Long-term prognostic value of single-photon emission computed tomography myocardial perfusion imaging in diabetic patients with and without coronary artery disease

Keywords Diabetes mellitus; coronary artery disease; myocardial ischemia; prognostic value; single-photon emission computed tomography myocardial perfusion imaging Summary Aim: To determine the long-term prognostic value of SPECT myocardial perfusion imaging (MPI) for the occurrence of cardiovascular events in diabetic patients. Methods: SPECT MPI of 210 consecutive Caucasian diabetic patients were analysed using Kaplan-Meier event-free survival curves and independent predictors were determined by Cox multivariate analyses. Results: Follow-up was complete in 200 (95%) patients with a median period of 3.0 years (0.8-5.0). The population was composed of 114 (57%) men, age 65±10 years, 181 (90.5%) type 2 diabetes mellitus, 50 (25%) with a history of coronary artery disease (CAD) and 98 (49%) presenting chest pain prior to MPI. The prevalence of abnormal MPI was 58%. Patients with a normal MPI had neither cardiac death, nor myocardial infarction, independently of a history of coronary artery disease or chest pain. Among the independent predictors of cardiac death and myocardial infarction, the strongest was abnormal MPI (p<.0001), followed by history of CAD (Hazard Ratio (HR)= t 5.9, p=0.0001), diabetic retinopathy (HR=10.0, p=0.001) and inability to exercise (HR=7.7, p=0.02). Patients with normal 1VIPI had a low revascularisation rate of 2.4% during the follow-up period. Compared to normal MPI, cardiovascular events increased 5.2 fold for reversible defects, 8.5 fold for fixed defects and 20.1 fold for the association of both defects. Conclusion: Diabetic patients with normal MPI had an excellent prognosis independently of history of CAD. On the opposite, an abnormal MPI led to a > 5 fold increase in cardiovascular events. This emphasizes the value of SPECT MPI in predicting and risk-stratifying cardiovascular events in diabetic patients. Mots-Clés Diabète; maladie coronarienne; ischémie myocardique; valeur pronostique; tomoscintigraphie myocardique de perfusion par émission monophotonique Résumé Objectifs: Déterminer la valeur pronostique à long terme de la tomoscintigraphie myocardique de perfusion (TSMP) chez les patients diabétiques pour prédire les événements cardiovasculaires (ECV). Méthodes: Etude de 210 diabétiques caucasiens consécutifs référés pour une TSMP. Les courbes de survie ont été déterminées par Kaplan-Meier et les facteurs prédictifs indépendants par analyses multivariées de type Cox. Résultats: Le suivi a été complet chez 200 (95%) patients avec une durée médiane de 3.0 ans (0.8-50). La population était composée de 114 (57%) hommes, âge moyen 65±10 ans, avec 181 (90.5%) diabète de type 2, 50 (25%) antécédents de maladie coronarienne (AMC) et 98 (49%) patients connus pour un angor avant la TSMP. La prévalence de TSMP anormales était de 58%. Aucun décès d'origine cardiaque ou infarctus du myocarde n'est survenu chez les patients avec une TSMP normale, ceci indépendamment de leurs AMC et des douleurs thoraciques. Les facteurs prédictifs indépendants pour les ECV sont une TSMP anormale (p<.0001), les AMC (Hazard Ratio (HR)=15.9, p-0.0001), suivi de la rétinopathie diabétique (HR-10.0, p=0.001) et de l'incapacité à effectuer un exercice (HR=7.7, p=0.02). Les patients avec une TSMP normale ont présenté un taux de revascularisations de 2.4%. La présence de défauts mixtes accroît le risque d'ECV de 20.1 fois, les défauts fixes de 8.5 fois et les défauts réversibles de 5.2 fois comparés aux sujets avec une TSMP normale. Conclusion: Les patients diabétiques, coronariens ou non, avec une tomoscintigraphie myocardique de perfusion normale ont un excellent pronostique. A l'opposé, une TSMP anormale est associée à une augmentation du risque d'ECV de plus de 5 fois. Ceci confirme l'utilité de la TSMP dans la stratification du risque chez les patients diabétiques.

The processing limits the presentation of the melanoma-associated antigen Melan-A in vitro and in vivo

SUMMARY Both proteasomes and additional proteases play an essential role in the generation of most antigenic peptides presented by MHC class I molecules. Therefore, it is of major importance to characterize the mechanisms leading to the production of correct antigenic peptides to improve the design of vaccines. As a model determinant we used the melanoma-associated protein Melan-A, which contains the immunodominant CTL-epitope Melan-A26/27-35/HLA-A*0201 and against which a high frequency of T lymphocytes has been detected in many melanoma patients. In a first part, we have studied the effects of antigen processing on the induction of a specific T cell response in vivo. Our results have shown that the immunoproteasome, expressed in most cells after exposure to Interferon-γ (IFN-γ) and constitutively in some specialized cells such as dendritic cells, does not efficiently process the HLA¬A2-restricted peptide Melan-A26-35. We have produced recombinant lentiviral vectors (rec. 1v) and vaccinia virus (rec. vv) encoding either preprocessed Melan-A26-35(A27L) peptide or full-length Melan-A(A27L). The immunization of HLA-A2/Kb mice with thoses viruses indicates that immunoproteasomes negatively affect the induction of anti-Melan-A T cell responses in animals immunized with vectors coding for the full- length protein. This negative effect was abrogated in HLA-A2/Kb LMP2-/- mice, lacking the immunoproteasomes. Therefore, we can conclude that the expression of immunoproteasomes limits the induction of the anti-Melan-A T cell response. In a second part, we show that the in vitro degradation of a Melan-A26/27-35 precursor by the proteasomes produces both the final antigenic peptide and N-terminally extended intermediates. When human melanoma cells expressing the corresponding fragments were exposed to specific CTL, those expressing the minimal antigenic sequence were recognized more efficiently than those expressing the N-terminally extended intermediates. We demonstrated that the N-terminally extended intermediates were inefficiently trimmed by cytosolic proteases. These results imply that both proteasomes and post-proteasomal peptidases influence the availability of antigenic peptides and that the efficiency of presentation may be affected by conditions that alter the ratio between fully and partially processed proteasomal products. RESUME Le protéasome ainsi que d'autres protéases jouent un rôle essentiel dans l'apprêtement de la plupart des peptides antigéniques présentés par les molécules de MHC classe I. Il est donc particulièrement important de connaître les mécanismes menant à la production du peptide antigénique correct afin de pouvoir mieux définir de futurs vaccins. Nous avons utilisé la protéine associée au mélanome, Melan-A, contenant un épitope immunodominant Melan-A26/27-35/HLA-A*0201 contre lequel une fréquence élevée de lymphocytes T a été detectée dans plusieurs patients atteints de mélanome. Dans une première partie, nous avons étudié les effets de l'apprêtement du peptide antigéniques Melan-A26-35 sur l'induction de cellules T spécifiques dans la souris. Nos résultats ont démontré que l'immunoprotéasome, exprimé dans la plupart des cellules après exposition à de l'IFN-γ et exprimé constitutivement dans certaines cellules spécialisées, telles les cellules dendritiques, n'apprête pas efficacement le peptide antigénique Melan-A26-35 restreint par HLA-A2 in vitro. Nous avons produit des vecteurs lentiviraux recombinants ainsi que des virus vaccinia codant pour le peptide antigénique Melan-A26-35(A27L) et pour la protéine entière Melan-A(A27L). L'immunisation de souris HLA-A2/Kb avec ces virus démontre que l'immunoprotéasome affecte négativement l'induction d'une réponse T contre Melan¬-A dans les souris immunisées avec des virus contenant la séquence de la protéine entière. Cet effet négatif est complètement aboli dans les souris HLA-A2/Kb LMP2-/- qui n'expriment pas l'immunoprotéasome. Deuxièmement, nous avons demontré que la dégradation d'un peptide précurseur contenant Melan-A26/27-35 par le protéasome produit à la fois le peptide antigénique ainsi que des peptides rallongés à leurs extrémités N-terminales. Lorsque ces fragments sont exprimés dans des cellules humaines et exposés à des cellules T cytotoxiques (CTL), celles qui expriment le peptide antigénique final sont reconnus plus efficacement que celles exprimant les peptides rallongés en N-terminus. Nous avons démontré que les peptides rallongés en N-terminus ne sont pas apprêtés efficacement par les peptidases du cytosol. L'inefficacité de l'apprêtement des peptides rallongés dans le cytosol offre un certain avantage pour les peptides directement produits par le protéasome. Ces résultats impliquent donc que le protéasome ainsi que les peptidases post-proteasomales influencent l'accessibilité des peptides antigéniques.

