Evaluation of molecular, cellular and behavioral consequences of serotonin 1A receptor deletion

In 1998, three different research groups simultaneously reported increased anxiety-related behavior in tests of conflict in their serotonin 1a (5-HT1a) receptor knockout (KO) line with male mice being more severely affected by 5-HT1a receptor deletion than female KO. Similarly, in the hippocampus, we observed increased dendritic complexity in the stratum radiatum of CA1 pyramidal neurons in male but not in female 5-HT1a receptor KO mice. These observations prompted us to investigate gender- dependent differences of 5-HT1a receptor deletion in hippocampal-related behavioral tasks. Testing our mice in anxiety-related paradigms, we reproduced the original studies showing increased anxiety- related behavior in male 5-HT1a receptor KO mice when compared to male WT mice, but no difference between female 5-HT1a receptor KO and WT mice. Similarly, male 5-HT1a receptor KO mice were impaired in association of aversive stimuli fear conditioning paradigms. We argue that increased dendritic complexity and increased synaptic strength of CA3-CA1 synapses in the stratum radiatum impaired proper signal propagation attributed to overactivation of CA1 pyramidal neurons leading to impaired fear memory of male 5-HT1a receptor KO mice. Similar mechanisms in the ventral hippocampus are likely to have contributed to gender-dependent differences in anxiety-related behavior in our and the original studies from 1998. In this study, we started to shed light on the 5-HT1a receptor downstream signaling pathways involved in dendritogenesis of pyramidal neurons during early postnatal development. We could show that NR2B-containing NMDA receptor during development acts downstream of 5-HT1a receptor and is responsible for increased amount of branching in male 5-HT1a receptor KO mice. Conversely, protein and NR2B mRNA expression was increased in 5-HT1a receptor KO mice at P15. Although the exact signaling cascade of 5-HT1a receptor regulating NR2B-containing NMDA receptor has not been determined, CaMKII is a potential downstream effector to influence transportation and removal of NR2B-containing NMDA receptors to and from the synapse. In contrast, Erk1/2 likely acts downstream of NR2B-containing NMDA receptors and was shown to be sufficient to regulate dendritic branching. Moreover, increased NR2B-containing NMDA receptor mediated cell death via excitotoxicity during development and is likely to be involved in reduced survival of adult born neurons in the hippocampus of 5-HT1a receptor KO male. The convergence of 5-HT1a receptor signaling onto NR2B-containing NMDA receptor signaling enables estrogen to interfere with its downstream pathway via G-protein coupled estrogen receptor 1 activation resulting in normalization of branching and behavior in female 5-HT1a receptor mice. In conclusion, our data strongly suggests a hormone- regulated mechanism that by converging on NR2B-containing NMDA receptor signaling is able to normalize morphology of pyramidal neurons and behavior of female 5-HT1a receptor KO mice. Our findings provide a possible explanation for gender-dependent differences in the occurrence of mental disorders with 5-HT1a receptor abnormalities as a strong predisposing factor. -- En 1998, trois équipes de recherche ont décrit un comportement de type anxieux dans des tests de conflit pour leur souris transgéniques avec une délétion du gène pour le récepteur 5-HT1a de la sérotonine. De plus, les trois groupes rapportent un phénotype plus sévère pour le comportement anxieux chez les souris transgéniques mâles que femelles. Dans l'hippocampe, la région avec la densité de récepteur 5-HT1a la plus élevée dans le télencéphale, nous avons observé dans le stratum radiatum une complexité accrue des arborisations dendritiques des neurones pyramidaux du secteur CA1 chez les souris transgénique mâles mais pas chez les femelles. Cette observation nous a encouragés à initier cette étude sur les différences en fonction du genre utilisant les tests comportementaux en rapport avec les fonctions de l'hippocampe chez les souris déficientes pour le récepteur 5-HT1a.Testant nos souris avec des paradigmes associés à l'anxiété, nous avons reproduit les données originales montrant que les souris transgéniques mâles ont un phénotype plus sévère que les souris mâles sauvages, mais qu'aucune différence n'est observée entre les femelles sauvages et transgéniques. De même, les souris mâles déficientes pour le récepteur 5-HT1a sont handicapées dans les tests de conditionnement au stress avec des stimuli aversifs. Nous faisons l'hypothèse que l'augmentation de la complexité de l'arborisation dendritique et l'augmentation de la force du signal synaptique entres les régions CA3 et CA1 de l'hippocampe dans le stratum radiatum perturbe la propagation du signal nerveux qui conduit à l'hyperactivation des neurones du secteur CA1. Ceci conduit à une mémoire de stress altérée chez les souris mâles déficientes pour le récepteur 5-HT1a. Un mécanisme similaire dans l'hippocampe ventral contribue probablement aux différences en fonction du genre dans les tests pour le comportement de type anxieux qui ont été rapportés dans les études originales de 1998. Les mesures de protéine et de mRNA ont mis en évidence une augmentation de l'expression du récepteur NMDA contenant la sous- unité NR2B dans les souris déficientes pour le récepteur 5-HT1a à P15. Dans les cultures organotypiques d'hippocampe, nous avons commencé à disséquer les messagers secondaires à l'activation du récepteur 5-HT1a qui sont impliqués dans la régulation de la croissance dendritique des neurones pyramidaux pendant la période postnatale précoce. Nous avons démontré que les récepteurs NR2B sont en aval de l'activation du récepteur 5-HT1a et qu'ils sont impliqués dans l'accroissement du nombre de dendrites chez la souris mâle déficiente pour le récepteur 5-HT1a. Bien que la cascade de signalisation du récepteur 5-HT1a pour réguler les récepteurs NMDA contenant le NR2B ne soit pas établie, CaMKII est identifié comme un effecteur potentiel pour altérer le transport du récepteur NMDA à la synapse. D'autre part, Erk1/2 est probablement un messager en aval du NR2B du récepteur NMDA, et a été documenté comme suffisant pour réguler l'arborisation dendritique. L'augmentation de NR2B à la synapse des souris déficientes pour le récepteur 5-HT1a peut conduire à une augmentation de l'excitotoxicité dans les cellules. Nous avons observé une augmentation chez la souris déficiente pour le récepteur 5-HT1a de la mort cellulaire dans des tranches d'hippocampe stimulées, ce qui peut être en relation avec la réduction de la survie des neurones générés dans l'hippocampe de la souris mâle transgénique adulte par rapport à la souris mâle sauvage. De plus, la convergence de la signalisation du récepteur 5-HT1a sur la signalisation de la sous-unité NR2B du récepteur NMDA permet à l'oestrogène d'interférer avec sa voie de signalisation du récepteur de l'oestrogène couplé à une protéine G (GPER-1), ceci permettant à l'oestrogène de réduire la taille de l'arborisation des neurones pyramidaux de CA1 chez la femelle de la souris déficiente pour le récepteur 5-HT1a. En conclusion, nos observations suggèrent fortement qu'un mécanisme hormonal convergeant sur la voie de signalisation de la sous-unité NR2B du récepteur NMDA permet la normalisation de l'exubérance des dendrites des neurones CA1 de l'hippocampe et du comportement des souris femelles déficientes pour le récepteur 5-HT1a. Ceci donne une explication possible pour la différence en fonction du genre dans l'apparition de troubles mentaux avec les variations du récepteur 5-HT1a comme facteur de prédisposition important.

