Characterization of the molecular mechanisms of insulin exocytosis and of their adaptation to physiopathological conditions

Résumé large public Le glucose est une source d'énergie essentielle pour notre organisme, indispensable pour le bon fonctionnement des cellules de notre corps. Les cellules β du pancréas sont chargées de réguler l'utilisation du glucose et de maintenir la glycémie (taux de glucose dans le sang) à un niveau constant. Lorsque la glycémie augmente, ces dernières sécrètent l'insuline, une hormone favorisant l'absorption, l'utilisation et le stockage du glucose. Une sécrétion insuffisante d'insuline provoque une élévation anormale du taux de glucose dans le sang (hyperglycémie) et peut mener au développement du diabète sucré. L'insuline est sécrétée dans le sang par un mécanisme particulier appelé exocytose. Une meilleure compréhension de ce mécanisme est nécessaire dans l'espoir de trouver des nouvelles thérapies pour traiter les 170 millions de personnes atteintes de diabète sucré à travers le monde. L'implication de diverses protéines, comme les SNAREs ou Rabs a déjà été démontrée. Cependant leurs mécanismes d'action restent, à ce jour, peu compris. De plus, l'adaptation de la machinerie d'exocytose à des conditions physiopathologiques, comme l'hyperglycémie, est encore à élucider. Le but de mon travail de thèse a été de clarifier le rôle de deux protéines, Noc2 et Tomosyn, dans l'exocytose ; puis de déterminer les effets d'une exposition prolongée à un taux élevé de glucose sur l'ensemble des protéines de la machinerie d'exocytose. Noc2 est un partenaire potentiel de deux Rabs connues pour leur implication dans les dernières étapes de l'exocytose, Rab3 et Rab27. Grâce à l'étude de différents mutants de Noc2, j'ai montré que l'interaction avec Rab27 permet à la protéine de s'associer avec les organelles de la cellule β contenant l'insuline. De plus, en diminuant sélectivement l'expression de Noc2, j'ai déterminé l'importance de cette protéine pour le bon fonctionnement du processus d'exocytose et le relâchement de l'insuline. Quant à Tomosyn, une protéine interagissant avec les protéines SNAREs, j'ai démontré son importance dans la sécrétion d'insuline en diminuant de manière sélective son expression dans les cellules β. Ensuite, grâce à une combinaison d'approches moléculaires et de microscopie, j'ai mis en évidence le rôle de Tomosyn dans les dernières étapes de l'exocytose. Enfin, puisque la sécrétion d'insuline est diminuée lors d'une hyperglycémie prolongée, j'ai analysé l'adaptation de la machinerie d'exocytose à ces conditions. Ceci m'a permis de découvrir que l'expression de quatre protéines essentielles pour le processus d'exocytose, Noc2, Rab3, Rab27 et Granuphilin, est fortement diminuée lors d'une hyperglycémie chronique. L'ensemble de ces données met en évidence l'importance de Noc2 et Tomosyn dans la sécrétion d'insuline. L'inhibition, par un taux élevé de glucose, de l'expression de Noc2 et d'autres protéines indispensables pour l'exocytose suggère que ce phénomène pourrait contribuer au développement du diabète sucré. Résumé L'exocytose d'insuline, en réponse au glucose circulant dans le sang, est la fonction principale de la cellule β. Celle-ci permet de stabiliser le taux de glucose sanguin (glycémie). Le diabète de type 2 est caractérisé par une glycémie élevée due, principalement, à un défaut de sécrétion d'insuline en réponse au glucose. La compréhension des mécanismes qui contrôlent l'exocytose d'insuline est essentielle pour clarifier les causes du diabète sucré. Plusieurs composants impliqués dans ce processus ont été identifiés. Ceux-ci incluent les SNAREs Syntaxin-1, VAMP2 et SNAP25 et les GTPases Rab3 et Rab27 qui jouent un rôle dans les dernières étapes de l'exocytose. Pendant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle de Noc2, un des partenaires de Rab3 et Rab27, dans l'exocytose d'insuline. Nous avons déterminé que Noc2 s'associe aux granules de sécrétion d'insuline grâce à son interaction avec Rab27. La diminution de l'expression de Noc2 dans la lignée cellulaire β INS-1E, par ARN interférence, influence négativement la sécrétion d'insuline stimulée par différents sécrétagogues et prouve que cette protéine Noc2 est essentielle pour l'exocytose d'insuline. L'interaction avec Munc13, une protéine impliquée dans l'arrimage des vésicules, suggère que Noc2 participe au recrutement des granules d'insuline à la membrane plasmique. Ensuite, j'ai analysé l'adaptation de la machinerie d'exocytose à des concentrations supraphysiologiques de glucose. Le niveau d'expression de Rab3 et Rab27 et de leurs effecteurs Granuphilin/S1p4 et Noc2 est fortement diminué par une exposition prolongée des cellules β à haut glucose. L'effet observé est en relation avec l'induction de l'expression de ICER, un facteur de transcription surexprimé dans des conditions d'hyperglycémie et également dans des modèles génétiques de diabète de type 2. La surexpression de ICER dans des cellules INS-1E diminue l'expression de Rab3, Rab27, Granuphilin/Slp4 et Noc2 et par conséquent l'exocytose d'insuline. Ainsi, l'induction de ICER, après une exposition prolongée à haut glucose, régule négativement l'expression de protéines essentielles pour l'exocytose et altère la sécrétion d'insuline. Ce mécanisme pourrait contribuer au dysfonctionnement de l'exocytose d'insuline dans le diabète de type 2. Dans la dernière partie de ma thèse, j'ai investigué le rôle de la protéine Tomosyn-1 dans la formation du complexe SNARE. Cette protéine a une forte affinité pour Syntaxin-1 et contient un domaine SNARE. Tomosyn-1 est concentrée dans les régions cellulaires enrichies en granules de sécrétion. La diminution sélective de l'expression de Tomosyn-1 induit une réduction de l'exocytose stimulée par différents sécrétagogues. Cet effet est dû à un défaut de fusion des granules avec la membrane plasmique. Ceci nous indique que Tomosyn-1 intervient dans une phase importante de la préparation des vésicules à la fusion, qui est nécessaire à l'exocytose. Abstract: Insulin exocytosis from pancreatic β-cells plays a central role in blood glucose homeostasis. Diabetes mellitus is a complex metabolic disorder characterized by secretory dysfunctions in pancreatic β-cells and release of amounts of insulin that are inappropriate to maintain blood glucose concentration within normal physiological ranges. To define the causes of β-cell failure a basic understanding of the molecular mechanisms that control insulin exocytosis is essential. Some of the molecular components involved in this process have been identified, including the SNARE proteins VAMP2, Syntaxin-1 and SNAP25 and the two GTPases, Rab3 and Rab27, that regulate the final steps of insulin secretion. I first investigated the role of Noc2, a potential Rab3 and Rab27 partner, in insulin secretion. I found that Noc2 associates with Rab27 and is recruited by this GTPase on insulin- containing granules. Silencing of the Noc2 gene by RNA interference led to a strong impairment in the capacity of the β-cell line INS-1E to respond to secretagogues, indicating that appropriate levels of the protein are essential for insulin exocytosis. I also showed that Noc2 interacts with Munc13, a protein that controls vesicle priming, suggesting a possible involvement of Noc2 in the recruitment of secretory granules at the plasma membrane. In the second part of my thesis, I investigated the adaptation of the molecular machinery of exocytosis to physiopathological conditions. I found that the expression of Rab3, Rab27 and of their effectors Granuphilin/Slp4 and Noc2 is dramatically decreased by chronic exposure of β-ce1ls to supraphysiological glucose levels. The observed glucotoxic effect is a consequence of the induction of ICER, a transcriptional repressor that is increased by prolonged hyperglycemia and in genetic models of type 2 diabetes. Overexpression of ICER reduced Granuphilin, Noc2, Rab3 and Rab27 levels and inhibited exocytosis. These results suggest that the presence of inappropriate levels of ICER diminishes the expression of a group of proteins essential for exocytosis and contributes to defective insulin release in type 2 diabetes. In the last part of my thesis, I focused my attention on the role of Tomosyn-1, a Syntaxin-1 binding protein possessing a SNARE-like motif, in the control of SNARE complex assembly. I found that Tomosyn-1 is concentrated in cellular compartments enriched in insulin-containing secretory granules. Silencing of Tomosyn-1 did not affect the number of secretory granules docked at the plasma membrane but decreased their release probability, resulting in a reduction in stimulus-induced insulin exocytosis. These findings suggest that Tomosyn-1 is involved in a post-docking event that prepares secretory granules for fusion and is necessary to sustain exocytosis in response to insulin secretagogues.