Molecular genetics of rare hereditary diseases via genome-wide and integrated approaches

ABSTRACTThe Online Mendelian Inheritance in Man database (OMIM) reports about 3000 Mendelian diseases of known causal gene and about 2000 that remain to be mapped. These cases are often difficult to solve because of the rareness of the disease, the structure of the family (too big or too small) or the heterogeneity of the phenotype. The goal of this thesis is to explore the current genetic tools, before the advent of ultra high throughput sequencing, and integrate them in the attempt to map the genes behind the four studied cases. In this framework we have studied a small family with a recessive disease, a modifier gene for the penetrance of a dominant mutation, a large extended family with a cardiac phenotype and clinical and/or allelic heterogeneity and we have molecularly analyzed a balanced chromosomal translocation.RESUMELa base de données des maladies à transmission mendélienne, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), contient environ 3000 affections à caractère mendélien pour lesquelles le gène responsable est connu et environ 2000 qui restent à élucider.Les cas restant à résoudre sont souvent difficiles soit par le caractère intrinsèquement rare de ces maladies soit à cause de difficultés structurelles (famille trop petite ou trop étendue) ou hétérogénéité du phénotype ou génétique. Cette thèse s'inscrit avant l'arrivée des nouveaux outils de séquençage à haut débit. Son but est d'explorer les outils génétiques actuels, et de les intégrer pour trouver les gènes impliqués dans quatre cas représentant chacun une situation génétique différente : nous avons étudié une famille de quatre individus avec une transmission récessive, recherché un gène modificateur de la pénétrance de mutations dominantes, étudié une famille étendue présentant un phénotype cardiaque cliniquement et/ou allèliquement hétérogène et nous avons fait l'analyse moléculaire d'une translocation chromosomique balancée.

The role of nonhematopoietic MHC class II expression in immune responses and tolerance

Si les rôles fonctionnels de diverses cellules immunitaires infiltrant des tissus enflammés sont assez bien compris, par contre, étonnamment, on connaît bien moins la capacité des cellules non hématopoïétiques résidant dans des tissus, à moduler l'activité biologique des cellules immunitaires immigrantes, et donc le résultat de la réponse immunitaire. La présentation des antigènes, dans le contexte des molécules du CMH de classe II (CMHII) à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA) professionnelles à une sous- population de lymphocytes T, est cruciale pour le développement des réponses immunitaires protectives spécifiques de l'antigène. En général, l'expression de CMHII est réservée aux CPAs. Toutefois, au cours des pathologies inflammatoires spécifiques d'organe, telles que l'auto-immunité ou la maladie inflammatoire de l'intestin, l'expression de CMHII est également induite par la cytokine interféron (IFN)-y sur des cellules non hématopoïétiques qui résident dans des tissus enflammés. Les conséquences de ce phénomène sont encore peu comprises. Dans cette étude, nous avons utilisé une souche de souris génétiquement modifiées, qui n'a pas la capacité d'induire l'expression de CMHII sur les cellules non hématopoïétiques, mais a maintenu la régulation normale d'expression de CMHII sur les cellules hématopoïétiques. Nous avons appliqué ces souris à différents modèles d'inflammation intestinale et à un modèle de maladie qui imite la maladie auto-immune de l'inflammation du muscle cardiaque (myocardite) chez l'homme. Nous avons pu montrer que, au cours de l'inflammation intestinale, l'expression du CMHII nonhématopoïétique, ou encore l'expression du CMHII par les cellules épithéliales de l'intestin, confère une protection contre la maladie, en réduisant les cellules immunitaires inflammatoires et en augmentant les cellules Τ régulatrices anti-inflammatoires. Ces résultats pourraient expliquer l'échec des traitements d'anti-IFN-γ dans les maladies intestinales inflammatoires chez l'homme. En revanche, dans la myocardite auto-immune, nos résultats indiquent que la présentation d'antigènes par les cellules non hématopoïétiques du coeur est nécessaire pour l'apparition de la pathologie cardiaque, comme nos souris sont résistantes à la maladie. Toutefois, cela n'est pas dû à un défaut d'activation des lymphocytes T, car les lymphocytes Τ des souris mutantes sont parfaitement capables de promouvoir la maladie après le transfert adoptif dans des animaux de type naturel. Nos résultats suggèrent que, durant les maladies inflammatoires spécifiques d'organe, la présentation d'antigène par des cellules non hématopoïétiques module et contribue au résultat de la réponse immunitaire d'une manière opposée, conférant soit la protection contre la maladie ou sa promotion. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à des thérapies qui prennent en compte la contribution de la présentation d'antigènes par les cellules non hématopoïétiques, au cours des maladies inflammatoires spécifiques d'organe. - Les molécules du CMH de classe II (CMHII) sont fondamentales pour la présentation des antigènes aux lymphocytes Τ CD4+, car elles permettent le développement des réponses immunitaires spécifiques de l'antigène. Il est largement admis que l'expression de CMHII est réservée aux cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Cependant, dans des conditions inflammatoires, l'expression de CMHII est en principe également induite par l'interféron (IFN)-y sur les cellules non hématopoïétiques, telles que les cellules épithéliales et les cardiomyocytes. Une controverse existe jusqu'à présent au sujet de la fonction de cette présentation d'antigènes non professionnelle, pour savoir si elle favorise la tolérance ou l'immunité dépendante des lymphocytes Τ in vivo. Pour répondre à cette question, nous avons testé des souris qui ne sont pas capables d'induire l'expression du CMHII sur les cellules non hématopoïétiques (souris PIV-/- K14 CIITA Tg) parmi différents modèles murins de pathologies inflammatoires, à savoir les modèles de vaccination pour induire des réponses spécifiques d'antigènes des lymphocytes B, plusieurs modèles de colite et un modèle de myocardite auto-immune expérimental (EAM). Pour cela, nous avons administré à ces souris un modèle de colite atténuée, induite par une infection chronique à Helicobacter hepaticus et par l'administration d'anticorps monoclonaux bloquant le récepteur de l'interleukine (IL)-10 (anti-IL-10R). Dans ce système, nous avons pu observer que l'expression abrogée de CMHII a aggravé la colite bactérienne, soit par les cellules non hématopoïétiques, soit exclusivement par les cellules épithéliales intestinales (CEI) dans un autre modèle murin (souris plV_fl/fl vil-Cre Tg). Ce phénotype du côlon a été associé à une augmentation des fréquences de cellules immunitaires innées, de lymphocytes Th1 CD4+, et d'expression des cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, y compris l'IFN-γ. Notamment, l'expression défectueuse de CMHII non hématopoïétique a également réduit les cellules Τ régulatrices (Treg) Forkhead box P3 (FoxP3)+, sans influencer les fréquences des cellules innées lymphoïdes et des cellules Th17. Ces résultats suggèrent un rôle tolérogène de CEIs CMHII+ qui contribue à l'homéostasie immunitaire intestinale. En revanche, dans le modèle d'EAM, les souris ayant subi une ablation de CMHII non hématopoïétique étaient résistantes à l'induction de la maladie, alors que la progression de la pathologie cardiaque, dans les souris de type naturel ou hétérozygotes, a été accompagnée par une régulation positive de l'expression de CMHII du myocarde. Cependant, l'inflammation cardiaque pourrait être transférée de manière adoptive depuis des souris amorcées PIV-/- K14 CIITA Tg vers des souris de type naturel, indiquant l'absence de défaut intrinsèque d'amorçage des cellules T CD4+ dans notre modèle de souris. Ces observations impliquent un rôle à jouer pour des cellules CMHII+ non hématopoïétiques résidentes du coeur, dans la promotion active de ΙΈΑΜ. En conclusion, nos résultats, provenant de diverses pathologies inflammatoires spécifiques d'organes, suggèrent un rôle complexe et divergent, soit tolérogène, soit immunogène/ pathologique, pour l'expression de CMHII non hématopoïétique au cours des pathologies inflammatoires. L'expression non professionnelle de CMHII semble influencer le résultat des réponses immunitaires en fonction de différents facteurs, tels que le tissu cible, le(s) type(s) de cellule(s) non hématopoïétique(s) participante(s) et l'origine de l'inflammation. Nos résultats pourraient potentiellement ouvrir la voie à des applications thérapeutiques, qui tiennent compte de la contribution de la présentation d'antigènes par des CPAs non professionnelles, au cours de l'inflammation spécifique d'organe. - MHC class II (MHCII) molecules are fundamental for the presentation of antigens to CD4+ Τ cells, allowing the development of antigen-specific immune responses. It is widely accepted that MHCII expression is restricted to antigen-presenting cells (APC). However, under inflammatory conditions, MHCII expression is typically also induced by interferon (IFN)-y on nonhematopoietic cells such as epithelial cells and cardiomyocytes. So far, it remains controversial whether this nonprofessional antigen-presentation function promotes CD4+ Τ cell-dependent tolerance or immunity in vivo. To address this issue, we utilised mice which lack inducible MHCII expression on nonhematopoietic cells (pIV-/- K14 CIITA Tg mice) in different mouse models of inflammatory pathologies, namely immunisation models to induce antigen-specific Β cell responses, various colitis models and a model of experimental autoimmune myocarditis (EAM). In an attenuated model of colitis induced by chronic Helicobacter hepaticus infection and treatment with anti-interleukin (IL)-10 receptor (anti-IL-10R) monoclonal blocking antibody, we observed that abrogated MHCII expression by nonhematopoietic cells or, in an alternative tamoxifen-inducible mouse model (plV_fl/fl vil-Cre Tg mice), exclusively by intestinal epithelial cells (IEC), exacerbated bacterial-driven colitis, which was associated with increased colonic frequencies of innate immune cells, CD4+ Th1 cells and expression of proinflammatory cytokines and chemokines, including IFN-γ. Notably, defective nonhematopoietic MHCII expression also resulted in reduced Forkhead box P3 (FoxP3)+ regulatory Τ (Treg) cells without influencing innate lymphoid cell (ILC) and Th17 cell frequencies. These findings suggest a tolerogenic role of MHClT lECs to contribute to intestinal immune homeostasis. In contrast, in the EAM model, mice ablated of nonhematopoietic MHCII were resistant to disease induction, whereas progression of cardiac pathology in WT and heterozygous control mice was accompanied by upregulation of myocardial MHCII expression. However, cardiac inflammation could be adoptively transferred from primed pIV-/- K14 CIITA Tg mice into WT mice, indicating no intrinsic defect of CD4+ Τ activation in our mouse model. These observations imply a role for MHCIT heart-resident nonhematopoietic cells in actively promoting EAM. In conclusion, our findings from different organ-specific inflammatory pathologies suggest a complex and diverging role - either tolerogenic or immunogenic/ pathologic - for nonhematopoietic MHCII expression during inflammatory pathologies: Nonprofessional MHCII expression appears to influence the outcome of immune responses depending on 7 factors such as the target tissue, participating non hematopoietic cell type(s) and the origin of inflammation. Our findings may potentially open the way to therapeutic applications taking into account the contribution of antigen presentation by nonprofessional, tissue-resident APCs during organ-specific inflammation.

