de notre criblage. Ces approches expérimentales diverses et complémentaires nous ont permis de répertorier des gènes cibles de la protéine ATH5 et d'établir ainsi des liens fonctionnels entre des voies métaboliques dont nous ne soupçonnions pas jusqu'alors qu'elles puissent être associées à la production d'une classe de neurones centraux. 2ème partie : Malattia Leventinese (ML) est une maladie génétique qui engendre une dystrophie de la rétine. Elle se caractérise par l'accumulation de dépôt amorphe entre l'épithélium pigmentaire et la membrane de Bruch et connu sous le nom de drusen. Cette maladie est liée à une simple mutation non-sens (R345W) dans un gène dénommé EFEMP1 qui est exprimé dans de nombreux tissus mais dont la fonction reste mal définie. Une étude détaillée de l'expression de ce gène dans des rétines humaines a révélé une expression à un niveau élevé du gène EFEMP1 dans divers tissus de l'oeil ML mais également dans des yeux contrôles. Alors que l'accumulation d'ARN messager EFEMP1 dans les cellules de l'épithélium pigmentaire n'est pas spécifique à ML, l'expression de ce gène dans le corps cilié n'a été observée que dans l'oeil ML. Nous avons également comparé la sécrétion de la protéine sauvage avec celle porteuse de la mutation. En résumé, notre étude révèle que le niveau élevé d'expression du gène EFEMP1 ainsi que l'accumulation de la protéine dans certains compartiments cellulaires pourraient contribuer au développement de pathologies rétiniennes liées à ML.

Un ancrage familial et social fort. Le cas de Dole

L'enquête menée à Dole (Franche-Comté), définie selon les modalités du projet KASS, permet de distinguer entre les liens intergénérationnels dont la solidarité entre les membres est vécue comme « naturelle », et ceux entre parents de même génération, dont le soutien est plus électif. Elle révèle surtout l'importance de la matérialisation du réseau familial dans des lieux. D'une manière générale, les ménages enquêtés valorisent la proximité géographique de la parenté, un attachement local et l'ancrage familial dans une maison de famille. Dans cette logique, ils font peu appel aux ressources publiques quand ils ont besoin d'aide, car leur choix s'exerce d'abord au sein du réseau familial.

Strength of family history in predicting levels of blood pressure, plasma glucose and cholesterol

Rapport de synthèse : L'histoire familiale reflète non seulement la susceptibilité génétique d'un individu à certaines maladies mais également ses comportements et habitudes, notamment partagées au sein d'une famille. L'hypertension artérielle, le diabète et l'hypercholestérolémie sont des facteurs de risque cardio-vasculaire modifiables hautement prévalent. L'association entre l'histoire familiale d'hypertension artérielle ou de diabète et le risque accru de développer de l'hypertension artérielle ou du diabète, respectivement, a été préalablement établie. Par contre, le lien entre l'histoire familiale de facteurs de risque cardio-vasculaire et les traits continus correspondants n'avaient jamais été mis clairement en évidence. De même, la signification d'une histoire familiale inconnue n'avait jusqu'alors pas été décrite. Ce travail, effectué dans le cadre de l'étude Colaus (Cohorte Lausannoise), une cohorte regroupant un échantillon composé de 6102 participants âgés de 35 à 75 ans sélectionnés au hasard dans la population lausannoise, a permis de décrire en détail la relation entre l'histoire familiale des facteurs de risque cardio-vasculaires et les trait correspondants dans la population étudiée. Les différentes analyses statistiques ont permis de mettre en évidence une relation forte entre l'histoire familiale d'hypertension artérielle, de diabète ainsi que de l'hypercholestérolémie et leurs traits dichotomique et continu correspondants. Les anamnèses des frères et soeurs avaient des valeurs prédictives positives plus élevées que les anamnèses parentales. Ceci signifie que les programmes de dépistage ne prenant en compte que l'histoire familiale des frères et soeurs seraient probablement plus efficaces que ceux qui comportent l'évaluation des anamnèses paternelle et maternelle. Plus de 40% des participants ignoraient l'histoire familiale d'hypertension d'au moins un des membres de leur famille. Ceux-ci avaient des valeurs de tension artérielle systolique plus élevées que ceux dont l'histoire familiale était négative, permettant de souligner la valeur prédictive du fait de ne pas connaître l'histoire familiale d'hypertension artérielle. Ces résultats montrent également que, lors d'analyses de la relation entre l'anamnèse familiale de facteurs de risque cardiovasculaires et leurs traits correspondants, les participants donnant des réponses négatives doivent être distingués de ceux qui ne connaissent pas leur anamnèse familiale. Les résultats de cette étude confirment la place centrale qu'occupe l'anamnèse familiale dans l'évaluation du risque cardio-vasculaire auprès de la population générale. L'importance de cet outil prédictif simple et bon marché ne va cesser d'augmenter avec la disponibilité croissante d'information génétique détaillée pour les maladies cardiovasculaires communes.