Métropolisation, morphologie urbaine et développement durable : transformations urbaines et régulation de l'étalement : le cas de l'agglomération lausannoise

Résumé Métropolisation, morphologie urbaine et développement durable. Transformations urbaines et régulation de l'étalement : le cas de l'agglomération lausannoise. Cette thèse s'inscrit clans la perspective d'une analyse stratégique visant à un définir et à expliciter les liens entre connaissance, expertise et décision politique. L'hypothèse fondamentale qui oriente l'ensemble de ce travail est la suivante : le régime d'urbanisation qui s'est imposé au cours des trente dernières années correspond à une transformation du principe morphogénétique de développement spatial des agglomérations qui tend à alourdir leurs bilans écologiques et à péjorer la qualité du cadre de vie des citadins. Ces enjeux environnementaux liés aux changements urbains et singulièrement ceux de la forme urbaine constituent un thème de plus en plus important dans la recherche de solutions d'aménagement urbain dans une perspective de développement durable. Dans ce contexte, l'aménagement urbain devient un mode d'action et une composante de tout premier ordre des politiques publiques visant un développement durable à l'échelle locale et globale. Ces modalités de développement spatial des agglomérations émergent indiscutablement au coeur de la problématique environnementale. Or si le concept de développement durable nous livre une nouvelle de de lecture des territoires et de ses transformations, en prônant le modèle de la ville compacte et son corollaire la densification, la traduction à donner à ce principe stratégique reste controversée, notamment sous l'angle de l'aménagement du territoire et des stratégies de développement urbain permettant une mise en oeuvre adéquate des solutions proposées. Nous avons ainsi tenté dans ce travail de répondre à un certain nombre de questions : quelle validité accorder au modèle de la ville compacte ? La densification est-elle une réponse adéquate ? Si oui, sous quelles modalités ? Quelles sont, en termes de stratégies d'aménagement, les alternatives durables au modèle de la ville étalée ? Faut-il vraiment densifier ou simplement maîtriser la dispersion ? Notre objectif principal étant in fine de déterminer les orientations et contenus urbanistiques de politiques publiques visant à réguler l'étalement urbain, de valider la faisabilité de ces principes et à définir les conditions de leur mise en place dans le cas d'une agglomération. Pour cela, et après avoir choisi l'agglomération lausannoise comme terrain d'expérimentation, trois approches complémentaires se sont révélées indispensables dans ce travail 1. une approche théorique visant à définir un cadre conceptuel interdisciplinaire d'analyse du phénomène urbain dans ses rapports à la problématique du développement durable liant régime d'urbanisation - forme urbaine - développement durable ; 2. une approche méthodologique proposant des outils d'analyse simples et efficaces de description des nouvelles morphologies urbaines pour une meilleure gestion de l'environnement urbain et de la pratique de l'aménagement urbain ; 3. une approche pragmatique visant à approfondir la réflexion sur la ville étalée en passant d'une approche descriptive des conséquences du nouveau régime d'urbanisation à une approche opérationnelle, visant à identifier les lignes d'actions possibles dans une perspective de développement durable. Cette démarche d'analyse nous a conduits à trois résultats majeurs, nous permettant de définir une stratégie de lutte contre l'étalement. Premièrement, si la densification est acceptée comme un objectif stratégique de l'aménagement urbain, le modèle de la ville dense ne peut être appliqué saris la prise en considération d'autres objectifs d'aménagement. Il ne suffit pas de densifier pour réduire l'empreinte écologique de la ville et améliorer la qualité de vie des citadins. La recherche d'une forme urbaine plus durable est tributaire d'une multiplicité de facteurs et d'effets de synergie et la maîtrise des effets négatifs de l'étalement urbain passe par la mise en oeuvre de politiques urbaines intégrées et concertées, comme par exemple prôner la densification qualifiée comme résultante d'un processus finalisé, intégrer et valoriser les transports collectifs et encore plus la métrique pédestre avec l'aménagement urbain, intégrer systématiquement la diversité à travers les dimensions physique et sociale du territoire. Deuxièmement, l'avenir de ces territoires étalés n'est pas figé. Notre enquête de terrain a montré une évolution des modes d'habitat liée aux modes de vie, à l'organisation du travail, à la mobilité, qui font que l'on peut penser à un retour d'une partie de la population dans les villes centres (fin de la toute puissance du modèle de la maison individuelle). Ainsi, le diagnostic et la recherche de solutions d'aménagement efficaces et viables ne peuvent être dissociés des demandes des habitants et des comportements des acteurs de la production du cadre bâti. Dans cette perspective, tout programme d'urbanisme doit nécessairement s'appuyer sur la connaissance des aspirations de la population. Troisièmement, la réussite de la mise en oeuvre d'une politique globale de maîtrise des effets négatifs de l'étalement urbain est fortement conditionnée par l'adaptation de l'offre immobilière à la demande de nouveaux modèles d'habitat répondant à la fois à la nécessité d'une maîtrise des coûts de l'urbanisation (économiques, sociaux, environnementaux), ainsi qu'aux aspirations émergentes des ménages. Ces résultats nous ont permis de définir les orientations d'une stratégie de lutte contre l'étalement, dont nous avons testé la faisabilité ainsi que les conditions de mise en oeuvre sur le territoire de l'agglomération lausannoise. Abstract