The role of the renal mineralocorticoid versus the glucocorticoid receptor in renal sodium and potassium transport

Dans le néphron distal sensible à l'aldostérone, le récepteur aux minéralocorticoïdes (RM) et le récepteur aux glucocorticoids (RG) sont exprimés et peuvent être liés et activés par l'aldostérone et le Cortisol, respectivement. La réabsorption rénale de sodium est principalement contrôlée par le RM. Cependant, des modèles expérimentaux in vitro et in vivo suggèrent que le RG pourrait également jouer un rôle dans le transport rénal du sodium. Afin d'étudier l'implication du RG et/ou du RM exprimés dans les cellules épithéliales adultes dans le transport rénal du sodium, nous avons généré deux modèles de souris, dans lesquelles l'expression du RG (Nr3c1Pax8/LC1) ou du RM (Nr3c2Pax8/LC1) peut être abolie de manière inductible et cela spécifiquement dans les tubules rénaux. Les souris déficientes pour le gène du RM survivent mais développent un phénotype sévère de PHA-1, caractérisé par un retard de croissance, une augmentation des niveaux urinaires de Na+, une diminution de la concentration du Na+ dans le plasma, une hyperkaliémie et une augmentation des niveaux d'aldostérone plasmatique. Ce phénotype empire et devient létal lorsque les souris sont nourries avec une diète déficiente en sodium. Les niveaux d'expression en protéine de NCC, de la forme phosphorylée de NCC et de aENaC sont diminués, alors que l'expression en ARN messager et en protéine du RG est augmentée. Une diète riche en Na+ et pauvre en K+ ne corrige pas la concentration élevée d'aldostérone dans le plasma pour la ramener à des niveaux conformes, mais est suffisante pour corriger la perte de poids et les niveaux anormaux des électrolytes dans le plasma et l'urine. -- In the aldosterone-sensitive distal nephron, both the mineralocorticoid (MR) and the glucocorticoid (GR) receptor are expressed. They can be bound and activated by aldosterone and Cortisol, respectively. Renal Na+ reabsorption is mainly controlled by MR. However, in vitro and in vivo experimental models suggest that GR may play a role in renal Na+ transport. Therefore, to investigate the implication of MR and/or GR in adult epithelial cells in renal sodium transport, we generated inducible renal tubule- specific MR (Nr3c2Pax8/LC1) and GR (Nr3c1Pax8/LC1) knockout mice. MR-deficient mice survived but developed a severe PHA-1 phenotype with failure to thrive, higher urinary Na+, decreased plasma Na+ levels, hyperkalemia and higher levels of plasma aldosterone. This phenotype further worsened and became lethal under a sodium-deficient diet. NCC protein expression and its phosphorylated form, as well as aENaC protein level were downregulated, whereas the mRNA and protein expression of GR was increased. A diet rich in Na+and low in K+ did not normalize plasma aldosterone to control levels, but was sufficient to restore body weight, plasma and urinary electrolytes. Upon switch to a Na+-deficient diet, GR-mutant mice exhibited transient increased urinary Na+ and decreased K+ levels, with transitory higher plasma K+ concentration preceded by a significant increase in plasma aldosterone levels within the 12 hours following diet switch. We found no difference in urinary aldosterone levels, plasma Na+ concentration and plasma corticosterone levels. Moreover, NHE3, NKCC2, NCC

Jasmonic acid and the THO/TREX complex participate in phosphate starvation response