Functional MRI Mapping of the Human Auditory Cortex

Mapping the human auditory cortex with standard functional imaging techniques is difficult because of its small size and angular position along the Sylvian fissure. As a result, the exact number and location of auditory cortex areas in the human remains unknown. In a first experiment, we measured the two largest tonotopic areas of primary auditory cortex (PAC, Al and R) using high-resolution functional MRI at 7 Tesla relative to the underlying anatomy of Heschl's gyrus (HG). The data reveals a clear anatomical- functional relationship that indicates the location of PAC across the range of common morphological variants of HG (single gyri, partial duplication and complete duplication). Human PAC tonotopic areas are oriented along an oblique posterior-to-anterior axis with mirror-symmetric frequency gradients perpendicular to HG, as in the macaque. In a second experiment, we tested whether these primary frequency-tuned units were modulated by selective attention to preferred vs. non-preferred sound frequencies in the dynamic manner needed to account for human listening abilities in noisy environments, such as cocktail parties or busy streets. We used a dual-stream selective attention experiment where subjects attended to one of two competing tonal streams presented simultaneously to different ears. Attention to low-frequency tones (250 Hz) enhanced neural responses within low-frequency-tuned voxels relative to high (4000 Hz), and vice versa when at-tention switched from high to low. Human PAC is able to tune into attended frequency channels and can switch frequencies on demand, like a radio. In a third experiment, we investigated repetition suppression effects to environmental sounds within primary and non-primary early-stage auditory areas, identified with the tonotopic mapping design. Repeated presentations of sounds from the same sources, as compared to different sources, gave repetition suppression effects within posterior and medial non-primary areas of the right hemisphere, reflecting their potential involvement in semantic representations. These three studies were conducted at 7 Tesla with high-resolution imaging. However, 7 Tesla scanners are, for the moment, not yet used for clinical diagnosis and mostly reside in institutions external to hospitals. Thus, hospital-based clinical functional and structural studies are mainly performed using lower field systems (1.5 or 3 Tesla). In a fourth experiment, we acquired tonotopic maps at 3 and 7 Tesla and evaluated the consistency of a tonotopic mapping paradigm between scanners. Mirror-symmetric gradients within PAC were highly similar at 7 and 3 Tesla across renderings at different spatial resolutions. We concluded that the tonotopic mapping paradigm is robust and suitable for definition of primary tonotopic areas, also at 3 Tesla. Finally, in a fifth study, we considered whether focal brain lesions alter tonotopic representations in the intact ipsi- and contralesional primary auditory cortex in three patients with hemispheric or cerebellar lesions, without and with auditory complaints. We found evidence for tonotopic reorganisation at the level of the primary auditory cortex in cases of brain lesions independently of auditory complaints. Overall, these results reflect a certain degree of plasticity within primary auditory cortex in different populations of subjects, assessed at different field strengths. - La cartographie du cortex auditif chez l'humain est difficile à réaliser avec des techniques d'imagerie fonctionnelle standard, étant donné sa petite taille et position angulaire le long de la fissure sylvienne. En conséquence, le nombre et l'emplacement exacts des différentes aires du cortex auditif restent inconnus chez l'homme. Lors d'une première expérience, nous avons mesuré, avec de l'imagerie par résonance magnétique à haute intensité (IRMf à 7 Tesla) chez des sujets humains sains, deux larges aires au sein du cortex auditif primaire (PAC; Al et R) avec une représentation spécifique des fréquences pures préférées - ou tonotopie. Nos résultats ont démontré une relation anatomico- fonctionnelle qui définit clairement la position du PAC à travers toutes les variantes du gyrus d'Heschl's (HG). Les aires tonotopiques du PAC humain sont orientées le long d'un axe postéro-antérieur oblique avec des gradients de fréquences spécifiques perpendiculaires à HG, d'une manière similaire à celles mesurées chez le singe. Dans une deuxième expérience, nous avons testé si ces aires primaires pouvaient être modulées, de façon dynamique, par une attention sélective pour des fréquences préférées par rapport à celles non-préférées. Cette modulation est primordiale lors d'interactions sociales chez l'humain en présence de bruits distracteurs tels que d'autres discussions ou un environnement sonore nuisible (comme par exemple, dans la circulation routière). Dans cette étude, nous avons utilisé une expérience d'attention sélective où le sujet devait être attentif à une des deux voies sonores présentées simultanément à chaque oreille. Lorsque le sujet portait était attentif aux sons de basses fréquences (250 Hz), la réponse neuronale relative à ces fréquences augmentait par rapport à celle des hautes fréquences (4000 Hz), et vice versa lorsque l'attention passait des hautes aux basses fréquences. De ce fait, nous pouvons dire que PAC est capable de focaliser sur la fréquence attendue et de changer de canal selon la demande, comme une radio. Lors d'une troisième expérience, nous avons étudié les effets de suppression due à la répétition de sons environnementaux dans les aires auditives primaires et non-primaires, d'abord identifiées via le protocole de la première étude. La présentation répétée de sons provenant de la même source sonore, par rapport à de sons de différentes sources sonores, a induit un effet de suppression dans les aires postérieures et médiales auditives non-primaires de l'hémisphère droite, reflétant une implication de ces aires dans la représentation de la catégorie sémantique. Ces trois études ont été réalisées avec de l'imagerie à haute résolution à 7 Tesla. Cependant, les scanners 7 Tesla ne sont pour le moment utilisés que pour de la recherche fondamentale, principalement dans des institutions externes, parfois proches du patient mais pas directement à son chevet. L'imagerie fonctionnelle et structurelle clinique se fait actuellement principalement avec des infrastructures cliniques à 1.5 ou 3 Tesla. Dans le cadre dune quatrième expérience, nous avons avons évalués la cohérence du paradigme de cartographie tonotopique à travers différents scanners (3 et 7 Tesla) chez les mêmes sujets. Nos résultats démontrent des gradients de fréquences définissant PAC très similaires à 3 et 7 Tesla. De ce fait, notre paradigme de définition des aires primaires auditives est robuste et applicable cliniquement. Finalement, nous avons évalués l'impact de lésions focales sur les représentations tonotopiques des aires auditives primaires des hémisphères intactes contralésionales et ipsilésionales chez trois patients avec des lésions hémisphériques ou cérébélleuses avec ou sans plaintes auditives. Nous avons trouvé l'évidence d'une certaine réorganisation des représentations topographiques au niveau de PAC dans le cas de lésions cérébrales indépendamment des plaintes auditives. En conclusion, nos résultats démontrent une certaine plasticité du cortex auditif primaire avec différentes populations de sujets et différents champs magnétiques.