This dissertation participates in the perspective of a strategic analysis aiming at specifying the links between knowledge, expertise and political decision, The fundamental hypothesis directing this study assumes that the urban dynamics that has characterized the past thirty years signifies a trans-formation of the morphogenetic principle of agglomerations' spatial development that results in a worsening of their ecological balance and of city dwellers' quality of life. The environmental implications linked to urban changes and particularly to changes in urban form constitute an ever greater share of research into sustainable urban planning solutions. In this context, urban planning becomes a mode of action and an essential component of public policies aiming at local and global sustainable development. These patterns of spatial development indisputably emerge at the heart of environmental issues. If the concept of sustainable development provides us with new understanding into territories and their transformations, by arguing in favor of densification, its concretization remains at issue, especially in terms of urban planning and of urban development strategies allowing the appropriate implementations of the solutions offered. Thus, this study tries to answer a certain number of questions: what validity should be granted to the model of the dense city? Is densification an adequate answer? If so, under what terms? What are the sustainable alternatives to urban sprawl in terms of planning strategies? Should densification really be pursued or should we simply try to master urban sprawl? Our main objective being in fine to determine the directions and urban con-tents of public policies aiming at regulating urban sprawl, to validate the feasibility of these principles and to define the conditions of their implementation in the case of one agglomeration. Once the Lausanne agglomeration had been chosen as experimentation field, three complementary approaches proved to be essential to this study: 1. a theoretical approach aiming at definying an interdisciplinary conceptual framework of the ur-ban phenomenon in its relation to sustainable development linking urban dynamics - urban form - sustainable development ; 2. a methodological approach proposing simple and effective tools for analyzing and describing new urban morphologies for a better management of the urban environment and of urban planning practices 3. a pragmatic approach aiming at deepening reflection on urban sprawl by switching from a descriptive approach of the consequences of the new urban dynamics to an operational approach, aiming at identifying possible avenues of action respecting the principles of sustainable development. This analysis approach provided us with three major results, allowing us to define a strategy to cur-tail urban sprawl. First, if densification is accepted as a strategic objective of urban planning, the model of the dense city can not be applied without taking into consideration other urban planning objectives. Densification does not suffice to reduce the ecological impact of the city and improve the quality of life of its dwellers. The search for a more sustainable urban form depends on a multitude of factors and effects of synergy. Reducing the negative effects of urban sprawl requires the implementation of integrated and concerted urban policies, like for example encouraging densification qualified as resulting from a finalized process, integrating and developing collective forms of transportation and even more so the pedestrian metric with urban planning, integrating diversity on a systematic basis through the physical and social dimensions of the territory. Second, the future of such sprawling territories is not fixed. Our research on the ground revea-led an evolution in the modes of habitat related to ways of life, work organization and mobility that suggest the possibility of the return of a part of the population to the center of cities (end of the rule of the model of the individual home). Thus, the diagnosis and the search for effective and sustainable solutions can not be conceived of independently of the needs of the inhabitants and of the behavior of the actors behind the production of the built territory. In this perspective, any urban program must necessarily be based upon the knowledge of the population's wishes. Third, the successful implementation of a global policy of control of urban sprawl's negative effects is highly influenced by the adaptation of property offer to the demand of new habitat models satisfying both the necessity of urbanization cost controls (economical, social, environ-mental) and people's emerging aspirations. These results allowed us to define a strategy to cur-tail urban sprawl. Its feasibility and conditions of implementation were tested on the territory of the Lausanne agglomeration.

Financement des hôpitaux par APDRG versus financement des hôpitaux par tarif journalier : effets sur les assureurs maladie, en fonction de la structure de leur portefeuille, selon l'âge et le sexe

Une abondante littérature existe sur le financement des hôpitaux selon les DRG ou selon le prix de journée. Le but de la présente communication est d'analyser, dans le cadre de l'introduction des tarifs par APDRG en Suisse, les effets d'un changement dans le financement des hôpitaux sur les assureurs maladie, en fonction de la structure de leur portefeuille, selon l'âge et le sexe. S'est posée plus précisément la question de savoir si le fait de passer d'un remboursement à la journée à un remboursement par DRG aurait un effet sur les charges des assureurs qui ont une clientèle plus âgée que la moyenne ou une clientèle majoritairement féminine. [Préambule p. 1]

Jean-Baptiste Perronneau (ca. 1715-1783). Un portraitiste dans l'Europe des Lumières