All plants are typically confronted to simultaneous biotic and abiotic stress throughout their life cycle. Low inorganic phosphate (Pi) is the most common nutrient deficiency limiting plant growth in natural and agricultural ecosystems while insect herbivory accounts for major losses in plant productivity and impacts on ecological and evolutionary changes in plant populations. Here we report that plants experiencing Pi deficiency induce the jasmonic acid (JA) pathway and enhance their defence against insect herbivory. The phol mutant is impaired in the translocation of Pi from roots to shoots and shows the typical symptoms associated with Pi deficiency, including high anthocyanin and poor shoot growth. These phol shoot phenotypes were significantly attenuated by blocking the JA biosynthesis or signalling pathways. Wounded phol leaves hyper-accumulated JA in comparison to wild type, leading to increased resistance against the generalist herbivore Spodoptera littoralis. Pi deficiency also triggered enhanced resistance to herbivory in wild-type Arabidopsis as well as tomato and tobacco, revealing that the link between Pi deficiency and JA-mediated herbivory resistance is conserved in a diversity of plants, including crops. We performed a phol suppressor screen to identify new components involved in the adaptation of plants to Pi deficiency. We report that the THO RNA TRANSCRIPTION AND EXPORT (THO/TREX) complex is a crucial component involved in modulating the Pi- deficiency response. Knockout mutants of at least three members of the THO/TREX complex, including TEX1, HPR1, and TH06, can suppress the phol shoot phenotype. Grafting experiments showed that loss of function of TEX1 only in the root was sufficient to suppress the reduced shoot growth phenotype of phol while maintaining low Pi contents. This indicates that TEX1 is involved in a long distance root-to-shoot signalling component of the Pi-deficiency response. We identified a small MYB-like transcription factor, RAD LIKE 3 (RL3), as a potential downstream target of the THO/TREX complex. RL3 expression is induced in phol mutants but attenuated in phol-7 texl-4 double mutants. Identical to knockout mutants of the THO/TREX complex, rl3 mutants can suppress the phol shoot phenotypes. Interestingly, RL3 is induced during Pi deficiency and is described in the literature as likely being mobile. It is therefore a promising new candidate involved in the root-to-shoot Pi-deficiency signalling response. Finally, we report that PHOl and its homologue PH01:H3 are involved in the co-regulation of Pi and zinc (Zn) homeostasis. PH01;H3 is up-regulated in response to Zn deficiency and, like PHOl, is expressed in the root vascular cylinder and localizes to the Golgi when expressed transiently in tobacco cells. The phol;h3 mutant accumulates more Pi as compared to wild-type when grown in Zn-deficient medium, but this increase is abolished in the phol phol;h3 double mutant. These results suggest that PH01;H3 restricts the PHOl-mediated root-to-shoot Pi transfer in responsé to Zn deficiency. Résumé Au cours de leur cycle de vie, toutes les plantes sont généralement confrontées à divers stress biotiques et abiotiques. La carence nutritionnelle la plus fréquente, limitant la croissance des plantes dans les écosystèmes naturels et agricoles, est la faible teneur en phosphate inorganique (Pi). Au niveau des stress biotiques, les insectes herbivores sont responsables de pertes majeures de rendement et ont un impact considérable sur les changements écologiques et évolutifs dans les populations des plantes. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence que les plantes en situation de carence en Pi induisent la voie de l'acide jasmonique (JA) et augmentent leur défense contre les insectes herbivores. Le mutant phol est déficient dans le transport du phosphate des racines aux feuilles et démontre les symptômes typiques associés à la carence, tels que la forte concentration en anthocyane et une faible croissance foliaire. Ces phénotypes du mutant phol sont significativement atténués lors d'un blocage de la voie de la biosynthèse ou des voies de signalisation du JA. La blessure des feuilles induit une hyper-accumulation de JA chez phol, résultant en une augmentation de la résistance contre l'herbivore généraliste Spodoptera littoralis. Outre Arabidopsis, la carence en Pi induit une résistance accrue aux insectes herbivores aussi chez la tomate et le tabac. Cette découverte révèle que le lien entre la carence en Pi et la résistance aux insectes herbivores via le JA est conservé dans différentes espèces végétales, y compris les plantes de grandes cultures. Nous avons effectué un crible du suppresseur de phol afin d'identifier de nouveaux acteurs impliqués dans l'adaptation de la plante à la carence en Pi. Nous rapportons que le complexe nommé THO RNA TRANSCRIPTION AND EXPORT (THO/TREX) est un élément crucial participant à la réponse des feuilles à la carence en Pi. Les mutations d'au moins trois des membres que composent le complexe THO/TREX, incluant TEX1, HPR1 et 77/06, peuvent supprimer le phénotype de phol. Des expériences de greffes ont montré que la perte de fonction de TEX1, seulement dans la racine, est suffisante pour supprimer le phénotype de la croissance réduite des parties aériennes observé chez le mutant phol, tout en maintenant de faibles teneurs en Pi foliaire. Ceci indique que TEX1 est impliqué dans la signalisation longue distance entre les racines et les parties aériennes. Nous avons identifié un petit facteur de transcription proche de la famille des MYB, RAD LIKE 3 (RL3), comme une cible potentielle en aval du complexe THO / TREX. L'expression du gène RL3 est induite dans le mutant phol mais atténuée dans le double mutant phol-7 texl-4. Exactement comme les plantes mutées d'un des membres du complexe THO/TREX, le mutant rl3 peut supprimer le phénotype foliaire de phol. RL3 est induit au cours d'une carence en Pi et est décrit dans la littérature comme étant potentiellement mobile. Par conséquent, il serait un nouveau candidat potentiellement impliqué dans la réponse longue distance entre les racines et les parties aériennes lors d'un déficit en Pi. Enfin, nous reportons que PHOl et son homologue PHOl: H3 sont impliqués dans la co- régulation de l'homéostasie du Pi et du zinc (Zn). PHOl; H3 est sur-exprimé en réponse au déficit en Zn et, comme PHOl, est exprimé dans les tissus vasculaires des racines et se localise dans l'appareil de Golgi lorsqu'il est exprimé de manière transitoire dans des cellules de tabac. Le mutant phol; h3 accumule plus de Pi par rapport aux plantes sauvages lorsqu'il est cultivé sur un milieu déficient en Zn, mais cette augmentation en Pi est abolie dans le double mutant phol phol; h3. Ces résultats suggèrent qu'en réponse à une carence en Zn, PHOl; H3 limite l'action de PHOl et diminue le transfert du Pi des racines aux parties aériennes.