From diabetes to heart disease : studies on dyslipidemia-induced B-cell dysfunction, immunomodulation in heart transplantation, and cardiac stem cell therapy

Diabetes is a growing epidemic with devastating human, social and economic impact. It is associated with significant changes in plasma concentrations of lipoproteins. We tested the hypothesis that lipoproteins modulate the function and survival of insulin-secreting cells. We first detected the presence of several receptors that participate in the binding and processing of plasma lipoproteins and confirmed the internalization of fluorescent LDL and HDL particles in insulin-secreting β-cells. Purified human VLDL and LDL particles reduced insulin mRNA levels and β-cell proliferation, and induced a dose-dependent increase in the rate of apoptosis. In mice lacking the LDL receptor, islets showed a dramatic decrease in LDL uptake and were partially resistant to apoptosis caused by LDL. VLDL-induced apoptosis of β-cells involved caspase-3 cleavage and reduction in levels of the c-Jun N-terminal (JNK) Interacting Protein-1 (IB1/JIP-1). In contrast, the pro-apoptotic signaling of lipoproteins was antagonized by HDL particles or by a small peptide inhibitor of JNK. The protective effects of HDL were mediated, in part, by inhibition of caspase-3 cleavage and activation of the protein kinase Akt/PKB. Heart disease is a major cause of morbidity and mortality among patients with diabetes. When heart failure is refractory to medical therapy and cannot be improved by electrical resynchronization, percutaneous angioplasty or coronary graft bypass surgery, heart transplantation remains a "last resort" therapy. Nevertheless, it is limited by the side effects of immunosuppressive drugs and chronic rejection. Localized expression of immunomodulatory genes in the donor organ can create a state of immune privilege within the graft, and was performed in rodent hearts by infecting cells with an adenovirus encoding indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), the rate-limiting enzyme in the catabolism of tryptophane. Other strategies are based on genetic manipulation of dendritic cells (DCs) with immunosuppressive genes and in vitro exposure of DCs to agents that prevent their maturation by inflammatory cytokines. Finally, we used 5-bromo-2'-deoxyuridine, which is incorporated into DNA and diluted with cell division, to identify long-term label retaining cells in the adult rodent heart. The majority of these cells were positive for the stem cell antigen-1 (Sca-1) and negative for the endothelial precursor marker CD31. They formed cardiospheres in vitro and showed differentiation potential into mesenchymal cell lineages. When cultured in cardiomyogenic differentiation medium, they expressed cardiac-specific genes. Taken together, these data provide evidence of slow-cycling stem cells in the rodent heart. Chronic shortage of donor organs opens the way to cardiac stem cell therapy in humans, although the long way from animal experimentation to routine therapy in patients may still take several years. - Du diabète de type 2 à la maladie coronarienne : trois études sur les dysfonctions de la cellule sécrétrice d'insuline induites par les dyslipidémies, l'immunomodulation dans la transplantation cardiaque, et la thérapie par des cellules souches myocardiques. Le diabète de type 2 a pris les dimensions d'une épidémie, avec des conséquences sociales et économiques dont nous n'avons pas encore pris toute la mesure. La maladie s'accompagne souvent d'une dyslipidémie caractérisée par une hypertriglycéridémie, des taux abaissés de cholestérol HDL, et des concentrations de cholestérol LDL à la limite supérieure de ce qui est considéré comme acceptable. L'hypothèse à la base de cette étude est qu'une modification des taux plasmatiques de lipoprotéines pourrait avoir une influence directe sur la cellule β sécrétrice d'insuline en modifiant sa fonction, sa durée de vie et son taux de régénération. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence, sur la cellule β, la présence de plusieurs récepteurs impliqués dans la captation des lipoprotéines. Nous avons confirmé la fonctionnalité de ces récepteurs en suivant l'internalisation de LDL et de HDL marqués. En présence de VLDL ou de LDL humains, nous avons observé une diminution de la transcription du gène de l'insuline, une prolifération cellulaire réduite, et une augmentation de l'apoptose, toutes fonctions de la dose et du temps d'exposition. L'apoptose induite par les VLDL passe par une activation de la caspase-3 et une réduction du taux de la protéine IB1/JIP-1 (Islet Brain1/JNK Interacting Protein 1), dont une mutation est associée à une forme monogénique de diabète de type 2. Par opposition, les HDL, ainsi que des peptides inhibiteurs de JNK, sont capables de contrer la cascade pro-apoptotique déclenchée, respectivement, par les LDL et les VLDL. Ces effets protecteurs comprennent l'inhibition du clivage de la caspase-3 et l'activation de la protéine kinase Akt/PKB. En conclusion, les lipoprotéines sont des éléments clés de la survie de la cellule β, et pourraient contribuer au dysfonctionnement observé dans le pancréas endocrine au cours du développement du diabète. La maladie cardiaque, et plus particulièrement la maladie coronarienne, est une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de diabète. Plusieurs stratégies sont utilisées quotidiennement pour pallier les atteintes cardiaques: traitements médicamenteux, électromécaniques par resynchronisation électrique, ou communément appelés « interventionnels » lorsqu'ils font appel à l'angioplastie percutanée. La revascularisation du myocarde par des pontages coronariens donne également de très bons résultats dans certaines situations. Il existe toutefois des cas où plus aucune de ces approches n'est suffisante. La transplantation cardiaque est alors la thérapie de choix pour un nombre restreint de patients. La thérapie génique, en permettant l'expression locale de gènes immunomodulateurs dans l'organe greffé, permet de diminuer les réactions de rejet inhérentes à toute transplantation (à l'exception de celles réalisées entre deux jumeaux homozygotes). Nous avons appliqué chez des rongeurs cette stratégie en infectant le coeur greffé avec un adénovirus codant pour l'enzyme indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO), une enzyme clé dans le catabolisme du tryptophane. Nous avons procédé de manière identique in vitro en surexprimant IDO dans les cellules dendritiques, dont le rôle est de présenter les antigènes aux lymphocytes Τ du receveur. Des expériences similaires ont été réalisées en traitant les cellules dendritiques avec des substances capables de prévenir, en partie du moins, leur maturation par des agents pro-inflammatoires. Finalement, nous avons exploré une stratégie utilisée couramment en hématologie, mais qui n'en est encore qu'à ses débuts au niveau cardiaque : la thérapie par des cellules souches. En traitant des rongeurs avec un marqueur qui s'incorpore dans l'ADN nucléaire, le 5-bromo- 2'-deoxyuridine, nous avons identifié une population cellulaire se divisant rarement, positive en grande partie pour l'antigène embryonnaire Sca-1 et négative pour le marqueur endothélial CD31. En culture, ces cellules forment des cardiosphères et sont capables de se différencier dans les principaux types tissulaires mésenchymateux. Dans un milieu de differentiation adéquat, ces cellules expriment des gènes cardiomyocytaires. En résumé, ces données confirment la présence chez le rongeur d'une population résidente de précurseurs myocardiques. En addenda, on trouvera deux publications relatives à la cellule β productrice d'insuline. Le premier article démontre le rôle essentiel joué par la complexine dans l'insulino-sécrétion, tandis que le second souligne l'importance de la protéine IB1/JIP-1 dans la protection contre l'apoptose de la cellule β induite par certaines cytokines.

