Optimierung der Extraktion von Naturstoffen aus Bodenbakterien und filamentösen Pilzen

Der Begriff der Aufarbeitung beschreibt die verfahrenstechnischen Grundoperationen zur Isolierung des im Fermenter enthaltenen Wertproduktes. Bei der mikrobiellen Herstellung verschiedenster Produkte ist die Aufarbeitung aber der kosten- und arbeitsintensivste Faktor, so dass Optimierungen hinsichtlich der Effizienz wichtig sind. Die vorliegende Arbeit wurde im Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung angefertigt. Die Arbeitsgruppe Mikrobielle Wirkstoffe beschäftigt sich mit der Suche nach neuen antibiotisch wirkenden Sekundärmetaboliten aus Bodenbakterien und filamentösen Pilzen. Die Feststoff- Flüssig- Extraktion wird dabei zur Isolierung der Sekundärmetabolite genutzt. Das Myzel wird standardmäßig im Labormaßstab mit einer 30-minütigen Extraktion im Ultraschallbad behandelt. Die durchgeführten Versuche zeigen jedoch, dass andere Methoden des Leistungseintrages weniger Zeit beanspruchen, höhere Substanzausbeuten hervorbringen können und geringere Lösungsmittelvolumen zur Extraktion der Sekundärmetabolite genutzt werden können. Doch neben den genannten Vorteilen zeigte sich auch, dass der Verschmutzungsgrad mit intrazellulären Substanzen durch den mechanischen Energieeintrag zunehmen kann. (...) Neben der Feststoff- Flüssig- Extraktion des Myzels spielt auch die Extraktion eines standardmäßig eingesetzten Adsorberharzes XAD16 in der Arbeitsgruppe MWIS eine große Rolle. Dies wird zur Adsorption der Sekundärmetabolite aus der Fermentationsbrühe oder Überstand genutzt, nach der Fermentation mittels Filtration abgeerntet und anschließend extrahiert. Für diesen Schritt wurden verschiedene Downstreammethoden mit unterschiedlichen Lösungsmittelvolumen und Extraktionszeiten hinsichtlich der Substanzausbeute untersucht. (...)

Untersuchung des humanen Proteins NF110 als Bindungspartner viraler RNAs

In der vorliegenden Masterarbeit wurde das Protein nuclear factor 110 (NF110) in vitro rückgefaltet, chromatographisch gereinigt, durch den Zusatz von L-Arginin stabilisiert und seine Affinität gegenüber RNAs untersucht. Das Ausgangsmaterial wurde mittels Dialyse zurückgefaltet und über drei aufeinander folgende Chromatographieschritte gereinigt: mittels Kationenaustauschchromatographie (capture) zur Entfernung von Fremdproteinen, Größenausschlusschromatographie (intermediate) zur Trennung des monomeren Proteins von höher-oligomeren Spezies und der Affinitätschromatographie (polishing). Diese Proteinlösung wurde unter Zusatz von 500 mM L-Arginin gelagert um eine Proteinaggregation zu unterbinden. Durch Streulichtmessungen und eine analytische Ultrazentrifugation konnte erfolgreich nachgewiesen werden, dass NF110 erst in Puffern mit mindestens 200 mM L-Arginin stabil vorliegt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte erfolgreich bestimmt werden, dass NF110 zwischen doppelsträngiger RNA und DNA diskriminiert, während es gegenüber einzel- bzw. doppelsträngiger RNA ähnlich affin ist. Dies stellt einen großen Unterschied zu NF90 dar. Diese C-terminal verkürzte Variante interagiert mit einzelsträngiger RNA in sehr geringerem Umfang als mit doppelsträngiger RNA (Schmidt, 2015). Daher kann vermutet werden, dass der C-Terminus, insbesondere das dort befindliche GQSY-Motiv, für die Spezifität gegenüber den RNAs verantwortlich ist. Ein weiterer Fokus der Arbeit lag auf dem Einfluss von L-Arginin bei der RNA-Bindung. Mit Hilfe einer linearen freien Enthalpiebeziehung (LFER) konnte so eine Dissoziationskonstante für nicht aggregierendes NF110 ohne L-Arginin ermittelt werden. Außerdem wurde ersichtlich, dass dieser Stabilisator zwar die Aggregation hemmt, aber nur marginal die RNA-Bindung des Proteins beeinflusst