Phenotypical analysis of mice deficient for the channel activating protease CAP2

Channel activating proteases (CAP) are membrane-bound serine proteases that have been identified as in vitro activators of the epithelial sodium channel (ENaC). Two of them are mainly studied in the laboratory. CAP1/Prss8 was previously shown implicated in colonic sodium homeostasis in vivo. In the first part of this thesis, we generated and characterized mice deficient for CAP2/Tmprss4. The mice are healthy and viable, and they do not show any obvious phenotype. We investigated ENaC activity and expression under regular and sodium- deficient diet, and we could demonstrate that CAP2 is not a major regulator of sodium homeostasis in vivo. We next studied whether CAP2 is implicated in potassium homeostasis. We detected a strong gender-dependency when CAP2 knock-out mice were put under a potassium-deficient diet. We showed in male mice an implication of CAP2 in the regulation of the colonic H+, K+- ATPase, and we propose an implication of membrane-associated progesterone receptors and their binding partners, as well as a possible cleavage-mediated glucocorticoid receptor signalling. We studied the possible interaction between CAPI and CAP2 by generating and characterizing two different mouse study groups, displaying different hypomorphic mutations in the CAPI gene, and deficient for CAP2. We demonstrate that balanced expression of CAPI and CAP2 is required for maintainance of skin integrity and for normal placental development. As CAPI knock-out embryos die due to a placental failure, the additional combined deletion of CAP2 resulted in survival until birth. We could evidence that CAPI and CAP2 are implicated in the same signalling pathway as proposed in cancer studies at the level of the placenta, implicating integrin a5, ERK, AKT, E- and N-cadherin. Furthermore, we investigated whether CAPI is implicated in the pathogenesis and susceptibility to experimental chronic colitis in a mutant rat model. By giving CAPI mutant rats Dextran sodium sulfate, we induced chronic inflammation of the colon, and we highlighted the protective role of CAPI at the histopathological and clinical levels. In conclusion, we showed that CAP2 is not a major regulator of ENaC-mediated sodium homeostasis in vivo, but rather a regulator of potassium homeostasis in a gender-dependent manner implicating the colonic H+, K+-ATPase, membrane progesterone receptors, and the glucocorticoid receptor. We have investigated whether CAPI and CAP2 interact at the functional level, and we show that a balanced expression of CAPI and CAP2 is required in the skin, but also in the placenta. Imbalanced expression of CAPI and CAP2 leads to impaired EMT-associated signalling. We have studied whether CAPI is implicated in the pathogenesis and susceptibility to chronic colitis, and we demonstrated the protective role of CAPI in distal colon. -- Les protéases activatrices de canal (CAP) sont des protéases à serine attachées à la membrane qui ont été identifiées comme activateurs in vitro du canal sodique épithélial (ENaC). Deux de ces protéases sont principalement étudiées dans le laboratoire. CAP1/Prss8 a été identifié préalablement comme impliqué dans l'homéostasie du sodium in vivo au niveau du côlon. Dans la première partie de cette thèse, nous avons généré et caractérisé des souris déficientes pour CAP2/Tmprss4. Les souris sont en bonne santé et viables, et elles ne présentent pas de phénotype visible. Nous avons étudié l'activité et l'expression d'ENaC sous diète normale et déficiente en sodium, et nous avons démontré que CAP2 n'est pas un régulateur essentiel de l'homéostasie sodique in vivo. Nous avons ensuite étudié si CAP2 est impliqué dans l'homéostasie du potassium. Nous avons détecté une forte dépendance du sexe lorsque les souris knock-out pour CAP2 étaient placées sous diète déficiente en potassium. Nous avons démontré dans les souris mâles une implication de CAP2 dans la régulation de la H+, K+- ATPase colonique, des récepteurs membranaires à la progestérone et de leur partenaires de liaison, ainsi que dans la possible signalisation médiée par le clivage du récepteur aux glucocorticoïdes. Nous avons étudié l'interaction possible entre CAPI et CAP2 en générant et en caractérisant deux groupes d'étude de souris différents, porteurs de différentes mutations hypomorphiques dans le gène de CAPI, et déficients pour CAP2. Nous avons pu montrer qu'une expression équilibrée de CAPI et CAP2 est requise pour le maintien de l'intégrité de la peau et pour le développement normal du placenta. Les embryons knock-out pour CAPI meurent suite à une défaillance placentaire, et la délétion additionnelle et combinée de CAP2 permet la survie jusqu'à la naissance. Nous supposons que CAPI et CAP2 sont impliqués dans la même voie de signalisation au niveau du placenta que celle proposée dans les études de cancer, impliquant l'intégrine a5, ERK, AKT, E- et N-cadhérine. De plus, nous avons étudié si CAPI est impliqué dans la pathogenèse et la susceptibilité de colite chronique expérimentale dans un modèle de rat mutant. En administrant aux rats mutants pour CAPI du Dextran sodium sulfate, nous avons induit une inflammation chronique du côlon, et nous avons pu mettre en évidence le rôle protecteur de CAPI au niveau histopathologique et au niveau clinique. En conclusion, nous avons démontré que CAP2 n'est pas un régulateur essentiel de l'homéostasie sodique médiée par ENaC in vivo, mais plutôt de l'homéostasie potassique d'une manière dépendante du sexe et impliquant la H+, K+-ATPase colonique, les récepteurs membranaires à la progestérone et le récepteur aux glucocorticoïdes. Nous avons étudié si CAPI et CAP2 interagissent au niveau fonctionnel, et nous avons montré qu'une expression équilibrée entre CAPI et CAP2 est requise dans la peau et le placenta. L'expression déséquilibrée de CAPI et CAP2 mène à une altération de la signalisation associée à l'EMT. Nous avons étudié si CAPI est impliqué dans la pathogenèse et la susceptibilité de colite chronique expérimentale, et nous avons démontré le rôle protecteur de CAPI dans le côlon distal.