Les monographies consacrées à Jean-Baptiste Perronneau (ca 1715-1783) à la fin du XIXe siècle et au début du XXe siècle traduisaient l'engouement pour l'art du XVIIIesiècle qui se déployait dans le Tout Paris de la Belle Époque. Elles rendaient justice au peintre de l'Académie royale de peinture et de sculpture de Paris, et à l'un des peintres favoris des contemporains des Impressionnistes qu'elles présentaient comme un artiste éclipsé de son vivant par son prestigieux aîné, Maurice Quentin Delatour (1704-1788). La première partie de la thèse étudie la carrière parisienne du peintre, ses appuis artistiques et sociaux, ses pratiques au pastel et à l'huile, de l'agrément en 1746 à la réception en 1753 et avant le début de la période des voyages en 1756. La rivalité avec Delatour, mise en scène dans un esprit d'émulation au Salon du Louvre pendant plus de vingt ans, y est largement évoquée. Un même nombre de portraits exposés fait comprendre que Perronneau avait de son vivant la faveur des artistes et du public. Il permet de mesurer les effets de la rivalité avec le peintre de Cour sur sa carrière. Delatour faisait exposer en 1750 son autoportrait à côté de son portrait demandé à Perronneau. Les qualités des deux peintres étaient comparées par la nouvelle critique. Notre étude s'attache à ce qui les rapproche comme à ce qui les sépare. Dans la deuxième partie, les peintres des milieux artistiques qu'il fréquente, Louis Tocqué, Jean-Baptiste Oudry, Charles Nicolas Cochin, pour citer les principaux, sont convoqués pour évaluer l'art de Perronneau dans ce que Cochin appelle la « ressemblance savante ». Les peintres les plus ambitieux s'attachent à son interprétation malgré les difficultés dues aux réactions de leur clientèle. La façon dont procède Perronneau est ici envisagée suivant deux aspects : d'une part, la composition du portrait selon une idée du naturel qui détermine l'attitude et une certaine imitation des défauts ; d'autre part, l'imitation de la nature qui réside dans les qualités de l'art, et donc picturales, appréciées des amateurs avertis. La façon qui lui est propre est de composer un naturel selon des poses variées, fondé sur la noblesse de l'attitude conjuguée à la simplicité, conformément à l'idéal courtois en vigueur depuis le XVIe siècle ; elle reste immuable au long de sa carrière. Dans l'imitation de la nature, sont mis en évidence des aspects cachés du faire lors de la mise en place du relief de la figure, les références aux maîtres anciens, Rembrandt, Van Dyck, la conscience de la distance à laquelle le tableau doit être vu, qui atténue la vigueur de la touche, comme le fait le verre qui sert aussi de vernis au pastel. L'idée de sprezzatura qui régit la distinction légère de la pose se décèle à la surface de ses portraits à travers l'apparence de facilité qu'il s'attache à leur donner, et jusque dans l'inimitable retouche finale. Grâce à la qualité de sa retouche, Perronneau accroît sensiblement dans certaines oeuvres à partir de 1768 l'expression savante et inventive de son sentiment. Afin de peindre comme il l'entend tout en gagnant sa vie et celle de sa famille, le peintre prend le parti de voyager comme l'y autorisait la libéralité de son statut. Dans la troisième partie est étudiée la trame de ses voyages que constituent les recommandations dont il bénéficie. Les identités des quatre cent dix modèles peints en France et en Europe de 1740 à 1782 sont systématiquement étudiées dans le catalogue ainsi que les conditions de leur rencontre avec le peintre. Elles décrivent une clientèle variée représentative de la mobilité des statuts dans l'Europe d'ancien Régime dont la composante nouvelle est la clientèle du monde de la banque internationale et du grand commerce. Leurs portraits peints à l'étranger ou dans les villes de Province que Perronneau présente au Salon irritent et inquiètent l'élite parisienne et donne lieu à de nouvelles tensions avec l'éternel rival, Delatour, au Salon de 1767. Perronneau se sent à juste titre évincé de Paris. Alors que l'on avait pu penser qu'il avait peu souffert des critiques du philosophe qui ne furent publiées qu'après sa mort, il apparaît que sa réputation pâtit de ses jugements diffusés par les nouvelles à la main au-delà des frontières et jusqu'auprès de la prestigieuse clientèle qui lui était acquise. Le travail sur son la carrière et l'oeuvre de Perronneau permet surtout une compréhension nouvelle de l'art du portrait au milieu du siècle, au moment où la représentation individuelle n'a jamais encore touché un aussi large public et où l'Académie ambitionne d'élever cet art au plus haut degré.

Etalonnage de trois épreuves de recognition continue : Effets de l'âge, du sexe et du niveau socio-professionnel sur les mesures de discrimination et de biais de réponse. [Standardization of three continuous recognition test forms - Effects of age, sex and socio-economic level on measurements of discrimination and response bias.]

Nous présontons l'étalonnage d'un test mnésique de recognition dans un échantillon de 180 adultes francophones de la Suisse Romande. Le test comprend trois formes utilisant un matériel verbal (mots) ou non verbal (visages ou paysages). Une attention particulière est accordée à l'âge dans la présentation des résultats. Celui-ci affecte plus précocement et plus intensément la performance aux formes non verbales qu'à la forme verbale du test. Il induit également une importante augmentation du nombre de fausses reconnaissances pour les formes non verbales.

Effets des supplémentations en calcium et vitamine D sur la maladie cardiovasculaire. [Effects of calcium and vitamin D supplementations on cardiovascular disease: review article].

Studies exploring the effect of calcium supplementation on cardiovascular risk suggest that systolic blood pressure decreases with supplementation. A lower calcium intake has been associated with an increased risk of stroke. By contrast, calcium supplementation may increase the risk of myocardial infarction. The effect of vitamin D supplementation on blood pressure is still unclear and no effect of vitamin D supplementation on coronary heart disease or stroke has been clearly demonstrated. There is a lack of randomized clinical trials primarily addressing the effect of these parameters on CVD. Currently, the use of calcium and vitamin D supplementations for the prevention of cardiovascular disease is not justified.