Revisiting the heteromultimeric structure of ENaC in Xenopus leavis oocytes

The epithelial sodium channel (ENaC) regulates the sodium reabsorption in the principal cells of collecting duct of the nephron, and is essential for the maintenance of Na+ balance and blood pressure. ENaC is regulated by hormones such as aldosterone and vasopressin, by serine proteases. The functional ENaC channel expressed at the cell surface is a hetemultimeric complex composed by the homologous a, ß and y subunits. Several functional and biochemical studies have provided evidence that the ENaC is a heterotetramer formed by 2a lß and ly subunits. Recently, a channel homologue of ENaC, the acid-sensing ion channel ASIC1 has been crystallized as a homotrimer. This discrepancy in the subunit composition of these two channels of the same family, motivated us to revisit the subunit oligomerization of the purified functional abg EnaC channel complex. His(6)ENaC a ß y subunits were expressed in Xenopus leavis oocytes. The three ENaC subunits copurify on Ni+2-NTA agarose beads in a aßy ENaC complex. On Western blot, the ENaC subunits show typical post-translation modifications associated with a functional channel. Using differentially tagged ENaC subunits, we could demonstrate that 2 different a ENaC co- purify with ß and y subunits, whereas only one single ß and y are detected in the ENaC complex. Comparison of the mass of the aßy ENaC complex on Western blot under non reducing conditions with different ENaC dimeric, trimmeric and tetratemeric concatamers indicate that the ENaC channel complex is a heterotetramer made of 2a-, lß-, and ly ENaC subunits. Our result will certainly not provide the last words on the subunit stoichiometry of the ENaC/ASIC channels, but hopefully will promote the réévaluation of the cASICl crystal structure for its functional relevance. -- Le canal épithélial sodique ENaC est responsable de la réabsorption du sodium dans les cellules principales du tubule collecteur rénal et joue un rôle important dans le maintien de l'homéostasie sodique et le maintien de la pression artérielle. Ce canal est régulé par des hormones telles que l'aldostérone ou la Vasopressine mais également par des sérines protéases. ENaC est un canal multimerique constitué des trois sous-unités homologues a, ß and y. De nombreuses études fonctionnelles et biochimiques ont montré que le canal ENaC fonctionnel exprimé à la surface cellulaire est un canal formé de 4 sous unités avec une stoichiometric préférentielle de 2 sous-unités a, 1 sous-unité ß et 1 sous-unité y. Récemment, la cristallisation du canal sodique sensible au pH acide, ASIC, un autre membre de la famille ENaC/Deg, a mis en évidence un canal homotrimérique. Cette divergence dans la composition en sous-unités formant les complexes ENaC et ASIC, deux canaux de la même famille de gènes, nous a motivé à réinvestiguer le problème de l'oligomérisation du complexe fonctionnel ENaC après purification. Dans ce but le complexe ENaC fait des sous-unités aßy marquées par un épitope His 6 ont été exprimées dans l'ovocyte de Xenopus leavis. Les trois sous-unités aßy du complexe ENaC peuvent être co-purifiées sur des billes d'agarose Ni+2-NTA et montrent les modifications post-traductionnelles attendues pour le complexe fonctionnel ENaC exprimé en surface. Nous avons pu démontrer que ce complexe ENaC fonctionnel, est formé de deux sous-unités a différentes, mais de une seule sous-unité ß et une seule sous-unité y, suggérant un complexe ENaC formé de plus de trois sous-unités. L'estimation de la masse du complexe fonctionnel ENaC par Western blot, en comparaison avec des constructions concatemériques de ENaC faites de 2, 3, ou 4 sous-unités indique que le complexe aßy ENaC fonctionnel est une hétérotétramère composé de 2 sous-unités a, une ß et une y. Ces expériences ne représentent pas le fin d'une controverse quant à la structure des canaux ENaC et ASIC, mais soulèvent la question de la relevance fonctionnelle de la structure tridimentionelle du canal ASIC révélée par crystallographie.

Transcriptional regulation of MDR1, a gene involved in antifungal drug resistance in Candida albicans