Functional impact of genetic variation on gene expression

Numerous links between genetic variants and phenotypes are known and genome-wide association studies dramatically increased the number of genetic variants associated with traits during the last decade. However, how changes in the DNA perturb the molecular mechanisms and impact on the phenotype of an organism remains elusive. Studies suggest that many traitassociated variants are in the non-coding region of the genome and probably act through regulation of gene expression. During my thesis I investigated how genetic variants affect gene expression through gene regulatory mechanisms. The first chapter was a collaborative project with a pharmaceutical company, where we investigated genome-wide copy number variation (CNVs) among Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) used in pharmaceutical studies, and associated them to changes in gene expression. We found substantial copy number variation and identified CNVs linked to tissue-specific expression changes of proximal genes. The second and third chapters focus on genetic variation in humans and its effects on gene regulatory mechanisms and gene expression. The second chapter studies two human trios, where the allelic effects of genetic variation on genome-wide gene expression, protein-DNA binding and chromatin modifications were investigated. We found abundant allele specific activity across all measured molecular phenotypes and show extended coordinated behavior among them. In the third chapter, we investigated the impact of genetic variation on these phenotypes in 47 unrelated individuals. We found that chromatin phenotypes are organized into local variable modules, often linked to genetic variation and gene expression. Our results suggest that chromatin variation emerges as a result of perturbations of cis-regulatory elements by genetic variants, leading to gene expression changes. The work of this thesis provides novel insights into how genetic variation impacts gene expression by perturbing regulatory mechanisms. -- De nombreux liens entre variations génétiques et phénotypes sont connus. Les études d'association pangénomique ont considérablement permis d'augmenter le nombre de variations génétiques associées à des phénotypes au cours de la dernière décennie. Cependant, comprendre comment ces changements perturbent les mécanismes moléculaires et affectent le phénotype d'un organisme nous échappe encore. Des études suggèrent que de nombreuses variations, associées à des phénotypes, sont situées dans les régions non codantes du génome et sont susceptibles d'agir en modifiant la régulation d'expression des gènes. Au cours de ma thèse, j'ai étudié comment les variations génétiques affectent les niveaux d'expression des gènes en perturbant les mécanismes de régulation de leur expression. Le travail présenté dans le premier chapitre est un projet en collaboration avec une société pharmaceutique. Nous avons étudié les variations en nombre de copies (CNV) présentes chez le macaque crabier (Macaca fascicularis) qui est utilisé dans les études pharmaceutiques, et nous les avons associées avec des changements d'expression des gènes. Nous avons découvert qu'il existe une variabilité substantielle du nombre de copies et nous avons identifié des CNVs liées aux changements d'expression des gènes situés dans leur voisinage. Ces associations sont présentes ou absentes de manière spécifique dans certains tissus. Les deuxième et troisième chapitres se concentrent sur les variations génétiques dans les populations humaines et leurs effets sur les mécanismes de régulation des gènes et leur expression. Le premier se penche sur deux trios humains, père, mère, enfant, au sein duquel nous avons étudié les effets alléliques des variations génétiques sur l'expression des gènes, les liaisons protéine-ADN et les modifications de la chromatine. Nous avons découvert que l'activité spécifique des allèles est abondante abonde dans tous ces phénotypes moléculaires et nous avons démontré que ces derniers ont un comportement coordonné entre eux. Dans le second, nous avons examiné l'impact des variations génétiques de ces phénotypes moléculaires chez 47 individus, sans lien de parenté. Nous avons observé que les phénotypes de la chromatine sont organisés en modules locaux, qui sont liés aux variations génétiques et à l'expression des gènes. Nos résultats suggèrent que la variabilité de la chromatine est due à des variations génétiques qui perturbent des éléments cis-régulateurs, et peut conduire à des changements dans l'expression des gènes. Le travail présenté dans cette thèse fournit de nouvelles pistes pour comprendre l'impact des différentes variations génétiques sur l'expression des gènes à travers les mécanismes de régulation.