Nouveautés en médecine interne hospitalière 2007: perspective des chefs de clinique [Highlights 2007 in hospital-based internal medicine: the point of view from the chief residents]

L'année 2007 a été marquée par la publication de plusieurs études internationales concernant directement le quotidien de l'interniste hospitalier. Un résumé de ces travaux ne saurait être qu'un extrait condensé et forcément subjectif d'une croissante et dynamique diversité. Au gré de leurs lectures, de leurs intérêts et de leurs interrogations, les chefs de clinique du Service de médecine interne vous proposent ainsi un parcours original revisitant les thèmes de l'insuffisance cardiaque, du diabète, de l'endocardite, de la BPCO ou de la qualité des soins. Cette variété de sujets illustre à la fois le vaste champ couvert par la médecine interne actuelle, ainsi que les nombreuses incertitudes liées à la pratique médicale moderne basée sur les preuves. In 2007, several international studies brought useful information for the daily work of internists in hospital settings. This summary is of course subjective but reflects the interests and questions of the chief residents of the Department of internal medicine who wrote this article like an original trip in medical literature. This trip will allow you to review some aspects of important fields such as heart failure, diabetes, endocarditis, COPD, and quality of care. Besides the growing diversity of the fields covered by internal medicine, these various topics underline also the uncertainty internists have to face in a practice directed towards evidence.

Reflux vésico-­‐urétéral et atteinte rénale: rôle de l'albuminurie

Introduction :¦Le reflux vésico-urétéral (RVU) touche environs 1% des nouveau-nés et est retrouvé chez 25 à 30 % des enfants ayant une pyélonéphrite. Le RVU peut être associé à une hypoplasie/dysplasie rénale ou/et à des cicatrices rénales causées par les pyélonéphrites. Ces changements morphologiques sont plus ou moins importants selon le grade du reflux et peuvent conduire à une insuffisance rénale chronique et potentiellement évoluer en une insuffisance rénale terminale.¦La microalbuminurie (MA) reflète une augmentation anormale de la perméabilité capillaire glomérulaire et est un indicateur prédictif de la péjoration de la fonction rénale vers l'insuffisance chronique. La MA est également un facteur de risque cardiovasculaire.¦Objectif :¦Le but de cette recherche transversale est d'évaluer la présence de MA chez des patients atteints de RVU et de voir s'il est possible de corréler la MA avec le degré de reflux, la présence d'une hyperfiltration et le degré de l'insuffisance rénale.¦Patients et méthode :¦Une base de données de 160 dossiers médicaux du service de pédiatrie du CHUV, portant sur les années 2007, 2008, 2009 et 2010, va être investiguée. Ces dossiers regroupent tous les patients atteints de RVU ayant eu une exploration fonctionnelle rénale, dont l'âge varie du nouveau-né au jeune adulte âgé de 21 ans. Les variables suivantes seront considérées et analysées en détail: âge, sexe, taille, type de RVU, taux de filtration glomérulaire (TFG), flux plasmatique rénal (FPR), fraction de filtration (FF), albuminurie, rapport albumine/créatinine.¦- Les RVU sont classés en cinq grades (I, II, III, IV, V) et peuvent être uni- ou bilatéraux¦- Le TFG est calculé avec la clairance à l'inuline, un polymère de glucose filtré, non réabsorbé, ni sécrété, qu'on perfuse au patient. TFG = Uin V/Pin (ml/min)¦- Le FPR est calculé avec la clairance au PAH (acide para-amino-hippurique), une substance entièrement filtrée et sécrétée au premier passage et qu'on injecte au patient. FPR = UPAHV / PPAH (ml/min)¦- La FF est la proportion du FPR qui est filtrée.¦FF= TGF / FPR ou FF = Cl in / Cl PAH¦- La MA a été mesurée par la méthode Immulite (Siemens) jusqu'en fin août 2010 et par la méthode ALBT2 (Roche Diagnostics) à partir d'octobre 2010. Le taux normal d'albuminurie est de moins de 20 mg/l sur un échantillon d'urine.¦- Le rapport albumine urinaire / créatinine urinaire permet d'éviter les problèmes de variation de volume urinaire lors de l'analyse d'échantillon urinaire d'une seule miction. Le rapport normal est de moins de 2,5 g/mol de créatinine.¦Un questionnaire sera envoyé aux patients pour obtenir des précisions sur la fréquence et la sévérité des infections urinaires éventuellement survenues depuis.¦Les dossiers seront revus pour connaître l'évolution du RVU.¦Résultats attendus et discussion: Les résultats nous permettront :¦1) De savoir si les patients avec un RVU ont une MA¦2) De savoir si la MA varie en fonction du grade de leur reflux¦3) De savoir si la MA varie en fonction de l'hyperfiltration mesurée par la FF.¦Interprétation :¦Si la MA varie en fonction de la FF cela indiquera que la MA est la conséquence directe de l'hyperfiltration compensatrice de la perte de la masse néphronique et qu'elle est ainsi le reflet d'une cause principalement mécanique. Si la MA ne varie pas en fonction de la FF cela indiquera qu'elle est liée à l'hypoplasie/dysplasie ou/et aux cicatrices dues aux pyélonéphrites. Elle pourra alors être par exemple la conséquence d'une néphropathie glomérulotubulointerstitielle.¦Du point de vue pratique, cette étude permettra de déterminer si la simple mesure da la MA peut aider à prédire le degré de l'atteinte rénale et/ou le degré de l'hyperfiltration dans ce groupe de patients atteints de RVU.¦Bibliographie¦1. Silbernagl S, Despopoulos A. Atlas de poche de physiologie. Paris : Flammarion médecine-sciences; 2004.¦2. Brenner BM, Rector FC. The Kidney . Philadelphia : WB Saunders Company; 1996.¦3. Brandström P, Esbjörner E, Herthelius M, Holmdahl G, Läckgren G, Nevéus T, et al. The Swedish Reflux Trial in Children: I. Study Design and Study Population Characteristics. The Journal of Urology. 2010;184:274-279.¦4. Holmdahl G, Brandström P, Läckgren G, Sillén U, Stokland E, Jodal U, et al. The Swedish Reflux Trial in Children: II. Vesicoureteral Reflux Outcome. The Journal of Urology. 2010;184:280-285.¦5. Brandström P, Esbjörner E, Herthelius M, Swerkersson S, Jodal U, Hansson S. The Swedish Reflux Trial in Children: III. Urinary Tract Infection Pattern. The Journal of Urology. 2010;184:286-291.¦6. Brandström P, Nevéus T, Sixt R, Stokland E, Jodal U, Hansson S. The Swedish Reflux Trial in Children: IV. Renal Damage. The Journal of Urology. 2010;184:292-297.¦7. Ruggenenti P, Remuzzi G. Time to abandon microalbuminuria? Kidney Int. 2006;70:1214-1222.¦8. Hostetter TH, Olson JL, Rennke HG, Venkatachalam MA, Brenner BM. Hyperfiltration in remnant nephrons: a potentially adverse response to renal ablation. J. Am. Soc. Nephrol. 2001;12:1315-1325.¦9. Basic J, Golubovic E, Miljkovic P, Bjelakovic G, Cvetkovic T, Milosevic V. Microalbuminuria in children with vesicoureteral reflux. Ren Fail. 2008:639-643.¦10. González E, Papazyan JP, Girardin E. Impact of vesicoureteral reflux on the size of renal lesions after an episode of acute pyelonephritis. The Journal of Urology. 2005;173:571-575.