ABSTRACT Upregulation of the Major Facilitator transporter gene MDR1 (Multi_drug Resistance 1) is one of the mechanisms observed in Candida albicans clinical isolates developing resistance to azole antifungal agents. To better understand this phenomenon, the cis-acting regulatory elements present in a modulatable reporter system under the control of the MDR1 promoter were characterized. In an azole-susceptible strain, transcription of this reporter is transiently upregulated in response to either benomyl or H2O2, whereas its expression is constitutively high in an azole-resistant strain (FR2). Two cis-acting regulatory elements, that are necessary and sufficient to convey the same transcriptional responses to a heterologous promoter (CDR2), were identified within the MDR1promoter. The first element, called BRE (for Benomyl Response Element, -296 to -260 with respect to the ATG start codon), is required for benomyl-dependent MDR1 upregulation and for constitutive high expression of MDR1 in FR2. The second element, termed HRE (for H2O2 Response Element, -561 to -520), is required for H2O2-dependent MDR1 upregulation, but is dispensable for constitutive high expression. Two potential binding sites (TTAG/CTAA) for the blip transcription factor Cap1p lie within the HRE. Moreover, inactivation of CAP1 abolished the transient response to H2O2 and diminished significantly the transient response to benomyl. Cap1p, which has been previously implicated in cellular responses to oxidative stress, may thus play a transacting and positive regulatory role in benomyl- and H2O2-dependent transcription of MDR1. However, it is not the only transcription factor involved in the response of MDR1 to benomyl. A minimal BRE element (-290 to -273) that is sufficient to detect in vitro sequence-specific binding of protein complexes in crude extracts prepared from C. albicans was also delimited. Genome-wide transcript profiling analyses undertaken with a matched pair of clinical isolates, one of which being azole-resistant and upregulating MDR1, and with an azole-susceptible strain exposed to benomyl, revealed that genes specifically upregulated by benomyl harbour in their promoters Cap1p binding site(s). This strengthened the idea that Cap1p plays a role in benomyl-dependent upregulation of MDR1. BRE-like sequences were also identified in several genes co-regulated with MDR1 in both conditions, which was consistent with the involvement of the BRE in both processes. A set of 147 mutants lacking a single transcription factor gene was next screened for loss of MDR1response to benomyl. Unfortunately, none of the tested mutants showed a loss of benomyl-dependent MDR1 upregulation. Nevertheless, a significant diminution of the response was observed in the mutants in which the MADS-box transcription factor Mcm1p and the C2H2 zinc finger transcription factor orf19.13374p were inactivated, suggesting that Mcm1p and orf19.13374p are involved in MDR1response to benomyl. Interestingly, the BRE contains a perfect match to the binding consensus of Mcm1p, raising the possibility that MDR1may be a direct target of this transcriptional activator. In conclusion, while the identity of the trans-acting factors that bind to the BRE and HRE remains to be confirmed, the tools we have developed during characterization of the cis-acting elements of the MDR1promoter should now serve to elucidate the nature of the components that modulate its activity. RESUME La surexpression du gène MDR1 (pour Résistance Multidrogue 1), qui code pour un transporteur de la famille des Major Facilitators, est l'un des mécanismes observés dans les isolats cliniques de la levure Candida albicans développant une résistance aux agents antifongiques appelés azoles. Pour mieux comprendre ce phénomène, les éléments de régulation agissant en cis dans un système rapporteur modulable sous le contrôle du promoteur MDR1 ont été caractérisés. Dans une souche sensible aux azoles, la transcription de ce rapporteur est transitoirement surélevée en réponse soit au bénomyl soit à l'agent oxydant H2O2, alors que son expression est constitutivement élevée dans une souche résistante aux azoles (souche FR2). Deux éléments de régulation agissant en cis, nécessaires et suffisants pour transmettre les mêmes réponses transcriptionnelles à un promoteur hétérologue (CDR2), ont été identifiés dans le promoteur MDR1. Le premier élément, appelé BRE (pour Elément de Réponse au Bénomyl, de -296 à -260 par rapport au codon d'initiation ATG) est requis pour la surexpression de MDR1dépendante du bénomyl et pour l'expression constitutive de MDR1 dans FR2. Le deuxième élément, appelé HRE (pour Elément de Réponse à l'H2O2, de -561 à -520), est requis pour la surexpression de MDR1 dépendante de l'H2O2, mais n'est pas impliqué dans l'expression constitutive du gène MDR1. Deux sites de fixation potentiels (TTAG/CTAA) pour le facteur de transcription Cap1p ont été identifiés dans l'élément HRE. De plus, l'inactivation de CAP1 abolit la réponse transitoire à l'H2O2 et diminua significativement la réponse transitoire au bénomyl. Cap1p, qui est impliqué dans les réponses de la cellule au stress oxydatif, doit donc jouer un rôle positif en trans dans la surexpression de MDR1 dépendante du bénomyl et de l'H2O2. Cependant, ce n'est pas le seul facteur de transcription impliqué dans la réponse au bénomyl. Un élément BRE d'une longueur minimale (de -290 à -273) a également été défini et est suffisant pour détecter une interaction spécifique in vitro avec des protéines provenant d'extraits bruts de C. albicans. L'analyse du profil de transcription d'une paire d'isolats cliniques comprenant une souche résistante aux azoles surexprimant MDR1, et d'une souche sensible aux azoles exposée au bénomyl, a révélé que les gènes spécifiquement surexprimés par le bénomyl contiennent dans leurs promoteurs un ou plusieurs sites de fixation pour Cap1p. Ceci renforce l'idée que Cap1p joue un rôle dans la surexpression de MDR1dépendante du bénomyl. Une ou deux séquences ressemblant à l'élément BRE ont également été identifiées dans la plupart des gènes corégulés avec MDR1 dans ces deux conditions, ce qui était attendu compte-tenu du rôle joué par cet élément dans les deux processus. Une collection de 147 mutants dans lesquels un seul facteur de transcription est inactivé a été testée pour la perte de réponse au bénomyl de MDR1. Malheureusement, la surexpression de MDR1 dépendante du bénomyl n'a été perdue dans aucun des mutants testés. Néanmoins, une diminution significative de la réponse a été observée chez des mutants dans lesquels le facteur de transcription à MADS-box Mcm1p et le facteur de transcription à doigts de zinc de type C2H2 orf19.13374p ont été inactivés, suggérant que Mcm1p et orf19.13374p sont impliqués dans la réponse de MDR1au bénomyl. Il est intéressant de noter que la BRE contient une séquence qui s'aligne parfaitement avec la séquence consensus du site de fixation de Mcm1p, ce qui soulève la possibilité que MDR1 pourrait être une cible directe de cet activateur transcriptionnel. En conclusion, alors que l'identité des facteurs agissant en trans en se fixant à la BRE et à la HRE reste à être confirmée, les outils que nous avons développés au cours de la caractérisation des éléments agissant en cis sur le promoteur MDR1 peut maintenant servir à élucider la nature des composants modulant son activité.