Redox dysregulation in schizophrenia : effect on myelination of cortical structures and connectivity

Cette thèse traite du rôle qu'un facteur de risque génétique développé chez les patients souffrant de schizophrénie, à savoir un déficit de la synthèse du glutathion, peut jouer dans les anomalies de la connectivité cérébrale trouvées chez ces patients. L'essentiel du travail a été consacré à évaluer la structure de la substance blanche dans l'ensemble du cerveau chez un modèle animal par une méthode similaire à celle utilisée en recherche clinique avec l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Cette approche de translation inverse chez la souris knock-out de glutamate-cystéine ligase modulateur sous-unité (Gclm KO), avait l'objectif d'étudier l'effet des défenses redox déficientes sur le développement des connexions cérébrales, tout en excluant celui des facteurs non liés au génotype. Après avoir établi le protocole de recherche, l'influence d'une manipulation environnementale a également été étudiée. Pour effectuer une analyse statistique fiable des données d'IRM obtenues, nous .avons d'abord créé un atlas du cerveau de la souris afin de l'utiliser comme modèle pour une segmentation précise des différentes régions du cerveau sur les images IRM obtenues in vivo. Les données provenant de chaque région d'intérêt ont ensuite été étudiées séparément. La qualité de cette méthode a été évaluée dans une expérience de simulation pour déduire la puissance statistique réalisable dans chaque région en fonction du nombre d'animaux utilisés. Ces outils d'analyse nous ont permis d'évaluer l'intégrité de la substance blanche dans le cerveau des souris durant le développement grâce à une expérience longitudinale, en utilisant l'imagerie du tenseur de diffusion (DTI). Nous avons ainsi observé des anomalies dans les paramètres dérivés du tenseur (diffusivité et anisotropie) dans la Commissure Antérieure et le Fimbria/Fornix des souris Gclm KO, par rapport aux animaux contrôles. Ces résultats suggèrent une substance blanche endommagée dans ces régions. Dans une expérience électrophysiologique, Pascal Steullet a montré que ces anomalies ont des conséquences fonctionnelles caractérisées par une réduction de la vitesse de conduction dans les fibres nerveuses. Ces données renforcent les conclusions des analyses d'imagerie. Le mécanisme par lequel une dérégulation redox affecte la structure de la substance blanche reste encore à définir, car une analyse immunohistochimique des protéines constituantes de la couche de myéline des fibres concernées n'a pas donné de résultats concluants. Nous avons également constaté un élargissement des ventricules dans les jeunes souris Gclm KO, mais pas chez les adultes et des anomalies neurochimiques déjà connues chez ces animaux (Duarte et al. 2011), à savoir une réduction du Glutathion et une augmentation de l'acide N-acétylaspartique, de l'Alanine et du ratio Glutamine/Glutamate. Nous avons ensuite testé l'effet d'un stress environnemental supplémentaire, l'élevage en isolement social, sur le phénotype. Ce stress n'a eu aucun effet sur la structure de la substance blanche évaluée par DTI, mais a réduit la concentration de myo-Inositol et augmenté le ratio de Glutamine/Glutamate dans le cortex frontal. Nous avons aussi reproduit dans ce groupe indépendant d'animaux les effets du génotype sur le profil neurochimique, sur la taille des ventricules et aussi sur les paramètres dérivés du tenseur de diffusion dans le Fimbria/Fornix, mais pas dans la Commissure Antérieure. Nos résultats montrent qu'une dérégulation redox d'origine génétique perturbe la structure et la fonction de la substance blanche dans des régions spécifiques, causant ainsi l'élargissement des ventricules. Ces phénotypes rassemblent certaines caractéristiques neuro-anatomiques de la schizophrénie, mais les mécanismes qui en sont responsables demeurent encore inconnus. L'isolement social n'a pas d'effet sur la structure de la substance blanche évaluée par DTI, alors qu'il est prouvé qu'il affecte la maturation des oligodendrocytes. La neurochimie corticale et en particulier le rapport Glutamine/Glutamate a été affecté par le dérèglement redox ainsi que par l'isolement social. En conséquence, ce ratio représente un indice prometteur dans la recherche sur l'interaction du stress environnemental avec le déséquilibre redox dans le domaine de la schizophrénie. -- The present doctoral thesis is concerned with the role that a genetic risk factor for the development of schizophrenia, namely a deficit in Glutathione synthesis, may play in the anomalies of brain connectivity found in patients. Most of the effort was devoted to perform a whole-brain assessment of white matter structure in the Glutamate-Cysteine ligase modulatory knockout mouse model (Gclm KO) using Magnetic Resonance Imaging (MRI) techniques similar to those used in state-of-the-art clinical research. Such reverse translational approach taking brain imaging from the bedside to the bench aimed to investigate the role that deficient redox defenses may play in the development of brain connections while excluding all influencing factors beside the genotype. After establishing the protocol, the influence of further environmental manipulations was also studied. Analysis of MRI images acquired in vivo was one of the main challenges of the project. Our strategy consisted in creating an atlas of the mouse brain to use as segmentation guide and then analyze the data from each region of interest separately. The quality of the method was assessed in a simulation experiment by calculating the statistical power achievable in each brain region at different sample sizes. This analysis tool enabled us to assess white matter integrity in the mouse brain along development in a longitudinal experiment using Diffusion Tensor Imaging (DTI). We discovered anomalies in diffusivity parameters derived from the tensor in the Anterior Commissure and Fimbria/Fornix of Gclm KO mice when compared to wild-type animals, which suggest that the structure of these tracts is compromised in the KO mice. In an elegant electrophysiological experiment, Pascal Steullet has provided evidence that these anomalies have functional consequences in form of reduced conduction velocity in the concerned tracts, thus supporting the DTI findings. The mechanism by which redox dysregulation affects WM structure remains unknown, for the immunohistochemical analysis of myelin constituent proteins in the concerned tracts produced inconclusive results. Our experiments also detected an enlargement of the lateral ventricles in young but not adult Gclm KO mice and confirmed neurochemical anomalies already known to affect this animals (Duarte et al. 2011), namely a reduction in Glutathione and an increase in Glutamine/Glutamate ratio, N-acetylaspartate and Alanine. Using the same methods, we tested the effect of an additional environmental stress on the observed phenotype: rearing in social isolation had no effect on white matter structure as assessed by DTI, but it reduced the concentration of myo-Inositol and increased the Glutamine/Glutamate ratio in the frontal cortex. We could also replicate in this separate group of animals the effects of genotype on the frontal neurochemical profile, ventricular size and diffusivity parameters in the Fimbria/Fornix but not in the Anterior Commissure. Our data show that a redox dysregulation of genetic origin may disrupt white matter structure and function in specific tracts and cause a ventricular enlargement, phenotypes that resemble some neuroanatomical features of schizophrenia. The mechanism responsible remains however unknown. We have also demonstrated that environmental stress in form of social isolation does not affect white matter structure as assessed by DTI even though it is known to affect oligodendrocyte maturation. Cortical neurochemistry, and specifically the Glutamine to Glutamate balance was affected both by redox dysregulation and social isolation, and is thus a good target for further research on the interaction of redox imbalance and environmental stress in schizophrenia.