Design of new tools to improve the efficacy of DNA-damaging drugs used in cancer therapy

Résumé Les tumeurs sont diverses et hétérogènes, mais toutes partagent la capacité de proliférer sans contrôle. Une prolifération dérégulée de cellules couplée à une insensibilité à une réponse apoptotique constitue une condition minimale pour que l'évolution d'une tumeur se produise. Un des traitements les plus utilisés pour traité le cancer à l'heure actuelle sont les chimiothérapies, qui sont fréquemment des composés chimiques qui induisent des dommages dans l'ADN. Les agents anticancéreux sont efficaces seulement quand les cellules tumorales sont plus aisément tuées que le tissu normal environnant. L'efficacité de ces agents est en partie déterminée par leur capacité à induire l'apoptose. Nous avons récemment démontré que la protéine RasGAP est un substrat non conventionnel des caspases parce elle peut induire à la fois des signaux anti et pro-apoptotiques, selon l'ampleur de son clivage par les caspases. A un faible niveau d'activité des caspases, RasGAP est clivé, générant deux fragments (le fragment N et le fragment C). Le fragment N semble être un inhibiteur général de l'apoptose en aval de l'activation des caspases. À des niveaux plus élevés d'activité des caspases, la capacité du fragment N de contrecarrer l'apoptose est supprimée quand il est clivé à nouveau par les caspases. Ce dernier clivage produit deux nouveaux fragments, N 1 et N2, qui contrairement au fragment N sensibilisent efficacement des cellules cancéreuses envers des agents chimiothérapeutiques. Dans cette étude nous avons prouvé qu'un peptide, appelé par la suite TAT-RasGAP317-326, qui est dérivé du fragment N2 de RasGAP et est rendu perméable aux cellules, sensibilise spécifiquement des cellules cancéreuses à trois génotoxines différentes utilisées couramment dans des traitements anticancéreux, et cela dans des modèles in vitro et in vivo. Il est important de noté que ce peptide semble ne pas avoir d'effet sur des cellules non cancéreuses. Nous avons également commencé à caractériser les mécanismes moléculaires expliquant les fonctions de sensibilisation de TAT-RasGAP317-326. Nous avons démontré que le facteur de transcription p53 et une protéine sous son activité transcriptionelle, nommée Puma, sont indispensables pour l'activité de TAT-RasGAP317-326. Nous avons également prouvé que TAT-RasGAP317-326 exige la présence d'une protéine appelée G3BP1, une protéine se liant a RasGAP, pour potentialisé les effets d'agents anticancéreux. Les données obtenues dans cette étude montrent qu'il pourrait être possible d'augmenter l'efficacité des chimiothérapies à l'aide d'un composé capable d'augmenter la sensibilité des tumeurs aux génotoxines et ainsi pourrait permettre de traiter de manière plus efficace des patients sous traitement chimiothérapeutiques. Summary Tumors are diverse and heterogeneous, but all share the ability to proliferate without control. Deregulated cell proliferation coupled with suppressed apoptotic sensitivity constitutes a minimal requirement upon which tumor evolution occurs. One of the most commonly used treatments is chemotherapy, which frequently uses chemical compounds that induce DNA damages. Anticancer agents are effective only when tumors cells are more readily killed than the surrounding normal tissue. The efficacy of these agents is partly determined by their ability to induce apoptosis. We have recently demonstrated that the protein RasGAP is an unconventional caspase substrate because it can induce both anti- and pro-apoptotic signals, depending on the extent of its cleavage by caspases. At low levels of caspase activity, RasGAP is cleaved, generating an N-terminal fragment (fragment N) and a C-terminal fragment (fragment C). Fragment N appears to be a general Mocker of apoptosis downstream of caspase activation. At higher levels of caspase activity, the ability of fragment N to counteract apoptosis is suppressed when it is further cleaved. This latter cleavage event generates two fragments, N1 and N2, which in contrast to fragment N potently sensitizes cancer cells toward DNA-damaging agents induced apoptosis. In the present study we show that a cell permeable peptide derived from the N2 fragment of RasGAP, thereafter called TAT-RasGAP317-326, specifically sensitizes cancer cells to three different genotoxins commonly used in chemotherapy in vitro and in vivo models. Importantly this peptide seems not to have any effect on non cancer cells. We have also started to characterize the molecular mechanisms underlying the sensitizing functions of TAT-RasGAP317-326. We have demonstrated that the p53 transcription factor and a protein under its transcriptional activity, called Puma, are required for the activity of TATRasGAP317-326. We have also showed that TAT-RasGAP317-326 requires the presence of a protein called G3BP1, which have been shown to interact with RasGAP, to increase the effect of the DNA-damaging drug cisplatin. The data obtained in this study showed that it is possible to increase the efficacy of current used chemotherapies with a compound able to increase the efficacy of genotoxins which could be beneficial for patients subjected to chemotherapy.

Targeting the JNK signaling pathway potentiates the antiproliferative efficacy of Rapamycin in LS174T colon cancer cells

RésuméLes récentes thérapies anticancéreuses développées visent principalement à inhiber les protéines mutées et responsables de la croissance des cellules cancéreuses. Dans ce contexte, l'inhibition d'une protéine appelée mTOR est une stratégie prometteuse. En effet, mTOR régule la prolifération et la survie cellulaire et mTOR est fréquemment activé dans les cellules tumorales.De nombreuses études ont démontré l'efficacité anti-tumorale d'inhibiteurs de mTOR telle que la rapamycine aussi bien dans des modèles expérimentaux que chez les patients souffrant de cancers. Ces études ont cependant également démontré que l'inhibition de mTOR induit l'activation d'autres protéines cellulaires qui vont induire la prolifération cellulaire et ainsi limiter l'effet anti-tumoral des inhibiteurs de mTOR. En particulier, la rapamycine induit l'activation de la voie de signalisation PI3K/Akt qui joue un rôle prépondérant dans la croissance cellulaire.Dans ce travail, nous avons étudié l'effet de la rapamycine sur une protéine appelée JNK ainsi que le rôle de JNK sur les effets anti-tumoraux de la rapamycine. JNK est une protéine impliquée dans la survie et la prolifération cellulaire. Elle est activée notamment par la voie de signalisation PI3K/Akt. De ce fait, nous avons émis l'hypothèse que la rapamycine induirait l'activation de JNK, réduisant ainsi l'efficacité anti¬tumorale de la rapamycine. En utilisant une lignée cellulaire tumorale (LS174T) dérivée du cancer colorectal, nous avons observé que la rapamycine induisait l'activation de JNK. Nous avons également observé que l'inhibition de JNK par le SP600125, un inhibiteur chimique de JNK, ou par la surexpression d'un dominant négatif de JNK dans les cellules LS174T potentialisait l'effet anti-tumoral de la rapamycine in vitro ainsi que dans un modèle murin de xénogreffe tumorale in vivo.En conclusion, nous avons observé que l'activation de JNK induite par la rapamycine entraine une réduction de l'effet anti-tumoral de cette dernière. Nous proposons ainsi que l'inhibition simultanée de JNK et de mTOR représente une nouvelle option thérapeutique en oncologie qu'il conviendra de confirmer dans d'autres modèles expérimentaux avant d'être testée dans des études cliniques.