Sensing, uptake and response to c4-dicarboxylic acids in pseudomonas aeruginosa pao1

C4-dicarboxylates are one of the preferred carbon and energy sources for the growth of P. aeruginosa, a ubiquitous and metabolically versatile bacterium. However, despite their importance, C4-dicarboxylates sensing and uptake systems were poorly understood in P. aeruginosa and only little information was available in the literature. In our work, the C4-dicarboxylate transport (Dct) system in P. aeruginosa was found to be composed of a novel two-component system, called DctB/DctD, regulating together with the sigma factor RpoN the expression of two newly identified C4-dicarboxylate transporters: DctA and DctPQM. Inactivation of the dct A, dctB or dctD gene caused a growth defect of the strain in minimal media supplemented with succinate, fumarate or malate, indicating their major role in Dct. However, residual growth of the dctA mutant in these media suggested the presence of redundant C4-dicarboxylate transporter(s). Tn5 insertion mutagenesis of the kdctA mutant, combined with a screening for growth on succinate, led to the identification of a second Dct system, the DctPQM transporter, belonging to the tripartite ATP-independent periplasmic (TRAP) family of carriers. AdctAAdctPQM double mutant showed no growth on malate and fumarate albeit residual growth on succinate suggested that additional transporters for succinate are present. Competition experiments demonstrated that the DctPQM carrier was more efficient than the DctA carrier for the utilization of succinate at μΜ concentrations, whereas DctA was the major transporter at mM concentrations. For the first time, high- and low-affinity uptake systems for succinate (DctA and DctPQM) are reported to function co-ordinately to transport C4- dicarboxylates. Most probably, the presence of redundant uptake systems contributes to the versatility of this bacterium. Next, the regulation of the Dct system was investigated. While performing a parallel study about the carbon catabolite repression (CCR) phenomenon in P. aeruginosa, a link between the CCR cascade (CbrAB/CrcZ/Crc) and the Dct system was observed. Crc is a translational repressor acting when preferred carbon sources (like C4-dicarboxylates) are present. CrcZ is a small RNA acting as a functional antagonist of Crc and induced by the CbrA/CbrB two-component system when non preferred carbon sources (like mannitol) are utilized. Novel targets of the CbrAB/CrcZ/Crc system in P. aeruginosa were identified using transcriptome analysis; among them dctA and dctPQM were detected. CCR is regulating the dct transporter genes expression depending on the succinate concentrations in the medium of growth; this modulation of CCR is possible because, at the same time, succinate concentrations tune CCR. In a medium containing high succinate concentrations, CrcZ levels were low and therefore Crc inhibited the translation of mRNA targets. Whereas in a medium containing low succinate concentrations, the subsequent increase of CrcZ levels sequestered Crc, inhibiting its activity. This model shows for the first time that CCR possesses a feedback-based circuitry, a very important type of regulatory loop that confers the best adaptive response under changing environmental conditions. The expression of the dct transporter genes is also found to be regulated by the RNA chaperone protein Hfq. Hfq has the same post-transcriptional effect than Crc at high concentration of succinate, i.e. inhibiting dctP and dctR and indirectly favouring dctA expression. Moreover, an additional indirect positive regulation of dctP expression by Hfq was found. Finally, a metabolome approach was performed to investigate the internal signals modulating CCR via induction of CbrA activity in P. aeruginosa PAOl and P. putida KT2442. The results of the analysis are currently under study in the laboratory. - Les acides C4-dicarboxyliques font partie des sources de carbone et d'énergie préférés de P. aeruginosa, une bactérie versatile et ubiquitaire. Néanmoins, malgré leur importance, comment la présence des acides C4-dicarboxyliques dans le milieu est sentie par la bactérie et comment ils sont transportés dans la cellule chez P. aeruginosa n'étaient pas connus. De plus, peu d'informations sur ces procédés ont été répertoriées dans la littérature. Grace à notre travail, le système de transport des acides C4-dicarboxyliques (Dct) chez P. aeruginosa a pu être caractérisé. En effet, il est composé d'un nouveau système à deux composants, nommé DctB/DctD, qui régule, en combinaison avec le facteur sigma alternatif RpoN, l'expression des deux nouveaux transporteurs des acides C4-dicarboxyliques: DctA et DctPQM. L'inactivation des gènes dctA, dctB or dctD cause un défaut de croissance des souches mutantes dans un milieu minimum contenant du succinate, fumarate ou malate; confirmation de leur rôle dans le Dct. Cependant, une croissance résiduelle du mutant dctA dans ces milieux suggérerait une redondance des transporteurs d'acides Grdicarboxyliques. Une expérience de mutagenèse dans la souche AdctA, utilisant le transposon Tn5, combiné avec un criblage génétique sur la croissance dans le succinate, nous a permis d'identifier le deuxième transporteur DctPQM. DctPQM appartient à la famille des transporteurs TRAP (tripartite ATP-independent periplasmic). Un double mutant AdctAAdctPQM ne pousse pas dans du malate ou fumarate mais par contre présente une croissance résiduelle dans le succinate suggérant l'existence de transporteurs supplémentaires pour le succinate. En réalisant des expériences de compétitions nous avons démontré que le transporteur DctPQM est plus efficace que le transporteur DctA pour l'utilisation de succinate à une concentration de l'ordre du μΜ. Par contre, DctA est le transporteur le plus important pour une concentration de succinate de l'ordre du raM. Pour la première fois, deux systèmes de transport, un avec une forte- et un avec une faible-affinité (DctA et DctPQM) pour le succinate, sont coordonnés dans leur activité de transport des acides C4- dicarboxyliques, probablement contribuant à la versatilité de la bactérie. Ensuite, nous avons étudié la régulation du system Dct. En effectuant, en parallèle, une étude sur le phénomène de la répression catabolique (RC) chez P. aeruginosa, un lien entre la RC et le système Dct a été observé. La cascade des régulateurs formant la RC est composée de CbrA/CbrB, CrcZ et Crc. Crc est un répresseur traductionnel qui agit quand des sources de carbone préférées (comme les acides C4-dicarboxyliques) sont présentes dans le milieu. CrcZ est un petit ARN non-codant qui agit comme antagoniste de Crc. L'expression de CrcZ est induite par le système à deux composants CbrA/CbrB lorsque une source de carbone non-préférée est utilisée (comme le mannitol). Des nouvelles cibles du système CbrAB/CrcZ/Crc chez P. aeruginosa ont été identifiées grâce à une analyse du transcriptome des souches mutantes des régulateurs de la cascade. Parmi les cibles identifiées, les gènes dctA et dctPQM étaient présents. La RC régule l'expression des transporteurs dct en fonction de la concentration de succinate dans le milieu de croissance. Cette régulation est possible parce que, en même temps, les acides C4- dicarboxyliques régulent la RC. Dans un milieu contenant une grande concentration du succinate, le niveau d'expression de CrcZ est faible, donc Crc peut inhiber l'expression de ces ARN messagers cibles. Par contre, dans un milieu avec une faible concentration de succinate, l'augmentation de l'expression de CrcZ titre Crc et inhibe son activité. Ce modèle de régulation rétroactive est très important pour le phénomène de la RC, parce qu'il permet à la bactérie d'accorder une meilleure réponse à un changement environnemental. L'expression des gènes codant pour les transporteurs dct sont aussi régulés par la protéine chaperonne d'ARN Hfq. Hfq semble avoir le même effet traductionnelle que Crc, lorsqu'il y a une forte concentration de succinate. Nous avons ainsi observé une régulation négative de l'expression du gène dct Ρ et dctR, qui code pour un répresseur de la transcription de dctA. Nous avons aussi observé une régulation positive de la transcription de dctP par Hfq, probablement de façon indirecte. Enfin, une analyse du metabolome a était utilisée pour chercher les signaux internes modulant la RC et, en particulier, l'activité de la protéine senseur CbrA chez P. aeruginosa PAOl et P. putida KT2442. Les résultats de l'analyse sont en cours d'étude dans le laboratoire.