GENETIC ARCHITECTURE, EVOLUTION AND MAINTENANCE OF A COLOR CLINE AT A CONTINENTAL SCALE

On a geological time scale the conditions on earth are very variable and biological patterns (for example the distributions of species) are very dynamic. Understanding large scale patterns of variation observed today thus requires a deep understanding of the historical factors that drove their evolution. In this thesis, we reevaluated the evolution and maintenance of a continental color cline observed in the European barn owl (Tyto alba) using population genetic tools. The colour cline spans from south-est Europe where most individual have pure white underparts to north and east Europe where most individuals have rufous-brown underparts. Our results globally showed that the old scenario, stipulating that the color cline evolved by secondary contact of two color morphs (white and rufous) that evolved in allopatry during the last ice age has to be revised. We collected samples of about 700 barn owls from the Western Palearctic to establish the first population genetic data set for this species. Individuals were genotyped at 22 microsatellites markers, at one mitochondrial gene, and at a candidate color gene. The color of each individuals was assessed and their sex determined by molecular methods. We first showed that the genetic variation in Western Europe is very limited compared to the heritable color variation. We found no evidences of different glacial lineages, and showed that selection must be involved in the maintenance of the color cline (chapter 1). Using computer simulations, we demonstrated that the post-glacial colonization of Europe occurred from the Iberian Peninsula and that the color cline could not have evolved by neutral demographic processes during this colonization (chapter 2). Finally we reevaluated the whole history of the establishment of the Western Palearctic variation of the barn owl (chapter 3): This study showed that all Western European barn owls descend from white barn owls phenotypes from the Middle East that colonized the Iberian Peninsula via North-Africa. Following the end of the last ice age (20'000 years ago), these white barn owls colonized Western Europe and under selection a novel rufous phenotype evolved (during or after the colonization). An important part of the color variation could be explained by a single mutation in the melanocortin-1-receptor (MC1R) gene that appeared during or after the colonization. The colonization of Europe reached until Greece, where the rufous birds encountered white ones (which reached Greece from the Middle East over the Bosporus) in a secondary contact zone. Our analyses show that white and rufous barn owls in Greece interbreed only to a limited extent. This suggests that barn owls are at the verge of becoming two species in Greece and demonstrates that European barn owls represent an incipient ring species around the Mediterranean. The revisited history of the establishment of the European barn owl color cline makes this model system remarkable for several aspects. It is a very clear example of strong local adaptation that can be achieved despite high gene flow (strong color and MC1R differentiation despite almost no neutral genetic differentiation). It also offers a wonderful model system to study the interactions between colonization processes and selection processes which have, for now, been remarkably understudied despite their potentially ubiquitous importance. Finally it represents a very interesting case in the speciation continuum and appeals for further studying the amount of gene flow that occurs between the color morphs in Greece. -- Sur l'échelle des temps géologiques, les conditions sur terre sont très variables et les patrons biologiques (telle que la distribution des espèces) sont très dynamiques. Si l'on veut comprendre des patrons que l'on peut observer à large échelle aujourd'hui, il est nécessaire de d'abord comprendre les facteurs historiques qui ont gouverné leur établissement. Dans cette thèse, nous allons réévaluer, grâce à des outils modernes de génétique des populations, l'évolution et la maintenance d'un cline de couleur continental observé chez l'effraie des clochers européenne (Tyto alba). Globalement, nos résultats montrent que le scenario accepté jusqu'à maintenant, qui stipule que le cline de couleur a évolué à partir du contact secondaire de deux morphes de couleur (blanches et rousses) ayant évolué en allopatrie durant les dernières glaciations, est à revoir. Afin de constituer le premier jeu de données de génétique des populations pour cette espèce, nous avons récolté des échantillons d'environ 700 effraies de l'ouest Paléarctique. Nous avons génotypé tous les individus à 22 loci microsatellites, sur un gène mitochondrial et sur un autre gène participant au déterminisme de la couleur. Nous avons aussi mesuré la couleur de tous les individus et déterminé leur sexe génétiquement. Nous avons tout d'abord pu montrer que la variation génétique neutre est négligeable en comparaison avec la variation héritable de couleur, qu'il n'existe qu'une seule lignée européenne et que de la sélection doit être impliquée dans le maintien du cline de couleur (chapitre 1). Grâce à des simulations informatiques, nous avons démontré que l'ensemble de l'Europe de l'ouest a été recolonisé depuis la Péninsule Ibérique après les dernières glaciations et que le cline de couleur ne peut pas avoir évolué par des processus neutre durant cette colonisation (chapitre 2). Finalement, nous avons réévalué l'ensemble de l'histoire postglaciaire de l'espèce dans l'ouest Paléarctique (chapitre 3): l'ensemble des effraies du Paléarctique descendent d'effraie claire du Moyen-Orient qui ont colonisé la péninsule ibérique en passant par l'Afrique du nord. Après la fin de la dernière glaciation (il y a 20'000 ans), ces effraies claires ont colonisé l'Europe de l'ouest et ont évolués par sélection le phénotype roux (durant ou après la colonisation). Une part importante de la variation de couleur peut être expliquée par une mutation sur le gène MC1R qui est apparue durant ou juste après la colonisation. Cette vague de colonisation s'est poursuivie jusqu'en Grèce où ces effraies rousses ont rencontré dans une zone de contact secondaire des effraies claires (qui sont remontées en Grèce depuis le Moyen-Orient via le Bosphore). Nos analyses montrent que le flux de gènes entre effraies blanches et rousses est limité en Grèce, ce qui suggère qu'elles sont en passe de former deux espèces et ce qui montre que les effraies constituent un exemple naissant de spéciation en anneaux autour de la Méditerranée. L'histoire revisitée des effraies des clochers de l'ouest Paléarctique en fait un système modèle remarquable pour plusieurs aspects. C'est un exemple très claire de forte adaptation locale maintenue malgré un fort flux de gènes (différenciation forte de couleur et sur le gène MC1R malgré presque aucune structure neutre). Il offre également un très bon système pour étudier l'interaction entre colonisation et sélection, un thème ayant été remarquablement peu étudié malgré son importance. Et il offre finalement un cas très intéressant dans le « continuum de spéciation » et il serait très intéressant d'étudier plus en détail l'importance du flux de gènes entre les morphes de couleur en Grèce.

