Characterization and functional identification of a novel plant extradiol 4,5-dioxygenase involved in betalain pigment biosynthesis in Portulaca Grandiflora

RESUME Les bétalaïnes sont des pigments chromo-alcaloïdes violets et jaunes présents dans les plantes appartenant à l'ordre des Caryophyllales et dans les champignons des genres Amanita et Hygrocybe. Leur courte voie de biosynthèse est élucidée chimiquement depuis de nombreuses années, mais les enzymes impliquées dans cette biosynthèse chez les plantes ne sont toujours pas caractérisées. L'enzyme de la DOPA-dioxygénase d' Amanita muscaria a été identifiée (Girod et Zryd, 1991a), mais de nombreuses tentatives d'isolation d'un homologue chez les plantes ont échoué. Afin d'isoler les gènes spécifiques des bétalaïnes chez les plantes, nous avons construit des banques soustraites d'ADNc à partir d'ARN total de pétales immatures de Portulaca grandiflora (Pg) de génotypes jaunes et blancs, respectivement violets et blancs. Les clones couleur- spécifiques ont été détectés en premier par analyse Northem du RNA de pétales blancs et colorés. Les candidats positifs ont alors été soumis à une analyse de transcription au niveau des tiges colorées, vertes et des feuilles, afin d'établir leur expression spécifique. Deux ARNs messagers complets ont une expression corrélée avec l'accumulation des bétalaïnes dans les tissus. Le premier de ces clones, A.16, code pour une oxydase de l'acyl-Coenzyme A (ACX) putative, mais le domaine de liaison du FAD essentiel pour l'activité d'ACX est absent. Toutes nos tentatives pour démontrer sa fonction ont échoué. Le rôle de cette protéine dans la voie de synthèse des bétalaïnes reste inconnu. Le deuxième de ces clones spécifique aux bétalaïnes, L.6 (isolé par Zaiko, 2000), a été renommé DODA en raison de son homologie avec le domaine LigB (pfam02900) d'une 4,5-dioxygénase extradiol bactérienne. DODA a été identifié in silico comme une dioxygénase extradiol en raison de la conservation stricte, au niveau de sa séquence peptidique, des résidus catalytiques de LigB et de ceux liant le cofacteur fer. Une analyse de transfert Southem a montré que ce gène est unique dans Pg. L'expression transitoire de DODA par transformation biolistique dans des pétales blancs de Pg a produit des taches violettes ou jaunes dans des cellules transformées. Une analyse HPLC de ces taches a démontré leur identité avec les bétalaïnes présentes naturellement dans les pétales violets et jaunes de Pg, confirmant ainsi la complémentation par le gène Pg DODA de l'allèle récessif cc présent dans les pétales blancs de Pg. Des homologues de DODA (DOPA-dioxygénase) ont été identifiés dans de nombreuses espèces de plantes, y compris dans celles sans bétalaïne. L'alignement de ces homologues a permis l'identification d'un motif spécifique aux bétalaïnes à côté d'une histidine catalytique conservée. Ce motif [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] remplace le motif [H-N-L-R] conservé dans les plantes sans bétalaïne et le motif [H-N-L-x] présent dans tous les homologues bactériens et archaebactériens. Une modélisation tridimensionnelle préliminaire du site actif de Pg DODA et de son homologue dans la mousse Physcomitrella patens a montré l'importance de ce motif spécifique aux bétalaïnes pour l'accessibilité du substrat au site actif. L'analyse phylogénétique de DODA a confirmé l'évolution séparée de cette protéine chez les plantes à bétalaïnes par comparaison avec celle des plantes sans bétalaïne. Nous avons donc conclu que les bétalaïnes sont apparues par modification de l'affinité pour un substrat d'enzymes similaires à DODA, chez un ancêtre unique des Caryophyllales qui a perdu toute capacité de biosynthèse des anthocyanes. Finalement, Pg DODA n'a aucune similarité avec la protéine DODA d' Amanita muscaria, bien que celle-ci complémente aussi la pigmentation des pétales blancs de Pg. La biosynthèse des bétalaïnes est un exemple remarquable de convergence évolutive biochimique indépendante entre espèces de règnes différents. ABSTRACT Betalains are violet and yellow chromo-alkaloid pigments present in plants belonging to the order Caryophyllales and also in the fungal genera Amanita and Hygrocybe. Their short biosynthetic pathway is chemically well understood since many years, but enzymes involved in the plant pathway are still uncharacterized. The DOPA-dioxygenase from Amanita muscaria was identified (Girod and Zryd, 1991a), but numerous attempts to identify a plant homologue to the corresponding gene, failed. In order to isolate betalain-specific genes in plants, subtractive cDNA libraries were built with total RNA from white and yellow and respectively, violet immature petals from Portulaca grandiflora (Pg) genotypes. Colour-specific clones were first detected by Northern blot analysis using RNA from white and coloured petals. Positive candidates were submitted to further transcription analysis in coloured, green stems and leaves in order to assess their specific expression. Two full-length mRNAs showed a correlated expression with betalain accumulation in tissues. One of them, A.16, encodes a putative acyl-Coenzyme A oxidase (ACX), but missing the FAD binding domain essential for the ACX activity. Thus, all attempts to demonstrate its function failed. The role of this protein in the betalain biosynthesis pathway, if any, is still unknown. The second betalain-specific mRNA, L.6 (isolated by Zaiko, 2000) shows a homology with a LigB domain (pfam02900) from a bacterial extradiol 4,5-dioxygenase. It was then renamed DODA (DOPA-dioxygenase). DODA was identified in silico as a highly conserved extradiol dioxygenase due to the strict conservation of its peptidic sequence with LigB catalytic residues and iron-binding cofactor residues. Southern blot analysis showed that this gene is a single copy-gene in Pg. Transient expression of DODA protein through biolistic transformation of Pg white petals produced violet or yellow spots in individual cells. HPLC analysis of these spots showed an identity with betalain pigments present naturally in yellow and violet Pg petals, thus confirming the complementation of the recessive cc allele present in Pg white petals by Pg DODA gene. DODA homologues were identified in numerous plant species including those without betalain. Alignment of these homologues allowed the identification of a betalain-specific pattern beside a highly conserved catalytic histidine. This [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] pattern replaces a [H-N-L-R] pattern strictly conserved in non-betalain plants and a [H-N-L-x] pattern present in all bacterial and archaebacterial homologues. Preliminary three-dimensional modeling of the active site of Pg DODA and its Physcomitrella patens moss homologue revealed the importance of this betalain-specific pattern for the substrate accessibility to the DODA active site. DODA phylogenetic analysis confirmed the separate evolution of this protein in betalain-producing plants. We conclude that betalain pigments appeared in a unique ancestor of the Caryophyllales order in which anthocyanin biosynthetic pathway was impaired, by a modification of enzymes of the DODA family for substrate affinity. The Pg DODA protein has no sequence similarity with Amanita muscaria DODA, despite the fact that they both complement Pg white petals for their pigmentation. Betalain biosynthesis is an interesting example of independent biochemical evolutionary convergence between species from different kingdoms.