Profils de réponse immunitaire innée et adaptative lors d'infections aiguës par le virus de l'hépatite B, de la dengue et influenza A

Les réponses immunitaires innées et adaptatives déclenchées par une infection virale chez l'humain sont classiquement décrites comme une succession d'événements communs à tous les virus- la réponse innée, caractérisés par la libération rapide de cytokines antivirales et des chémokines, recrutant monocytes, NK et lymphocytes Τ vers le site d'infection, suivis par l'activation de l'immunité adaptative. Notre compréhension de la dynamique de ces mécanismes dynamiques est limitée chez l'humain. En effet, il existe peu d'études portant sur la cinétique et l'analyse quantitative de la réponse Τ spécifique au virus, parallèlement aux aspects plus qualitatifs de cette réponse (cytokines sériques produites lors de différentes infections virales, notamment). Méthode: Nous avons étudiés trois groupes de patients tous recrutés au cours de la phase aiguë d'une infection par le virus de la dengue (28 patients), le virus influenza A (13 patients) et le virus de l'hépatite Β (HBV) (13 patients). Nous avons analysé le profil d'activation (CD38, HLA-DR) et de prolifération (Ki-67, Bcl-2) des lymphocytes Τ CD8+ (par cytométrie de flux), de façon longitudinale à différents timepoints (depuis le début des symptômes jusqu'à rémission totale) en quantifiant 15 cytokines et chémokines (par Luminex multiplex biométrie immunoassay) dans le sérum des patients infectés. Résultats: Nous avons comparé le profil des réponses innée et adaptative chez les 3 types d'infection virales; les patients infectés par l'HBV ont une fréquence élevée de CD8+ spécifiques activés et proliférant ainsi que des taux sériques élevés de TNF-α et d'IFN-γ. Les patients infectés par le virus de la dengue et par le virus Influenza présentent quant à eux une activation CD 8+ moins intense mais une forte expression de la réponse innée, marquée par une élévation des cytokines IFN-α, IFN-γ, et TNF-α. De plus, une particularité des patients infectés par le virus de la dengue est de présenter une élévation marquée des cytokines immunorégulatrices (IL-10, IL- 1RA). Conclusion: Ces résultats permettent de montrer que la réponse immunologique consécutive à une infections virale spécifique est caractérisée par sa propre signature, tant au niveau de la production de cytokines/chemokines que de la quantité des lymphocytes Τ CD+8+ spécifiques activés et proliférantes. Ce travail contribue ainsi à une meilleure compréhension de l'immunité antivirale chez les humains, grâce à la description de la cinétique et de la quantification des cellules Τ CD8+ activées et des taux de cytokines dans chaque infection étudiée. Abstract Knowledge of innate and adaptive immune parameters triggered by viral infections is limited but important for understanding disease pathogenesis. We performed a comparative longitudinal analysis of serum cytokines/chemokines and of virus-activated CD8 Τ cells population in patients with acute dengue, influenza A or HBV infections from onset to disease recovery. We observed that each viral infection is characterized by its own signature of cytokines/chemokines production and size of activated and proliferating CD8 Τ cell pool. This is, to our knowledge, the first comparative longitudinal study of the immune response in human subjects in three distinct viral infections.

Characterization of novel hypertrophic signaling pathways activated by the AKAP-Lbc signaling complex in cardiomyocytes

RÉSUMÉL'hypertrophie cardiaque représente un mécanisme d'adaptation du myocarde en réponse à différents stress. Sur le long terme, l'hypertrophie cardiaque peut évoluer vers l'insuffisance cardiaque, l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés, pour cette raison, la communauté scientifique est très intéressée à élucider les voies de signalisation qui régulent ce phénomène pathologique dans le coeur.Notre laboratoire a montré que AKAP-Lbc, une protéine d'ancrage de la protéine kinase A (AKAPs), est principalement exprimée dans le coeur et peut réguler des processus importants tels que l'hypertrophie des cardiomyocytes.AKAP-Lbc fonctionne comme un facteur d'échange de nucléotides guanine (GEF) pour la petite Rho-GTPase RhoA. Cette fonction est activée par différents récepteurs qui activent son domaine Rho-GEF. Des études récentes ont démontré que AKAP-Lbc est impliquée dans la réponse hypertrophique des cardiomyocytes suite à l'activation des récepteurs α1-adrénergiques. Le but général de ce travail de thèse est la caractérisation de la voie de signalisation hypertrophique activée par AKAP-Lbc dans les cardiomyocytes.Mes travaux montrent que AKAP-Lbc organise un complexe macromoléculaire, comprenant les protéines kinases PKN, MLTK, MKK3 et p38 et active la protéine kinase p38 en réponse à l'activation des récepteurs α1-adrénergiques.Nos résultats indiquent que cette voie de signalisation au cours de la réponse hypertrophique active le facteur de transcription GATA4 et la protéine Hsp27.GATA4 est un important facteur de transcription qui régule la transcription de plusieurs gènes au cours de la réponse hypertrophique, alors que Hsp27 est une protéine chaperonne qui interagit avec le cytosquelette des cardiomyocytes et les protége contre le stress hypertrophique.Pris ensembles, ces études contribuent à comprendre comment le complexe de signalisation formé par AKAP-Lbc régule l'hypertrophie dans les cardiomyocytes. Au-delà de leur intérêt au niveau biochimique, ces travaux pourraient aussi contribuer à la compréhension du phénomène de l'hypertrophie dans le coeur.

A model for physical activity, bahaviour and energy expenditure assessment in real-life condition

RésuméL'origine de l'obésité, qui atteint des proportions épidémiques, est complexe. Elle est liée au mode de vie et au comportement des individus par rapport à l'activité physique, expression des choix individuels et de l'interaction avec l'environnement. Les mesures du comportement au niveau de l'activité physique des individus face à leur environnement, la répartition des types d'activité physique, la durée, la fréquence, l'intensité, et la dépense énergétique sont d'une grande importance. Aujourd'hui, il y a un manque de méthodes permettant une évaluation précise et objective de l'activité physique et du comportement des individus. Afin de compléter les recherches relatives à l'activité physique, à l'obésité et à certaines maladies, le premier objectif du travail de thèse était de développer un modèle pour l'identification objective des types d'activité physique dans des conditions de vie réelles et l'estimation de la dépense énergétique basée sur une combinaison de 2 accéléromètres et 1 GPS. Le modèle prend en compte qu'une activité donnée peut être accomplie de différentes façons dans la vie réelle. Les activités quotidiennes ont pu être classées en 8 catégories, de sédentaires à actives, avec une précision de 1 min. La dépense énergétique a pu peut être prédite avec précision par le modèle. Après validation du modèle, le comportement des individus de l'activité physique a été évalué dans une seconde étude. Nous avons émis l'hypothèse que, dans un environnement caractérisé par les pentes, les personnes obèses sont tentées d'éviter les pentes raides et de diminuer la vitesse de marche au cours d'une activité physique spontanée, ainsi que pendant les exercices prescrits et structurés. Nous avons donc caractérisé, par moyen du modèle développé, le comportement des individus obèses dans un environnement vallonné urbain. La façon dont on aborde un environnement valloné dans les déplacements quotidiens devrait également être considérée lors de la prescription de marche supplémentaire afin d'augmenter l'activité physique.SummaryOrigin of obesity, that reached epidemic proportion, is complex and may be linked to different lifestyle and physical activity behaviour. Measurement of physical activity behaviour of individuals towards their environment, the distribution of physical activity in terms of physical activity type, volume, duration, frequency, intensity, and energy expenditure is of great importance. Nowadays, there is a lack of methods for accurate and objective assessment of physical activity and of individuals' physical activity behaviour. In order to complement the research relating physical activity to obesity and related diseases, the first aim of the thesis work was to develop a model for objective identification of physical activity types in real-life condition and energy expenditure based on a combination of 2 accelerometers and 1 GPS device. The model takes into account that a given activity can be achieved in many different ways in real life condition. Daily activities could be classified in 8 categories, as sedentary to active physical activity, within 1 min accuracy, and physical activity patterns determined. The energy expenditure could be predicted accurately with an accuracy below 10%. Furthermore, individuals' physical activity behaviour is expression of individual choices and their interaction with the neighbourhood environment. In a second study, we hypothesized that, in an environment characterized by inclines, obese individuals are tempted to avoid steep positive slopes and to decrease walking speed during spontaneous outdoor physical activity, as well as during prescribed structured bouts of exercise. Finally, we characterized, by mean of the developed model, the physical activity behaviour of obese individuals in a hilly urban environment. Quantifying how one tackles hilly environment or avoids slope in their everyday displacements should be also considered while prescribing extra walking in free-living conditions in order to increase physical activity.

