USO DE MARCADORES TUMORALES COMO VALORES PREDICTIVOS DE MALIGNIDAD EN EL TUMOR VENEREO TRANSMISIBLE CANINO

Entre los tumores frecuentes en los caninos, se encuentra el denominado Tumor Venéreo Transmisible (TVT). El origen celular exacto del TVT no está claro, aunque estudios inmunohistoquímicos muestran las características de compatibilidad con células histiocíticas. En nuestra región se diagnostican con frecuencia aunque no se tienen datos precisos de su incidencia. El diagnóstico precoz es la mejor herramienta utilizada tanto en medicina veterinaria como humana para el control de tumores. El tumor puede ser muy agresivo localmente, rara vez metastiza. El manejo terapéutico no ha sido sencillo. Se han probado distintos tratamientos como cirugía, radioterapia, bioterapia y quimioterapia- La quimioterapia ha demostrado ser el tratamiento mas efectivo y la droga mas utilizada es el sulfato de vincristina, pero el tiempo del tratamiento hasta la remisión completa varía ampliamente entre individuos. Si bien existen estadificaciones clínicas y diagnósticos citológicos e histológicos que permiten establecer el grado de malignidad, los mismos tienen componentes subjetivos por su naturaleza cualitativa. Los marcadores tumorales se han utilizado especialmente en el establecimiento de un pronóstico acertado. Entre estos están las Regiones Organizadoras Nucleolares (NORs), que pueden colorearse con tinciones argénticas (AgNOR). dichas regiones corresponden a segmentos de cromosomas que contienen genes ribosomales. Por otro lado, existen marcadores de proliferación celular como el anticuerpo monoclonal Ki 67, el cual detecta un antígeno nuclear que se expresa en las células que entran al ciclo celular (fases G1, S, G2 y mitosis), proporcionando una medida directa de la fracción de crecimiento del tejido. El uso de estos marcadores fue eficiente en patología humana, mientras en veterinaria existen escasos reportes La mayoría de los marcadores se han usado sobre muestras histológicas, existiendo escasa información de su uso en muestras citológicas. Conocer el diagnóstico y el pronóstico del tumor relacionándolo con el tratamiento instaurado permitiría predecir las expectativas y calidad de vida del paciente. El contar en Medicina Veterinaria con una herramienta cuantitativa como son los marcadores tumorales que soporte las observaciones subjetivas que aporta el diagnóstico citomorfológico, podría contribuir a establecer de manera confiable el pronóstico del paciente con TVT, así como también definir el modelo terapéutico. Por esto sería importante la búsqueda de técnicas rápidas y seguras que permitan establecer pronósticos cada vez más precisos.

PARTICIPACIÓN DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO EN LA RESPUESTA DE CARDIOMIOCITOS DURANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON TRYPANOSOMA CRUZI. Characterization of the cardiac innate immune response during Trypanosoma cruzi experimental infection.