Ideal and reality: do countries adopt and follow recommended procedures in comprehensive multiyear planning guidelines for national immunization programmes?

BACKGROUND: Meticulous steps and procedures are proposed in planning guidelines for the development of comprehensive multiyear plans for national immunization programmes. However, we know very little about whether the real-life experience of those who adopt these guidelines involves following these procedures as expected. Are these steps and procedures followed in practice? We examined the adoption and usage of the guidelines in planning national immunization programmes and assessed whether the recommendations in these guidelines are applied as consistently as intended. METHODS: We gathered information from the national comprehensive multiyear plans developed by 77 low-income countries. For each of the 11 components, we examined how each country applied the four recommended steps of situation analysis, problem prioritization, selection of interventions, and selection of indicators. We then conducted an analysis to determine the patterns of alignment of the comprehensive multiyear plans with those four recommended planning steps. RESULTS: Within the first 3 years following publication of the guidelines, 66 (86%) countries used the tool to develop their comprehensive multiyear plans. The funding conditions attached to the use of these guidelines appeared to influence their rapid adoption and usage. Overall, only 33 (43%) countries fully applied all four recommended planning steps of the guidelines. CONCLUSIONS: Adoption and usage of the guidelines for the development of comprehensive multiyear plans for national immunization programmes were rapid. However, our findings show substantial variation between the proposed planning ideals set out in the guidelines and actual use in practice. A better understanding of factors that influence how recommendations in public health guidelines are applied in practice could contribute to improvements in guidelines design. It could also help adjust strategies used to introduce them into public health programmes, with the ultimate goal of a greater health impact.