Distinct neuronal circuits underlying the bahavioral and physiological components of the fear response

Abstract : Expression of fear involves changes in a number of behavioral and physiological parameters that are triggered by the central amygdala (CeA). The fear circuit also includes a series of brain stem nuclei that are the final effectors of the changes induced by the fear reaction. The CeA expresses many different neuropeptide receptors that can modulate fear responses. Today, the precise organization and the modulation of projections from the amygdala to the brain stem are still poorly understood. The aim of this project was to better understand the organization and the modulation of the fear circuit. To investigate this we first determined whether the CeA is composed of separate neuronal populations, where each one projects to specific brain stem nuclei, or whether single CeA neurons project to several nuclei. For this purpose, we first selected two brain stem nuclei implicated in the modulation of different components of the fear reactions, the periaqueductal gray (implicated in freezing) and the nucleus of solitary tract (implicated in heart rate modulation). We then performed double injections of two different retrograde tracers in these two nuclei and we quantified the subsequent presence of co-labelling in the CeA. We found that neurons projecting to the PAG and to the NTS are organized in separate populations. Subsequent electrophysiological recordings of the two populations revealed that PAG and NTS projecting neurons also have different electrophysiological characteristics. We then verified in vitro whether the neurons projecting to different brain stem nuclei express specific combinations of neuropeptide receptors, and whether a neuropeptide acting pre-synaptically (oxytocin) specifically modulates one of these two projections. We did not find differences at the level of expression of neurópeptide receptors, but we observed that oxytocin, a neuropeptide with anxiolytic properties, modulates PAG projecting neurons without affecting NTS projecting neurons. As oxytocin appeared to specifically modulate projections to the PAG, involved in the modulation of the freezing reaction, but did not affect the projections to the NTS, implicated in the modulation of cardiovascular parameters, we verified how this modulation translates in living animals. We investigated the effects of infra-amygdala injection of oxytocin on cardiovascular and behavioral changes induced by contextual fear conditioning. We found that oxytocin decreased the freezing response without affecting the cardiovascular system. Finally, as neuropeptides are considered potential future anxiolytics, we investigated whether diazepam and oxytocin, acting on the same circuit, had additive effects. This question was addressed exclusively with an in vitro electrophysiological approach. We obtained that oxytocin and diazepam, when co-applied, had an additive effect on both synaptic transmission and neuronal activity. These results open new perspectives for the possible clinical applications of oxytocin. Résumé : L'expression de la peur est accompagnée par de nombreux changements physiologiques et comportementaux qui sont déclenchés par l'amygdale centrale (CeA). Le circuit inclue aussi une série de noyaux du tronc cérébrale qui sont les effecteurs des différentes composantes de la réaction de peur. On sait que CeA envoie des projections aux noyaux du tronc cérébral et que ces neurones expriment une grande variété de récepteurs aux neuropeptides. Par contre, l'organisation des projections, ainsi que la modulation de ces projections par les neuropeptides reste encore peu connue. Avec ce projet, on premièrement voulu déterminer si CeA est composée de populations neuronales séparées qui projettent vers un noyau spécifique, ou bien si chaque neurones envoie des projections vers plusieurs noyaux. A ce propos, on a effectué des doubles injections de deux traceurs rétrogrades différentes dans deux noyaux du tronc cérébral impliqués dans des différentes composantes des réactions de peur. On a injecté la substance grise périaqueducale (PAG), qui est impliquée dans la réponse d'immobilisation, ainsi que le noyau du tractus solitaire (NTS) qui est responsable des changements cardiovasculaires. On a ensuite quantifié la présence de neurones contenant les deux traceurs dans CeA. On a trouvé que la plupart des neurones de l'amygdale centrale projettent vers un noyau spécifique, et on peut donc dire que l'amygdale semble être composée de populations neuronales séparées. On a ensuite mesuré les caractéristiques électrophysiologiques de ces deux projections et on a trouvé des différences substantielles concernant la résistance membranaire, la capacitance, le potentiel membranaire de repos ainsi que la fréquence des potentiels d'action spontanés. Puis, comme beaucoup de neuropéptides dans l'amygdale exercent un effet modulatoire sûr les réactions de peur et sur l'anxiété, on a étudié les effets directs et indirects d'une série de neuropeptides sur les différentes projections pour évaluer s'il y a des neuropeptides qui agissent spécifiquement sur une. On n'a pas trouvé de différences entre neurones qui projettent vers le PAG et neurones qui projettent vers le NTS concernant les effets de neuropeptides qui agissent directement sur ces cellules. Par contre, on a trouvé que l'ocytocine, un neuropeptide qui se lie à des récepteurs dans la partie latérale de l'amygdale centrale et inhibe de façon indirecte les neurones de l'amygdala centrale médiale, module les projections vers le PAG sans affecter celles qui vont vers le NTS. Comme le PAG est impliqué dans la réponse d'immobilisation, alors que le NTS est impliqué dans la modulation cardiovasculaire, on a ensuite étudié les effets de l'ocytocine injectée dans l'amygdale de rat vivants sur les réactions de peur conditionnées. On a trouvé que l'ocytocine diminue la réponse d'immobilisation sans par contre affecter la réponse cardiovasculaire. Pour terminer, on a vérifié si l'ocytocine potentialise les effets d'un médicament anxiolytique, le diazeparn. Avec une étude in vitro on a trouvé qu'une co-application d'ocytocine et diazeparn résulte en un effet additionnel à la fois sur la transmission synaptique ainsi que sur l'activité neuronale des neurones de l'amygdale centrale médiale. Ces résultats ouvrent des nouvelles perspectives pour une potentielle utilisation clinique de l'ocytocine.

Added prognostic value of myocardial blood flow quantitation in rubidium-82 positron emission tomography imaging

Les maladies cardiovasculaires restent la cause de mortalité la plus élevée dans le monde occidental. Il s'agit d'un processus long et complexe, dont l'infarctus du myocarde et la mort cardiaque ne sont que la fin d'un spectrum. La perfusion myocardique joue un rôle central dans l'évolution de la maladie et survient chronologiquement en amont de la dysfonction diastolique et systolique, ainsi que de l'infarctus du myocarde. Une meilleure compréhension de la Physiopathologie sous-jacente est cruciale dans le diagnostique et la prise en charge du patient. Dans ce sens, ce travail tente d'évaluer l'apport de l'évaluation de la perfusion myocardique évaluée par la tomographic à émission de positron (PET/CT) quant à la prédiction d'événements cardiovasculaires. De plus, l'apport de l'évaluation quantitative par rapport à l'évaluation qualitative a été démontré dans ce travail. Nous avons utilisé un radiotraceur unique au regard de ses caractéristiques. En effet, Le Rubidium-82 est un traceur qui ne nécessite pas d'un cyclotron pour sa fabrication, dès lors qu'il est produit par un générateur, rendant ainsi sa disponibilité un atout et un avantage potentiel lors de futurs implémentations à plus grande échelle. Ce travail démontre la supériorité de l'analyse de perfusion myocardique quantitative par rapport à l'analyse traditionnelle qualitative, ce qui n'était pas encore confirmé avec le Rubidium-82. Les résultats montrent une démarcation significative entre les différentes valeurs de perfusion quantitative/absolue, permettant de distinguer différentes populations plus ou moins à risque en terme de prédiction d'événements cardiaques futurs. Il est intéressant de noter que dans un modèle combinant l'analyse qualitative et quantitative proposé dans ce travail, l'inclusion des résultats les plus ischémiques obtenus par l'analyse qualitative avec les résultats de perfusion les plus bas en terme de flux myocardique absolu (analyse quantitative) démarque une population à très bas risque d'événements cardiovasculaires majeurs, une prédiction pouvant être observée surplus de 1'000 jours. Ces résultats forment un ajout significatif quant à l'évaluation de la perfusion myocardique par la médecine nucléaire, notamment par ce model intégratif proposé, lequel permet une prédiction précise et contributive dans le cadre de futurs événements cardiovasculaires majeurs.