La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, constituye la principal miocarditis infecciosa a nivel mundial. Crecientes evidencias revelan que la respuesta inmune innata tendría un rol determinante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. La inmunidad innata es la primera línea de defensa, no específica, preprogramada para combatir agentes infecciosos. Este sistema censa la presencia de antígenos extraños a través de los receptores tipo toll (TLR) produciendo citoquinas y activando mecanismos microbicidas. Sin embargo, los TLRs también se hayan distribuidos en las células parenquimales no inmunes, jugando un importante rol tanto en la defensa como en la homeostasis de cada tejido. Durante la etapa aguda de la infección, el T. cruzi invade y se replica dentro de una amplia variedad de células y tejidos. Pero posteriormente, los parásitos son efectivamente eliminados de la mayoría de los tejidos persistiendo durante toda la vida en las células del músculo cardíaco y esquelético de los pacientes infectados. Debido a que el mantenimiento de la célula cardíaca infectada es crítica para la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos que participan en la sobrevida de los cardiomiocitos están siendo foco de nuestro estudio. Hemos demostrado, que la infección ejerce efectos antiapoptóticos sobre células cardíacas aisladas. Nuestra hipótesis es que la inmunidad innata cardíaca estaría involucrada en el mantenimiento de la sobrevida de los miocitos así como en la defensa contra el parásito. Objetivo general: determinar la participación de la respuesta inmune innata cardíaca en el desarrollo de la enfermedad de Chagas experimental murina. Objetivos específicos: 1) Analizar el compromiso de TLRs en la respuesta anti-apoptótica y de autofagia de cardiomiocitos aislados de ratones salvajes y de ratones deficientes en TLR4, TLR2 y en MyD88, molécula adaptadora de la señalización por TLRs, sometidos a la infección con el parásito. 2) Determinar la importancia de la actividad cisteín proteasa parasitaria en el grado de infectividad y la sobrevida de cultivos primarios de ratones salvajes infectados con parásitos transgénicos que poseen disminuída o nula actividad cisteín proteasa. 3) Establecer la cinética de expresión de TLR2/TLR6, TLR4 y TLR9, factores antiapoptóticos (Bcl-2, Bcl-xL, etc.), daño cardíaco y la carga parasitaria en el tejido cardíaco de ratones infectados salvajes y/o deficientes antes mencionados. Materiales y Métodos: Los animales serán infectados i.p. con 5x103 parásitos y se determinará la cinética de expresión de los mediadores mencionados por western blot e inmunofluorescencia, la carga parasitaria será determinada por qRT-PCR. Como controles se procesarán animales inyectados con solución salina. En cultivos primarios de cardiomiocitos de ratones neonatos salvajes y deficientes infectados se estudiará la carga parasitaria, la activación de los mecanismos microbicidas (producción de óxido nítrico, metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, ciclooxigenasa, etc.), producción de citoquinas y expresión de moléculas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, etc.). Se explorará la tasa de apoptosis en cultivos deprivados de suero. La autofagia se analizará por microscopia electrónica. Cultivos controles serán mantenidos en medio o tratados con ligandos de los diferentes TLRs. Resultados preliminares sugieren que tanto TLR2 como Bcl-2 se incrementan en tejido cardíaco infectado. Esto nos lleva a profundizar en los mecanismos observados en cultivos y estudiarlos en un modelo in vivo, analizando la posible importancia que tiene la inmunidad innata cardíaca en el control del establecimiento de la infección. La comprensión de los mecanismos que mantienen la sobrevida de los cardiomiocitos y su respuesta a la infección es importante ya que el conocimiento de las bases moleculares es fundamental para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. Chagas disease is endemic in Central and South America and causes the most common myocarditis worldwide. We have previously reported that the cardiotrophic parasite Trypanosoma cruzi, its etiological agent, protects cardiomyocytes against apoptosis induced by growth factor deprivation activating the PI3K/Akt and MEK1/ERK signaling pathways. Recent studies have shown that local innate immunity plays a key role in initiating and coordinating homeostatic as well as defense responses in the heart. One of the mechanisms by which the innate immune system senses the presence of foreign antigens is through TLRs. The stimulation of these receptors leads to the activation and nuclear translocation of NF-kB transcription factor and the production of cytokines. Proinflammatory cytokines, in turn, appear to play a central role in the orchestration and timing of the intrinsic cardiac stress response providing, under different situations, instantaneous anti-apoptotic cytoprotective signals, which allow tissue repair and/or remodeling. The aim of the present project is to study the cardiomyocyte innate immune responses to T. cruzi infection and its role in target cell protection from apoptosis. Specific objectives: 1) Study the mechanism triggered by TLR in the anti-apoptotic response and parasite load of infected cardiomyocyte primary cultures from wild type and mice deficient in TLR2, TLR4 or MyD88. 2) Determine the effect of parasite cisteín protease activity on primary cultures from wild type mice. 3) Determine the TLR signaling-involvement in parasite load and survival indicators in deficient mice. Preliminary results showed us that cardiac-TLR2 may be involved in the anti-apoptotic effect elicited by the parasite and prompted us to establish the mechanisms triggered by the innate immunity that mediate parasite persistence within the host cell.