PARTICIPACIÓN DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO EN LA RESPUESTA DE CARDIOMIOCITOS DURANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON TRYPANOSOMA CRUZI. Characterization of the cardiac innate immune response during Trypanosoma cruzi experimental infection.

La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, constituye la principal miocarditis infecciosa a nivel mundial. Crecientes evidencias revelan que la respuesta inmune innata tendría un rol determinante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. La inmunidad innata es la primera línea de defensa, no específica, preprogramada para combatir agentes infecciosos. Este sistema censa la presencia de antígenos extraños a través de los receptores tipo toll (TLR) produciendo citoquinas y activando mecanismos microbicidas. Sin embargo, los TLRs también se hayan distribuidos en las células parenquimales no inmunes, jugando un importante rol tanto en la defensa como en la homeostasis de cada tejido. Durante la etapa aguda de la infección, el T. cruzi invade y se replica dentro de una amplia variedad de células y tejidos. Pero posteriormente, los parásitos son efectivamente eliminados de la mayoría de los tejidos persistiendo durante toda la vida en las células del músculo cardíaco y esquelético de los pacientes infectados. Debido a que el mantenimiento de la célula cardíaca infectada es crítica para la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos que participan en la sobrevida de los cardiomiocitos están siendo foco de nuestro estudio. Hemos demostrado, que la infección ejerce efectos antiapoptóticos sobre células cardíacas aisladas. Nuestra hipótesis es que la inmunidad innata cardíaca estaría involucrada en el mantenimiento de la sobrevida de los miocitos así como en la defensa contra el parásito. Objetivo general: determinar la participación de la respuesta inmune innata cardíaca en el desarrollo de la enfermedad de Chagas experimental murina. Objetivos específicos: 1) Analizar el compromiso de TLRs en la respuesta anti-apoptótica y de autofagia de cardiomiocitos aislados de ratones salvajes y de ratones deficientes en TLR4, TLR2 y en MyD88, molécula adaptadora de la señalización por TLRs, sometidos a la infección con el parásito. 2) Determinar la importancia de la actividad cisteín proteasa parasitaria en el grado de infectividad y la sobrevida de cultivos primarios de ratones salvajes infectados con parásitos transgénicos que poseen disminuída o nula actividad cisteín proteasa. 3) Establecer la cinética de expresión de TLR2/TLR6, TLR4 y TLR9, factores antiapoptóticos (Bcl-2, Bcl-xL, etc.), daño cardíaco y la carga parasitaria en el tejido cardíaco de ratones infectados salvajes y/o deficientes antes mencionados. Materiales y Métodos: Los animales serán infectados i.p. con 5x103 parásitos y se determinará la cinética de expresión de los mediadores mencionados por western blot e inmunofluorescencia, la carga parasitaria será determinada por qRT-PCR. Como controles se procesarán animales inyectados con solución salina. En cultivos primarios de cardiomiocitos de ratones neonatos salvajes y deficientes infectados se estudiará la carga parasitaria, la activación de los mecanismos microbicidas (producción de óxido nítrico, metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, ciclooxigenasa, etc.), producción de citoquinas y expresión de moléculas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, etc.). Se explorará la tasa de apoptosis en cultivos deprivados de suero. La autofagia se analizará por microscopia electrónica. Cultivos controles serán mantenidos en medio o tratados con ligandos de los diferentes TLRs. Resultados preliminares sugieren que tanto TLR2 como Bcl-2 se incrementan en tejido cardíaco infectado. Esto nos lleva a profundizar en los mecanismos observados en cultivos y estudiarlos en un modelo in vivo, analizando la posible importancia que tiene la inmunidad innata cardíaca en el control del establecimiento de la infección. La comprensión de los mecanismos que mantienen la sobrevida de los cardiomiocitos y su respuesta a la infección es importante ya que el conocimiento de las bases moleculares es fundamental para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. Chagas disease is endemic in Central and South America and causes the most common myocarditis worldwide. We have previously reported that the cardiotrophic parasite Trypanosoma cruzi, its etiological agent, protects cardiomyocytes against apoptosis induced by growth factor deprivation activating the PI3K/Akt and MEK1/ERK signaling pathways. Recent studies have shown that local innate immunity plays a key role in initiating and coordinating homeostatic as well as defense responses in the heart. One of the mechanisms by which the innate immune system senses the presence of foreign antigens is through TLRs. The stimulation of these receptors leads to the activation and nuclear translocation of NF-kB transcription factor and the production of cytokines. Proinflammatory cytokines, in turn, appear to play a central role in the orchestration and timing of the intrinsic cardiac stress response providing, under different situations, instantaneous anti-apoptotic cytoprotective signals, which allow tissue repair and/or remodeling. The aim of the present project is to study the cardiomyocyte innate immune responses to T. cruzi infection and its role in target cell protection from apoptosis. Specific objectives: 1) Study the mechanism triggered by TLR in the anti-apoptotic response and parasite load of infected cardiomyocyte primary cultures from wild type and mice deficient in TLR2, TLR4 or MyD88. 2) Determine the effect of parasite cisteín protease activity on primary cultures from wild type mice. 3) Determine the TLR signaling-involvement in parasite load and survival indicators in deficient mice. Preliminary results showed us that cardiac-TLR2 may be involved in the anti-apoptotic effect elicited by the parasite and prompted us to establish the mechanisms triggered by the innate immunity that mediate parasite persistence within the host cell.

Rol de la infección bacteriana en el desarrollo y progresión del cáncer prostático. Influence of bacterial infection in the development and progression of prostatitic cancer.