Role of intracellular cysteines in ENaC function

The epithelial sodium channel (ENaC) regulates the sodium reabsorption in the collecting duct principal cells of the nephron. ENaC is mainly regulated by hormones such as aldosterone and vasopressin, but also by serine proteases, Na+ and divalent cations. The crystallization of an ENaC/Deg member, the Acid Sensing Ion Channel, has been recently published but the pore-lining residues constitution of ENaC internal pore remains unclear. It has been reported that mutation aS589C of the selectivity filter on the aENaC subunit, a three residues G/SxS sequence, renders the channel permeant to divalent cations and sensitive to extracellular Cd2+. We have shown in the first part of my work that the side chain of aSer589 residue is not pointing toward the pore lumen, permitting the Cd2+ to permeate through the ion pore and to coordinate with a native cysteine, gCys546, located in the second transmembrane domain of the gENaC subunit. In a second part, we were interested in the sulfhydryl-reagent intracellular inhibition of ENaC-mediated Na+ current. Kellenberger et al. have shown that ENaC is rapidly and reversibly inhibited by internal sulfhydryl reagents underlying the involvement of intracellular cysteines in the internal regulation of ENaC. We set up a new approach comprising a Substituted Cysteine Analysis Method (SCAM) using intracellular MTSEA-biotin perfusion coupled to functional and biochemical assays. We were thus able to correlate the cysteine-modification of ENaC by methanethiosulfonate (MTS) and its effect on sodium current. This allowed us to determine the amino acids that are accessible to intracellular MTS and the one important for the inhibition of the channel. RESUME : Le canal épithélial sodique ENaC est responsable de la réabsorption du sodium dans les cellules principales du tubule collecteur rénal. Ce canal est essentiellement régulé par voie hormonale via l'aldostérone et la vasopressine mais également par des sérines protéases, le Na+ lui-même et certains cations divalents. La cristallisation du canal sodique sensible au pH acide, ASIC, un autre membre de la famille ENaC/Deg, a été publiée mais les acides aminés constituant le pore interne d'ENaC restent indéterminés. Il a été montré que la mutation aS589C du filtre de sélectivité de la sous-unité aENaC permet le passage de cations divalents et l'inhibition du canal par le Cd2+ extracellulaire. Dans un premier temps, nous avons montré que la chaîne latérale de la aSer589 n'est pas orientée vers l'intérieur du pore, permettant au Cd2+ de traverser le canal et d'interagir avec une cysteine native du second domaine transrnembranaire de la sous-unité γENaC, γCys546. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'inhibition d'ENaC par les réactifs sulfhydryl internes. Kellenberger et al. ont montré l'implication de cystéines intracellulaires dans la régulation interne d'ENaC par les réactifs sulfhydryl. Nous avons mis en place une nouvelle approche couplant la méthode d'analyse par substitution de cystéines (SCAM) avec des perfusions intracellulaires de MTSEAbiotine. Ainsi, nous pouvons meure en corrélation les modifications des cystéines d'ENaC par les réactifs methanethiosulfonates (MTS) avec leur effet sur le courant sodique, et donc mettre en évidence les acides aminés accessibles aux MTS intracellulaires et ceux qui sont importants dans la fonction du canal.