Etude des niveaux de concentration d'hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) dans la poussière de bois et des marqueurs biologiques d'effets génotoxiques chez les travailleurs du bois

L'exposition aux poussières de bois est associé à un risque accru d'adénocarcinomes des fosses nasales et des sinus paranasaux (SNC, 'Sinonasal cancer') chez les travailleurs du bois. Les poussières de bois sont ainsi reconnues comme cancérogènes avérés pour l'homme par le Centre international de Recherche sur le Cancer (CIRC). Toutefois, l'agent causal spécifique et le mécanisme sous-jacent relatifs au cancer lié aux poussières de bois demeurent inconnus. Une possible explication est une co-exposition aux poussières de bois et aux Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP), ces derniers étant potentiellement cancérogènes. Dans les faits, les travailleurs du bois sont non seulement exposés aux poussières de bois naturel, mais également à celles générées lors d'opérations effectuées à l'aide de machines (ponceuses, scies électriques, etc.) sur des finitions de bois (bois traités) ou sur des bois composites, tels que le mélaminé et les panneaux de fibres à densité moyenne (MDF, 'Medium Density Fiberboard'). Des HAP peuvent en effet être générés par la chaleur produite par l'utilisation de ces machines sur la surface du bois. Les principaux objectifs de cette thèse sont les suivants: (1) quantifier HAP qui sont présents dans les poussières générées lors de diverses opérations courantes effectuées sur différents bois (2) quantifier l'exposition individuelle aux poussières de bois et aux HAP chez les travailleurs, et (3) évaluer les effets génotoxiques (dommages au niveau de l'ADN et des chromosomes) due à l'exposition aux poussières de bois et aux HAP. Cette thèse est composée par une étude en laboratoire (objectif 1) et par une étude de terrain (objectifs 2 et 3). Pour l'étude en laboratoire, nous avons collecté des poussières de différents type de bois (sapin, MDF, hêtre, sipo, chêne, bois mélaminé) générées au cours de différentes opérations (comme le ponçage et le sciage), et ceci dans une chambre expérimentale et dans des conditions contrôlées. Ensuite, pour l'étude de terrain, nous avons suivi, dans le cadre de leur activité professionnelle, 31 travailleurs de sexe masculin (travailleurs du bois et ébenistes) exposés aux poussières de bois pendant deux jours de travail consécutifs. Nous avons également recruté, comme groupe de contrôle, 19 travailleurs non exposés. Pour effectuer une biosurveillance, nous avons collecté des échantillons de sang et des échantillons de cellules nasales et buccales pour chacun des participants. Ces derniers ont également rempli un questionnaire comprenant des données démographiques, ainsi que sur leur style de vie et sur leur exposition professionnelle. Pour les travailleurs du bois, un échantillonnage individuel de poussière a été effectué sur chaque sujet à l'aide d'une cassette fermée, puis nous avons évalué leur exposition à la poussière de bois et aux HAP, respectivement par mesure gravimétrique et par Chromatographie en phase gazeuse combinée à la spectrométrie de masse. L'évaluation des dommages induits à l'ADN et aux chromosomes (génotoxicité) a été, elle, effectuée à l'aide du test des micronoyaux (MN) sur les cellules nasales et buccales et à l'aide du test des comètes sur les échantillons de sang. Nos résultats montrent dans la poussière de la totalité des 6 types de bois étudiés la présence de HAP (dont certains sont cancérogènes). Des différences notoires dans les concentrations ont été néanmoins constatées en fonction du matériau étudié : les concentrations allant de 0,24 ppm pour la poussière de MDF à 7.95 ppm pour le mélaminé. Nos résultats montrent également que les travailleurs ont été exposés individuellement à de faibles concentrations de HAP (de 37,5 à 119,8 ng m-3) durant les opérations de travail du bois, alors que les concentrations de poussières inhalables étaient relativement élevés (moyenne géométrique de 2,8 mg m-3). En ce qui concerne la génotoxicité, les travailleurs exposés à la poussière de bois présentent une fréquence significativement plus élevée en MN dans les cellules nasales et buccales que les travailleurs du groupe témoin : un odds ratio de 3.1 a été obtenu pour les cellules nasales (IC 95% : de 1.8 à 5.1) et un odds ratio de 1,8 pour les cellules buccales (IC 95% : de 1.3 à 2.4). En outre, le test des comètes a montré que les travailleurs qui ont déclaré être exposés aux poussières de MDF et/ou de mélaminé avaient des dommages à l'ADN significativement plus élevés que les deux travailleurs exposés à la poussière de bois naturel (sapin, épicéa, hêtre, chêne) et que les travailleurs du groupe témoin (p <.01). Enfin, la fréquence des MN dans les cellules nasales et buccales augmentent avec les années d'exposition aux poussières de bois. Par contre, il n'y a pas de relation dose-réponse concernant la génotoxicité due à l'exposition journalière à la poussière et aux HAP. Cette étude montre qu'une