En la patogénesis del cáncer, factores microambientales como la inflamación están estrechamente vinculados al desarrollo y crecimiento tumoral, sustentando la clásica hipótesis de Virchow del origen del cáncer en sitios de inflamación crónica, la cual incitaría a carcinogénesis por múltiples factores. Estudios previos en este laboratorio evidenciaron en un modelo de prostatitis bacteriana agudo con E. coli, profundos cambios estromales semejantes al "estroma reactivo", con predominio de miofibroblasto, que se genera en el cáncer. En correlación, existe abundante evidencia obtenida en modelos experimentales animales confirmando que el microambiente estromal en el cual se desarrollan los tumores epiteliales influencia profundamente la progresión tumoral. El rol protagónico del estroma del huésped en el crecimiento neoplásico, también se ha demostrado inoculando la misma línea tumoral en diferentes tejidos y analizando su comportamiento en comparación con su implantación en el sitio anatómico original del tumor (implante ortotópico); otro factor clave en la repuesta del huésped al tumor está dado por el infiltrado de células inmunes que puede favorecer o limitar el crecimiento tumoral de acuerdo al perfil de citoquinas que secreten. Teniendo en cuenta estos antecedentes, este proyecto tiene como Objetivo General estudiar la influencia de la infección bacteriana crónica en la inducción y evolución del cáncer prostático. Para ello trabajaremos in vivo con dos formas de formas de Tumores Prostáticos, un Tumor Inducido por combinación del carcinógeno N-methyl-N-nitrosourea (MNU) y testosterona; el segundo mediante Transplante Ortotópico de células tumorales prostáticas MAT-LU. En ambos modelos se inducirá previamente una prostatitis bacteriana, a fin de estudiar los efectos de la prostatitis en la inducción del tumor en el primer modelo, y en la implantación de las células tumorales en el segundo. También se inducirá prostatitis después de establecido el tumor por ambos procedimientos, a fin de determinar si la prostatitis bacteriana modula la progresión neoplásica. Finalmente, proponemos un modelo in vitro que permita estudiar la interacción tumor/estroma separado de la influencia del sistema inmune. A tal fin se utilizarán co-cultivos combinando células tumorales con estromales modificadas de diferente modo. La Inducción de Tumores Prostáticos se realizará en ratas de la cepa Wistar adultas, en las cuales se inducirán lesiones displásicas y neoplásicas siguiendo protocolos de carcinogénesis prostática por MNU, para lo cual es necesario el tratamiento previo con acetato de ciprosterona y propionato de testosterona, seguido por administración crónica de testosterona. Los estudios con Transplante Ortotópico de células tumorales se realizarán en ratas Copenhagen. La influencia de la infección bacteriana en el desarrollo tumoral será investigada inyectando E. coli intraprostáticamente: Se realizará Análisis Macroscópico, de Parámetros Morfológicos de las lesiones tumorales, grado de malignidad, extensión e invasión de las lesiones de acuerdo a consensos internacionales, y Bioquímicos mediante análisis de la expresión, por IHQ y WB, de fosfatasa ácida, citoqueratina 8, Prostatic Binding Protein, PTEN (gen supresor tumoral) y el receptor de Andrógenos, todos parámetros de actividad y de transformación celular. También se evaluará apoptosis por TUNEL y proliferación celular. Los cambios del compartimiento estromal en respuesta al implante tumoral y la influencia de la inflamación bacteriana se evaluarán mediante análisis morfológico e inmunocitoquímico, caracterizando el fenotipo de las poblaciones celulares con a-actina, vimentina, calponina y tenascina. Se espera que los resultados aporten evidencias acerca de las interacciones bidireccionales entre células neoplásicas prostáticas y su entorno estromal, que en un futuro puedan servir como base para establecr estrategias para prevenir y/o modificar el crecimiento neoplásico.

Supresión oral de la Encefalomielitis autoinmune experimental por antígenos sinaptosomales. Oral suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by sinaptosomal antigens.

La inducción de las manifestaciones clínicas de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) involucra una reacción inmune celular contra determinantes antigénicos del sistema nervioso central (SNC), principalmente contra la proteína básica de mielina (PBM). Atento a la reactividad inmunológica cruzada previamente descrita entre la PBM y la proteína neuronal Sinapsina I, estudiaremos el efecto de la administración oral de moléculas híbridas (LTBSC, LTBSABC) entre la subunidad B de la toxina lábil al calor de Escherichia coli (LTB) con péptidos de Sinapsina (dominios C y ABC de la molécula) sobre el desarrollo de la EAE en ratas Wistar. Se administrarán oralmente los antígenos híbridos de LTB, LTB y péptidos de sinapsina no acoplados previa o posteriormente a la inducción activa de la EAE. Se estudiará la aparición de las manifestaciones clínicas de la enfermedad y se caracterizará la respuesta histopatológica e inmunológica (reacción de DTH, activación de linfocitos T, respuesta inmune humoral, vías de activación de macrófagos, patrón de citocinas) y los eventos celulares e inmunes desencadenados a nivel local luego de administrar los antígenos recombinantes en sistemas in vivo e in vitro. Estos estudios acerca de la respuesta autoinmune contra componentes de mielina y sinaptosomales en EAE tienen como objetivo poder comprender los diferentes mecanismos subyacentes involucrados en el desarrollo y regulación de esta enfermedad experimental. Específicamente este proyecto relacionado a la supresión de los síntomas clínicos como así también las alteraciones neuropatológicas del SNC de la EAE a través de un proceso de supresión oral de la enfermedad no invasivo utilizando tanto antígenos mielínicos como sinaptosomales fusionados a subunidades B (atóxicas) de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), es de suma importancia para un estudio posterior en las patologías humanas relacionadas y su uso en el diagnóstico, pronóstico y/o terapia de las mismas.