Characterization of N-cadherin association to lipid rafts in melanoma

RESUME La peau est un organe complex composé de deux parties distinctes: l'épiderme et le derme, séparé par une membrane basale. Dans la couche basale de l'épiderme, les melanocytes synthétisent la mélanine dans des mélanosomes. Les mélanosomes sont ensuite transportés des mélanocytes vers les kératinocytes, protégeant ainsi la peau des dégâts dus aux radiations U.V. La E-cadhérine assure l'adhésion entre les mélanocytes et les kératinocytes. Au cours de la transformation du mélanocyte en cellule malignes, les mélanocytes perdent l'expression de la E-cadhérine et, simultanément, se mettent à exprimer la N-cadhérine, ce phénomène est nommé « cadherin switch ». La perte de l'expression de la E-cadhérine permet au mélanocytes d'échapper au contrôle des kératinocytes, tandis que l'expression de la N-cadhérine promeut l'invasion métastasique des cellules de mélanome. Préalablement, nous avons trouvé qu'une fraction de la N-cadhérine était localisée les microdomaines membranaires spécialisés, enrichi en cholestérol et en glycosphingolipides, appelés « lipid rafts ». Une des particularité des « lipid rafts » est qu'ils sont riches en molécules permettant la transmission de signaux d'activation. De plus, des travaux récents rapportent qu'un sous-type de « lipid rafts » appelé caveolae pourrai contribuer à la progression tumorale. S'appuyant sur le rôle prépondérant de la N-cadhérine dans la progression du mélanome ainsi que sur sa présence dans les « lipid rafts », nous avons émis l'hypothèse que l'association de la N-cadhérine avec les « lipid rafts » pourrai contribuer à la progression du mélanome. Le but de ce projet à été de caractériser l'association de la Ncadhérine avec les « lipid rafts » au cours de la progression du mélanome. Au moyen de lignées cellulaires humaines, dérivées de mélanomes à différents stades de progression, nous avons trouvé que (1) la N-cadhérine est partiellement associée aux «lipid rafts » dans six lignées dérivées de mélanome en phase avancée de progression et dans des tumeurs expérimentales, mais pas dans deux lignées dérivées de mélanome à un stade plus précoce ; (2) l'association de la N-cadhérine dans les « lipid rafts » ne dépent pas de son niveau d'expression ; (3) la E-cadhérine n'est pas présente dans les « lipid rafts »d'une lignée de cellule de mélanome ayant conservé l'expression de la E-cadhérine ; (4) la localisation de la N-cadhérine dans les « lipid rafts »n'est pas modulée par les facteurs de croissance bFGF, IGF-I, et HRG1-β1, ni par des voies de signalisation impliquant MEK, PKA, les kinases de la famille Src, et PI3K ; (5) l'association de la N-cadhérine avec les « lipid rafts » n'est pas requise pour la stabilisation des jonctions adhérentes et n'est pas perturbée par la destruction de ces dernières ; (6) la N-cadhérine dans les « lipid rafts » forme un complexe avec β-caténine, p 120ctn et α-caténine. En conclusion, cette étude originale montre pour la première fois que dans des cellules de mélanome agressifs, une fraction de la N-cadhérine est localisée dans les « lipid rafts » en association avec β-caténine, p 120ctn et α-caténine. Comme la présence de la N-cadhérine dans les « lipid rafts » ne contribue pas à la formation de jonction adhérentes, cette étude suggère une nouvelle fonction pour la N-cadhérine dans les « lipid rafts ». SUMMARY Human skin is a complex organ composed of two layers separated by a basement membrane: the epidermis and the dermis. In the basal layer of the epidermis, the melanin-producing cells of the skin, the melanocytes deliver melanin-containing melanosomes to keratinocytes, thereby protecting the epidermis and the dermis from the deleterious effects of ultraviolet light. Melanocytes physically interact with keratinocytes through E-cadherin-mediated adhesion. During malignant transformation into melanoma cells, melanocytes lose E-cadherin expression and concomitantly gain expression of N-cadherin, a phenomenon referred to as "cadherin switch". Loss of E-cadherin allows melanocytes to escape the regulatory effects of neighbouring keratinocytes, while gain of N-cadherin expression promotes migration, invasion and metastatic abilities of melanoma cells. In preliminary experiments, we found that a fraction of N-cadherin localized to specialized membrane microdomains enriched in cholesterol- and glycosphingolipid, called lipid rafts. One particular feature of lipid rafts is that they are rich in signalling molecules and they possibly modulate transmembrane signalling events. Moreover, recent reports suggested that a specialized type of rafts called caveolae might contribute to tumor progression. Based on the documented role of N-cadherin in melanoma progression and its presence in lipid rafts of melanoma cells, we raised the hypothesis that the association of N-cadherin with lipid rafts might be relevant to melanoma progression. The aim of this project was to characterize N-cadherin associated to lipid rafts during melanoma progression. Using human melanoma cell lines derived from melanoma at different stages of progression, we found that (1) N-cadherin is partly associated to lipid rafts in six cell lines derived from melanomas at late stages of progression and in experimental tumors, but not in two melanoma cell lines derived from early stages; (2) N-cadherin targeting to lipid rafts does not depend on its expression level; (3) E-cadherin is not localized in lipid rafts of a melanoma cell line that retained E-cadherin expression; (4) N-cadherin localization to lipid rafts is not modulated by the growth factors bFGF, IGF-I, and HRG1-β1, nor by MEK-, PKA-, Src family kinases-, and PI3K-mediated signalling events; (5) the association of N-cadherin with lipid rafts is not required for adherens junctions stability nor it is perturbed by adherens junctions disruption; (6) N-cadherin in lipid rafts is in complex with β-catenin, p 120ctm and α-catenin. In conclusion, this study provides original evidence that in aggressive melanoma cells a pool of N-cadherin is localized in lipid rafts in association with β-catenin, p 120 and α-catenin. The presence of N-cadherin in lipid rafts independently of its involvement in adherens junctions formation, suggests a possible new role for N-cadherin recruited to lipid rafts. Further studies investigating the biological meaning of this localization promise to uncover new properties of this molecule.