exposition aux HAP eu bien lieu lors des opérations de travail du bois. Les travailleurs exposés aux poussières de bois, et donc aux HAP, courent un risque plus élevé (génotoxicité) par rapport au groupe témoin. Étant donné que certains des HAP détectés sont reconnus potentiellement cancérogènes, il est envisageable que les HAP générés au cours du travail sur les matériaux de bois sont un des agents responsables de la génotoxicité de la poussière de bois et du risque élevé de SNC observé chez les travailleurs du secteur. Etant donné la corrélation entre augmentation de la fréquence des MN, le test des micronoyaux dans les cellules nasales et buccales constitue sans conteste un futur outil pour la biosurveillance et pour la détection précoce du risque de SNC chez les travailleurs. - Exposures to wood dust have been associated with an elevated risk of adenocarcinomas of the Dasal cavity and the paranasal sinuses (sinonasal cancer or SNC) among wood workers. Wood dust is recognized as a human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. However, the specific cancer causative agent(s) and the mechanism(s) behind wood dust related carcinogenesis remains unknown. One possible explanation is a co-exposure to wood dust and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), the latter being carcinogenic. In addition, wood workers are not only exposed to natural wood but also to wood finishes and composite woods such as wood melamine and medium density fiber (MDF) boards during the manipulation with power tools. The heat produced by the use of power tools can cause the generation of PAH from wood materials. The main objectives of the present thesis are to: (1) quantify possible PAH concentrations in wood dust generated during various common woodworking operations using different wood materials; (2) quantify personal wood dust concentrations and PAH exposures among wood workers; and (3) assess genotoxic effects (i.e., DNA and chromosomal damage) of wood dust and PAH exposure in wood workers. This thesis is composed by a laboratory study (objective 1) and a field study (objectives 2 and 3). In the laboratory study we collected wood dust from different wood materials (fir, MDF, beech, mahagany, oak, and wood melamine) generated during different wood operations (e.g., sanding and sawing) in an experimental chamber under controlled conditions. In the following field study, we monitored 31 male wood workers (furniture and construction workers) exposed to wood dust during their professional activity for two consecutive work shifts. Additionally, we recruited 19 non exposed workers as a control group. We collected from each participant blood samples, and nasal and buccal cell samples. They answered a questionnaire including demographic and life-style data and occupational exposure (current and past). Personal wood dust samples were collected using a closed-face cassette. We used gravimetrie analysis to determine the personal wood dust concentrations and capillary gas chromatography - mass spectrometry analysis to determine PAH concentrations. Genotoxicity was assessed with the micronucleus (MN) assay for nasal and buccal cells and with the comet assay for blood samples. Our results show that PAH (some of them carcinogenic) were present in dust from all six wood materials tested, yet at different concentrations depending on the material. The highest concentration was found in dust from wood melamine (7.95 ppm) and the lowest in MDF (0.24 ppm). Our results also show that workers were individually exposed to low concentrations of PAHs (37.5-119.8 ng m"3) during wood working operations, whereas the concentrations of inhalable dust were relatively high (geometric mean 2.8 mg m"3). Concerning the genotoxicity, wood workers had a significantly higher MN frequency in nasal and buccal cells than the workers in the control group (odds ratio for nasal cells 3.1 (95%CI 1.8-5.1) and buccal cells 1.8 (95%CI 1.3-2.4)). Furthermore, the comet assay showed that workers who reported to be exposed to dust from wooden boards (MDF and wood melamine) had significantly higher DNA damage than both the workers exposed to natural woods (fir, spruce, beech, oak) and the workers in the control group (p < 0.01). Finally, MN frequency in nasal and buccal cells increased with increasing years of exposure to wood dust. However, there was no genotoxic dose-response relationship with the per present day wood dust and PAH exposure. This study shows that PAH exposure occurred during wood working operations. Workers exposed to wood dust, and thus to PAH, had a higher risk for genotoxicity compared to the control group. Since some of the detected PAH are potentially carcinogenic, PAH generated from operations on wood materials may be one of the causative agents for the observed increased genotoxicity in wood workers. Since increased genotoxicity is manifested in an increased MN frequency, the MN assay in nasal and buccal cells may become a relevant biomonitoring tool in the future for early detection of SNC risk.