Keeping the balance? Management of oxidative stress, body mass and reproduction under energetic constraints by dispersing and philopatric collared flycatchers.

Dispersal, i.e. individual movement between breeding sites, is a key process for metapopulation dynamics and gene flow. Its success can be modulated by phenotypic differences between dispersing and philopatric individuals, or dispersal syndromes. However, the environmental (external) and physiological (internal) constraints underlying such syndromes remain poorly known. This project aimed at clarifying the impact of environmental variation and oxidative constraints, linked to the reactive oxygen species produced during respiration, on phenotypes associated to dispersal in a passerine bird, the collared flycatcher Ficedula albicollis. Energetic demand was experimentally (i) increased through a wing load manipulation or (ii) relieved through food supplementation. The oxidative balance of breeding flycatchers was influenced by complex interactions of dispersal status and extrinsic factors (breeding density, year, experimental treatments). Interestingly, antioxidant capacity was influenced both by permanent individual differences and by food availability, whereas measures of pro-oxidants were highly variables within individuals. Environmental variation and energetic constraints also modulated the differences in reproduction associated with dispersal: dispersing and philopatric birds differ in their management of the oxidative balance when it is competing with reproductive investment. This thesis highlights that reaction norms, rather than fixed differences, often shape traits associated to dispersal. ----- Le déplacement d'un individu entre sites de reproduction, ou dispersion, est un processus clé pour la dynamique des métapopulations et les flux de gènes. Son succès peut être modulé par des différences de phénotype, ou syndromes de dispersion. Cependant, les contraintes environnementales et physiologiques qui sous-tendent ces syndromes restent mal connues. Ce projet vise à clarifier l'impact des variations environnementales et des contraintes oxydatives (liées aux espèces réactives de l'oxygène produites durant la respiration) sur les phénotypes associés à la dispersion chez un passereau, le gobemouche à collier Ficedula albicollis. La demande énergétique a été expérimentalement (i) augmentée en manipulant la surface alaire ou (ii) diminuée par une supplémentation en nourriture. L'équilibre oxydo-réducteur des gobemouches en reproduction est influencé par des interactions complexes entre statut de dispersion et facteurs extrinsèques (densité de couples reproducteurs, année, traitement expérimental). La capacité antioxydante dépend principalement de différences permanentes entre individus, alors que les pro-oxydants présentent de grandes variations intra-individu. Environnement et contraintes énergétiques modulent aussi les différences de reproduction liées à la dispersion : les oiseaux dispersants et philopatriques diffèrent dans leur gestion de l'équilibre oxydo-réducteur lorsqu'il est en compétition avec l'investissement reproducteur. Ce travail souligne que les traits associés à la dispersion sont souvent déterminés par des normes de réaction à l'environnement et non des différences fixées entre individus.