The role of Bmi1 in CNS development and in retinal degeneration

SUMMARY : The present work addresses several aspects of cell cycle regulation, cell fate specification and cell death in the central nervous system (CNS), specifically the cortex and the retina. More precisely, we investigated the role of Bmi1, a polycomb family gene required for stem cell proliferation and self-renewal, in the development of the cerebral cortex, as well as in the genesis of the retina. These data, together with studies published during the last two decades concerning cell cycle re-activation in apoptotic neurons in the CNS, raised the question of a possible link between regulation of the cell cycle during development and during retinal degeneration. 1. The effects of Bmi1 loss in the cerebral cortex : Consistently with our and others' observations on failure of Bmi9-/- stem cells to proliferate and self-renew in vitro, the Bmi9-/- cerebral cortex presented slight defects in proliferation in stem/progenitor cells compartments in vivo. This was in accordance with the pattern of Bmi1 expression in the developing forebrain. The modest proliferation defects, compared to the drastic consequences of Bmi9 loss in vitro, suggest that cell-extrinsic mechanisms may partially compensate for Bmi1 deletion in vivo during cortical histogenesis. Nevertheless, we observed a decreased proliferating activity in neurogenic regions of the adult telencephalon, more precisely in the subventricular zone, showing that Bmi1 controls neural stem/progenitor proliferation during adulthood in vivo. Our data also highlight an increased production of astrocytes at birth, and a generalized gliosis in the adult Bmi9-/- brain. Importantly, glial progenitors and astrocytes retained the ability to proliferate in the absence of Bmi1. 2. The effects of Bmi1 loss in the retina : The pattern of expression of Bmi1 during development and in the adult retina suggests a role for Bmi1 in cell fate specification and differentiation rather than in proliferation. While the layering and the global structure of the retina appear normal in Bmi1 /adult mice, immunohistochemìcal analysis revealed defects in the three major classes of retinal interneurons, namely: horizontal, bipolar and amacrine cells. Electroretinogram recordings in Bmi9-/- mice are coherent with the defects observed at the histological level, with a reduced b-wave and low-profile oscillatory potentials. These results show that Bmi1 controls not only proliferation, but also cell type generation, as previously observed in the cerebellum. 3. Cell cycle events and related neuroprotective strategies in retinal degeneration : In several neurodegenerative disorders, neurons re-express cell cycle proteins such as cyclin dependent kinases (Cdks) prior to apoptosis. Here, we show for the first time that this is also the case during retinal degeneration. Rd1 mice carry a recessive defect (Pdeóbrd/rd) that causes retinal degeneration and serves as a model of retinitis pigmentosa. We found that photoreceptors express Cdk4 and Cdk2, and undergo DNA synthesis prior to cell death. To interfere with the reactivation of Cdk-related pathways, we deleted E2fs or Brni1, which normally allow cell cycle progression. While deleting E2f1 (downstream of Cdk4/6) in Rd1 mice provides only temporary protection, knocking out Bmi1 (upstream of Cdks) leads to an extensive neuroprotective effect, independent of p16ink4a or p19arf, two tumor suppressors regulated by Bmi1. Analysis of Cdks and the DNA repair-related protein Ligase IV showed that Bmi1 acts downstream of DNA repair events and upstream of Cdks in this neurodegenerative mechanism. Expression of Cdks during an acute model of retinal degeneration, light damage-induced photoreceptor death, points to a role for Bmi1 and cell cycle proteins in retinal degeneration. Considering the similarity with the cell cycle-related apoptotic pathway observed in other neurodegenerative diseases, Bmi1 is a possible general target to prevent or delay neuronal death. RESUME : Ce travail aborde plusieurs aspects de la régulation du cycle cellulaire, de la spécification du devenir des cellules et de la mort cellulaire dans le système nerveux centrale (SNC), plus particulièrement dans le cortex cérébral et dans la rétine. Nous nous sommes intéressés au gène Bmi1, appartenant à la famille polycomb et nécessaire à la prolifération et au renouvellement des cellules souches. Nous avons visé à disséquer son rôle dans le développement du cortex et de la rétine. Ces données, ainsi qu'une série de travaux publiés au cours des deux dernières décennies concernant la réactivation du cycle cellulaire dans les neurones en voie d'apoptose dans le SNC, nous ont ensuite poussé à chercher un lien entre la régulation du cycle cellulaire pendant le développement et au cours de la dégénérescence rétinienne. 