Mechanisms underlying functional recovery after in vivo focal cerebral ischemia : from preconditioning to diffusion MRI

Version abregée L'ischémie cérébrale est la troisième cause de mort dans les pays développés, et la maladie responsable des plus sérieux handicaps neurologiques. La compréhension des bases moléculaires et anatomiques de la récupération fonctionnelle après l'ischémie cérébrale est donc extrêmement importante et représente un domaine d'intérêt crucial pour la recherche fondamentale et clinique. Durant les deux dernières décennies, les chercheurs ont tenté de combattre les effets nocifs de l'ischémie cérébrale à l'aide de substances exogènes qui, bien que testées avec succès dans le domaine expérimental, ont montré un effet contradictoire dans l'application clinique. Une approche différente mais complémentaire est de stimuler des mécanismes intrinsèques de neuroprotection en utilisant le «modèle de préconditionnement» : une brève insulte protège contre des épisodes d'ischémie plus sévères à travers la stimulation de voies de signalisation endogènes qui augmentent la résistance à l'ischémie. Cette approche peut offrir des éléments importants pour clarifier les mécanismes endogènes de neuroprotection et fournir de nouvelles stratégies pour rendre les neurones et la glie plus résistants à l'attaque ischémique cérébrale. Dans un premier temps, nous avons donc étudié les mécanismes de neuroprotection intrinsèques stimulés par la thrombine, un neuroprotecteur «préconditionnant» dont on a montré, à l'aide de modèles expérimentaux in vitro et in vivo, qu'il réduit la mort neuronale. En appliquant une technique de microchirurgie pour induire une ischémie cérébrale transitoire chez la souris, nous avons montré que la thrombine peut stimuler les voies de signalisation intracellulaire médiées par MAPK et JNK par une approche moléculaire et l'analyse in vivo d'un inhibiteur spécifique de JNK (L JNK) .Nous avons également étudié l'impact de la thrombine sur la récupération fonctionnelle après une attaque et avons pu démontrer que ces mécanismes moléculaires peuvent améliorer la récupération motrice. La deuxième partie de cette étude des mécanismes de récupération après ischémie cérébrale est basée sur l'investigation des bases anatomiques de la plasticité des connections cérébrales, soit dans le modèle animal d'ischémie transitoire, soit chez l'homme. Selon des résultats précédemment publiés par divers groupes ,nous savons que des mécanismes de plasticité aboutissant à des degrés divers de récupération fonctionnelle sont mis enjeu après une lésion ischémique. Le résultat de cette réorganisation est une nouvelle architecture fonctionnelle et structurelle, qui varie individuellement selon l'anatomie de la lésion, l'âge du sujet et la chronicité de la lésion. Le succès de toute intervention thérapeutique dépendra donc de son interaction avec la nouvelle architecture anatomique. Pour cette raison, nous avons appliqué deux techniques de diffusion en résonance magnétique qui permettent de détecter les changements de microstructure cérébrale et de connexions anatomiques suite à une attaque : IRM par tenseur de diffusion (DT-IR1V) et IRM par spectre de diffusion (DSIRM). Grâce à la DT-IRM hautement sophistiquée, nous avons pu effectuer une étude de follow-up à long terme chez des souris ayant subi une ischémie cérébrale transitoire, qui a mis en évidence que les changements microstructurels dans l'infarctus ainsi que la modification des voies anatomiques sont corrélés à la récupération fonctionnelle. De plus, nous avons observé une réorganisation axonale dans des aires où l'on détecte une augmentation d'expression d'une protéine de plasticité exprimée dans le cône de croissance des axones (GAP-43). En appliquant la même technique, nous avons également effectué deux études, rétrospective et prospective, qui ont montré comment des paramètres obtenus avec DT-IRM peuvent monitorer la rapidité de récupération et mettre en évidence un changement structurel dans les voies impliquées dans les manifestations cliniques. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons décrit la manière dont la DS-IRM peut être appliquée dans le domaine expérimental et clinique pour étudier la plasticité cérébrale après ischémie. Abstract Ischemic stroke is the third leading cause of death in developed countries and the disease responsible for the most serious long-term neurological disability. Understanding molecular and anatomical basis of stroke recovery is, therefore, extremely important and represents a major field of interest for basic and clinical research. Over the past 2 decades, much attention has focused on counteracting noxious effect of the ischemic insult with exogenous substances (oxygen radical scavengers, AMPA and NMDA receptor antagonists, MMP inhibitors etc) which were successfully tested in the experimental field -but which turned out to have controversial effects in clinical trials. A different but complementary approach to address ischemia pathophysiology and treatment options is to stimulate and investigate intrinsic mechanisms of neuroprotection using the "preconditioning effect": applying a brief insult protects against subsequent prolonged and detrimental ischemic episodes, by up-regulating powerful endogenous pathways that increase resistance to injury. We believe that this approach might offer an important insight into the molecular mechanisms responsible for endogenous neuroprotection. In addition, results from preconditioning model experiment may provide new strategies for making brain cells "naturally" more resistant to ischemic injury and accelerate their rate of functional recovery. In the first part of this work, we investigated down-stream mechanisms of neuroprotection induced by thrombin, a well known neuroprotectant which has been demonstrated to reduce stroke-induced cell death in vitro and in vivo experimental models. Using microsurgery to induce transient brain ischemia in mice, we showed that thrombin can stimulate both MAPK and JNK intracellular pathways through a molecular biology approach and an in vivo analysis of a specific kinase inhibitor (L JNK1). We also studied thrombin's impact on functional recovery demonstrating that these molecular mechanisms could enhance post-stroke motor outcome. The second part of this study is based on investigating the anatomical basis underlying connectivity remodeling, leading to functional improvement after stroke. To do this, we used both a mouse model of experimental ischemia and human subjects with stroke. It is known from previous data published in literature, that the brain adapts to damage in a way that attempts to preserve motor function. The result of this reorganization is a new functional and structural architecture, which will vary from patient to patient depending on the anatomy of the damage, the biological age of the patient and the chronicity of the lesion. The success of any given therapeutic intervention will depend on how well it interacts with this new architecture. For this reason, we applied diffusion magnetic resonance techniques able to detect micro-structural and connectivity changes following an ischemic lesion: diffusion tensor MRI (DT-MRI) and diffusion spectrum MRI (DS-MRI). Using DT-MRI, we performed along-term follow up study of stroke mice which showed how diffusion changes in the stroke region and fiber tract remodeling is correlating with stroke recovery. In addition, axonal reorganization is shown in areas of increased plasticity related protein expression (GAP 43, growth axonal cone related protein). Applying the same technique, we then performed a retrospective and a prospective study in humans demonstrating how specific DTI parameters could help to monitor the speed of recovery and show longitudinal changes in damaged tracts involved in clinical symptoms. Finally, in the last part of this study we showed how DS-MRI could be applied both to experimental and human stroke and which perspectives it can open to further investigate post stroke plasticity.

Effets néonataux du labétalol (Trandate ®) administré en prénatal lors d'hypertension artérielle maternelle

L'hypertension artérielle touche 5 à 10 % des femmes enceintes. Afin de prévenir les¦complications d'une pression sanguine trop élevée, des médicaments antihypertenseurs tel¦que le labétalol (bétabloquant) peuvent être administrés en cours de grossesse. Ces¦médicaments traversent tous, sans exception, la barrière foeto-placentaire. En ce qui¦concerne le labétalol, 30 à 50% de la concentration dans le sang maternel se retrouve dans¦le sang du cordon ombilical.¦Le principal objectif de cette étude rétrospective consiste à déterminer s'il existe une¦corrélation entre une éventuelle imprégnation du nouveau-né par du labétalol administré en¦prénatal et son adaptation à la naissance et durant les 96 premières heures de vie.¦Pour ce faire, une liste de 268 patientes, suivies par le service de gynécologie-obstétrique du¦CHUV sur une période allant du 01.01.2008 au 31.12.2009, a été établie à partir des motsclés¦hypertension artérielle et/ou pré-éclampsie comme diagnostic.¦Parmi ces 268 patientes, ont été retenues pour l'étude uniquement celles ayant reçu du¦labétalol durant les 4 derniers jours de leur grossesse. Cela concerne 38 patientes (14.2%)¦dont 3 d'entre elles ont eu une grossesse gémellaire. Par conséquent, cela représente un¦collectif de 41 nouveau-nés. Afin d'évaluer l'adaptation du nouveau-né à la naissance et¦durant les 96 premières heures de vie, différents paramètres ont été retenus parmi lesquels¦le besoin d'une hospitalisation dans le service de néonatologie, la fréquence cardiaque, la¦fréquence respiratoire, la tension artérielle ainsi que la glycémie. Pour écarter toute influence¦de la prématurité ou d'un poids de naissance trop bas sur l'adaptation néonatale, quatre¦groupes ont été constitués.¦Finalement, une analyse relative à la dose de labétalol a été abordée dans le but de¦déterminer une dose seuil à partir de laquelle l'adaptation du nouveau-né, imprégné par le¦labétalol serait plus difficile.