Combining MAR elements and transposable vectors for more reliable transgene integration and expression

Integration without cytotoxic effects and long-term expression of a transgene constitutes a major challenge in gene therapy and biotechnology applications. In this context, transposons represent an attractive system for gene transfer because of their ability to promote efficient integration of a transgene in a variety of cell lines. However, the transgene integration can lead to insertional mutagenesis and/or unstable transgene expression by epigenetic modifications. These unwanted events may be limited by the use of chromatin control elements called MARs (matrix attachment regions). Indeed, the insertion of these DNA elements next to the transgene usually results in higher and more stable expression by maintaining transgene chromatin in an active configuration and preventing gene silencing. In this study, we tested if the inclusion of the MAR 1-68 in the piggyBac transposon system may lead to efficient and safer transgene integration and ensure reliable stable and long-term expression of a transgene. The MAR-containing transposon construct was tested in CHO cells, for biotechnology applications, and in mesoangioblast cells that can differentiate into muscle cells and are important candidates for potential stem cell therapies of myopathies. We showed that the addition of the MAR 1 -68 in the piggyBac transposon did not interfere with transposition, thereby maintaining high frequency of transgene integrations in these cells. Moreover, the MAR allowed higher transgene expression from fewer transposon integration events. We also found that enriched transgene-expressing cell populations could be obtained without the need of selection pressure. Since antibiotic-enforced selection protocols often result in a higher integrated copy number and mosaic expression patterns, this strategy could benefit many applications in which a low copy number of integrated transgenes and antibiotic-free conditions are desired. In addition, the intramuscular transplantation of mouse tibialis anterior muscles with mesoangioblasts containing the transposon led to widespread and sustained myofiber transgene expression after differentiation of these cells in vivo. These findings indicated that piggyBac vectors may provide a viable approach to achieve stable gene transfer in the context of Duchenne muscular dystrophy therapy. - L'intégration sans effets cytotoxiques et l'expression à long terme d'un transgène constituent un défi majeur en thérapie génique et en biotechnologie. Dans ce contexte, les transposons représentent un système attrayant pour le transfert de gènes en raison de leur capacité à promouvoir l'intégration efficace d'un transgène dans une variété de lignées cellulaires. Toutefois, l'intégration d'un transgène peut conduire à une mutagénèse insertionnelle et/ou à une expression instable due au silençage du transgène suite à des modifications épigénétiques. Ces événements indésirables de silençage génique peuvent être diminués par l'utilisation d'éléments de contrôle de la chromatine appelés MAR (matrix attachment region). En effet, l'insertion de ces éléments d'ADN à proximité du transgène se traduit généralement par une expression plus élevée et plus stable de celui-ci, en permettant le maintien d'une chromatine dans une configuration active autour du transgène et en empêchant l'inactivation du gène. Dans cette étude, nous avons testé si l'inclusion du MAR 1-68 dans le système transposon piggyBac peut améliorer l'efficacité d'intégration de façon sécuritaire et l'expression à long terme d'un transgène. Le transposon contenant l'élément MAR a été testé dans les cellules CHO, couramment utilisées en biotechnologie, et dans des cellules progénitrices appelées mésoangioblastes, qui peuvent se différencier en cellules musculaires, et qui constituent ainsi des candidats prometteurs pour la thérapie à partir de cellules souches de patients souffrant de myopathie. Nous avons montré que l'addition du MAR 1-68 dans le transposon piggyBac n'interfère pas avec la transposition et permet de maintenir une fréquence élevée d'intégration du transgène dans ces deux types cellulaires. De plus, il semble que cette association mène à une meilleure expression du transgène à partir de peu d'événements d'intégration du transposon. En outre, ces populations enrichies en cellules exprimant de façon stable le transgène ont pu être obtenues sans avoir recours à une pression de sélection. Etant donné que les protocoles de sélection basée sur l'utilisation d'antibiotiques conduisent souvent à un nombre plus élevé de copies intégrées et à la variégation de l'expression du transgène et qu'ils impliquent une longue culture in vitro, cette stratégie pourrait profiter à des applications pour lesquelles on souhaite un faible nombre de copies intégrées et/ou l'utilisation d'antibiotiques n'est pas souhaitable. De plus, la transplantation intramusculaire de mésoangioblastes contenant le transposon dans le muscle tibial antérieur de souris a conduit, après la différentiation de ces cellules in vivo, à une expression constante et étendue du transgène dans les myofibres. Ces résultats indiquent que les vecteurs piggyBac pourraient fournir une approche viable pour assurer un transfert de gènes stables dans le contexte d'un traitement de la dystrophic musculaire de Duchenne.

Perception of damaging effects of smoking, and brief cessation counselling by doctors : a comparison between native Swiss and immigrants

Résumé Une étude prospective ouverte a été menée parmi les patients venant pour la première fois, sans rendez-vous et en urgence, dans une policlinique urbaine (où plus de la moitié des patients sont d'origine étrangère) pour déterminer si les connaissances sur les méfaits du tabac sont identiques chez les immigrés et les Suisses, si le niveau d'intégration influence les connaissances et si les médecins du service donnent des conseils aussi souvent aux fumeurs Suisses qu'aux fumeurs étrangers. 226 fumeurs ont participé à l'étude, 105 Suisses (46.5%) et 121 étrangers (53,5%). 32.2% (95% IC [24.4%; 41.1%]) des migrants et 9.6% [5.3% ; 16.8%] des Suisses ne pouvaient pas mentionner un effet nocif du tabac. Après ajustement pour l'âge, l'analyse multivariée montre que le risque d'ignorer les méfaits du tabac est plus élevé pour les personnes ne maîtrisant pas la langue locale que pour celles la maîtrisant (odds ratio (OR)=7.5 [3.6; 15.8], p<0,001), et est plus élevé pour les hommes que pour les femmes (OR=4.3 [1.9 10.0], p<0.001). Un conseil pour arrêter de fumer a été donné avec une égale fréquence aux immigrants (31.9% [24.2% ; 40.1%]) et aux Suisses (29% [21.0% ; 38.5%]). Les patients ne maîtrisant pas la langue locale n'ont pas reçu moins de conseil que ceux la maîtrisant (0R-1.1 [0.6 ; 2.1], p=0.812). En conclusion, le niveau de connaissances des méfaits du tabac est moins bon chez les hommes immigrés non intégrés ou qui ne maîtrisent pas la langue locale. Un conseil sur l'arrêt du tabac n'est donné qu'à une minorité, mais à égale fréquence à tous les patients du service, quelle que soit leur nationalité. Abstract An open prospective study was conducted among the patients visiting an urban medical policlinic for the first time without an appointment to assess whether the immigrants (who represent more than half of our patients) are aware of the health effects of smoking, whether the level of acculturation influences knowledge, and whether doctors give similar advice to Swiss and foreign smokers. 226 smokers, 105 Swiss (46.5%), and 121 foreign-born (53.5%), participated in the study. 32.2% (95% CI [24.4%; 41.1%]) of migrants and 9.6% [5.3%; 16.8%] of Swiss patients were not aware of negative effects of smoking. After adjustment for age, the multivariate model showed that the estimated odds of "ignorance of health effects of smoking" was higher for people lacking mastery of the local language compared with those mastering it (odds ratio (OR) = 7.5 [3.6; 15.8], p <0.001), and higher for men (OR 4.3 [1.9; 10.0], p <0.001). Advice to stop smoking was given with similar frequency to immigrants (31.9% [24.2%; 40.8%] and Swiss patients (29.0% [21.0%; 38.5%]). Non-integrated patients did not appear to receive less counselling than integrated patients (OR = 1.1 [0.6; 2.1], p 0.812). We conclude that the level of knowledge among male immigrants not integrated or unable to speak the local language is lower than among integrated foreign-born and Swiss patients. Smoking cessation counselling by a doctor was only given to a minority of patients, but such counselling seemed irrespective of nationality.