1. Les effets de l'inactivation de Bmi1 dans le cortex cérébral : En accord avec l'incapacité des cellules souches neurales in vitro à proliférer et à se renouveler en absence de Bmi1, le cortex cérébral des souris Bmi1-/- présente de légers défauts de prolifération dans les compartiments contenant les cellules souches neurales. Ceci est en accord avec le profil d'expression de Bmi1 dans le télencéphale. Les conséquences de la délétion de Bmi1 sont toutefois nettement moins prononcées in vivo qu'in vitro ; cette différence suggère l'existence de mécanismes pouvant partiellement compenser l'absence de Bmi1 pendant la corticogenèse. Néanmoins, l'observation d'une réduction de la prolifération dans la zone sous-ventriculaire, la zone majeure de neurogenèse dans le télencéphale adulte, montre que Bmi1 contrôle la prolifération des cellules souche/progénitrices neurales chez la souris adulte. Nos résultats démontrent par ailleurs une augmentation de la production d'astrocytes à la naissance ainsi qu'une gliose généralisée à l'état adulte chez les souris Bmi1-/-. Les progéniteurs gliaux et les astrocytes conservent donc leur capacité à proliférer en absence de Bmi1. 2. Les effets de l'inactivation de Bmi1 dans la rétine : Le profil d'expression de Bmi1 pendant fe développement ainsi que dans la rétine adulte suggère un rôle de Bmi1 dans la spécification de certains types cellulaires et dans la différentiation plutôt que dans la prolifération. Alors que la structure et la lamination de la rétine semblent normales chez les souris Bmi1-/-, l'analyse par immunohistochimie amis en évidence des défauts au niveau des trois classes d'interneurones rétiniens (les cellules horizontales, bipolaires et amacrines). Les électrorétinogrammes des souris Bmi1-/- sont cohérents avec les défauts observés au niveau histologique et montrent une réduction de l'onde « b » et des potentiels oscillatoires. Ces résultats montrent que Bmi1 contrôle la génération de certaines sous-populations de neurones, comme démontré auparavant au niveau de cervelet. 3. Réactivation du cycle cellulaire et stratégies théraoeutiaues dans les dégénérescences rétiniennes : Dans plusieurs maladies neurodégénératives, les neurones ré-expriment des protéines du cycle cellulaire telles que les kinases cycline-dépendantes (Cdk) avant d'entrer en apoptose. Nous avons démontré que c'est aussi le cas dans les dégénérescences rétiniennes. Les souris Rd1 portent une mutation récessive (Pde6brd/rd) qui induit une dégénérescence de la rétine et sont utilisées comme modèle animal de rétinite pigmentaire. Nous avons observé que les photorécepteurs expriment Cdk4 et Cdk2, et entament une synthèse d'ADN avant de mourir par apoptose. Pour interférer avec la réactivation les mécanismes Cdk-dépendants, nous avons inactivé les gènes E2f et Bmi1, qui permettent normalement la progression du cycle cellulaire. Nous avons mis en évidence que la délétion de E2f1 (en aval de Cdk4/6) dans les souris Rd1 permet une protection transitoire des photorécepteurs. Toutefois, l'inactivation de Bmi1 (en amont des Cdk) est corrélée à une neuroprotection bien plus durable et ceci indépendamment de p16ink4a et p19arf, deux suppresseurs de tumeurs normalement régulés par Bmi1. L'analyse des Cdk et de la ligase IV (une protéine impliquée dans les mécanismes de réparation de l'ADN) a montré que Bmi1 agit en aval des événements de réparation de l'ADN et en amont des Cdk dans la cascade apoptotique dans les photorécepteurs des souris Rd1. Nous avons également observé la présence de Cdk dans un modèle aigu de dégénérescence rétinienne induit par une exposition des animaux à des niveaux toxiques de lumière. Nos résultats suggèrent donc un rôle général de Bmi1 et des protéines du cycle cellulaire dans les dégénérescences de la rétine. Si l'on considère la similarité avec les événements de réactivation du cycle cellulaire observés dans d'autres maladies neurodégénératives, Bmi1 pourrait être une cible thérapeutique générale pour prévenir la mort neuronale.

La communication intersubjective du bébé dans le triangle primaire

L'étude de la communication à trois entre le bébé, le père et la mère au travers du jeu du trilogue lausannois montre que la communication intersubjective dans la famille suit la même trajectoire développementale que la communication intersubjective à deux entre le bébé et sa mère ou son père : d'une forme primaire ou directe, elle évolue vers une forme secondaire ou référentielle, pour intégrer ensuite des formes symbolique et morale et enfin narrative.