Impacts des technologies de l'information sur les modes de coordination à travers quatre études en systèmes d'information

L'évolution de l'environnement économique, des chaînes de valeur et des modèles d'affaires des organisations augmentent l'importance de la coordination, qui peut être définie comme la gestion des interdépendances entre des tâches réalisées par des acteurs différents et concourants à un objectif commun. De nombreux moyens sont mis en oeuvre au sein des organisations pour gérer ces interdépendances. A cet égard, les activités de coordination bénéficient massivement de l'appui des technologies de l'information et de communication (TIC) qui sont désormais disséminées, intégrées et connectées sous de multiples formes tant dans l'environnement privé que professionnel. Dans ce travail, nous avons investigué la question de recherche suivante : comment l'ubiquité et l'interconnec- tivité des TIC modifient-elles les modes de coordination ? A travers quatre études en systèmes d'information conduites selon une méthodologie design science, nous avons traité cette question à deux niveaux : celui de l'alignement stratégique entre les affaires et les systèmes d'information, où la coordination porte sur les interdépendances entre les activités ; et celui de la réalisation des activités, où la coordination porte sur les interdépendances des interactions individuelles. Au niveau stratégique, nous observons que l'ubiquité et l'interconnectivité permettent de transposer des mécanismes de coordination d'un domaine à un autre. En facilitant différentes formes de coprésence et de visibilité, elles augmentent aussi la proximité dans les situations de coordination asynchrone ou distante. Au niveau des activités, les TIC présentent un très fort potentiel de participation et de proximité pour les acteurs. De telles technologies leur donnent la possibilité d'établir les responsabilités, d'améliorer leur compréhension commune et de prévoir le déroulement et l'intégration des tâches. La contribution principale qui émerge de ces quatre études est que les praticiens peuvent utiliser l'ubiquité et l'interconnectivité des TIC pour permettre aux individus de communi-quer et d'ajuster leurs actions pour définir, atteindre et redéfinir les objectifs du travail commun. -- The evolution of the economic environment and of the value chains and business models of organizations increases the importance of coordination, which can be defined as the management of interdependences between tasks carried out by different actors and con-tributing to a common goal. In organizations, a considerable number of means are put into action in order to manage such interdependencies. In this regard, information and communication technologies (ICT), whose various forms are nowadays disseminated, integrated and connected in both private and professional environments, offer important support to coordination activities. In this work, we have investigated the following research question: how do the ubiquity and the interconnectivity of ICT modify coordination mechanisms? Throughout four information systems studies conducted according to a design science methodology, we have looked into this question at two different levels: the one of strategic alignment between business and information systems strategy, where coordination is about interdependencies between activities; and the one of tasks, where coordination is about interdependencies between individual interactions. At the strategic level, we observe that ubiquity and interconnectivity allow for transposing coordination mechanisms from one field to another. By facilitating various forms of copresence and visibility, they also increase proximity in asynchronous or distant coordination situations. At the tasks level, ICTs offer the actors a very high potential for participation and proximity. Such technologies make it possible to establish accountability, improve common understanding and anticipate the unfolding and integration of tasks. The main contribution emerging from these four studies is that practitioners can use the ubiquity and interconnectivity of ICT in order to allow individuals to communicate and adjust their actions to define, reach and redefine the goals of common work.