Consecuencias del metabolismo de colina en Pseudomonas aeruginosa : Respuestas adaptativas en microorganismos

Objetivos Generales: Mediante el abordaje experimental desde el punto de vista fisiológico, bioquímico y molecular se pretende conocer la respuesta adaptativa de P. aeruginosa frente a diferentes estímulos ambientales tales como osmolaridad, pH y distintos tipos de ayuno nutricional. Objetivos Específicos: Aspectos Bioquímicos a) Se continuarán los estudios de las propiedades cinéticas y fisicoquímicas de la fosforilcolina fosfatasa de P. aeruginosa. b) Se caracterizarán los sistemas de transporte en P. aeruginosa para: compuestos de amonio cuaternario (colina, betaína, carnitina, N-trimetillisina); aminoácidos básicos (lisina, arginina) y ácidos (glutámico); poliaminas y Pi. Se tratará de establecer la presencia o ausencia de proteínas unidoras periplásmicas para estos compuestos. c) Se tratará de establecer la relación entre el metabolismo de colina y otros compuestos de amonio cuaternario con el metabolismo del ácido glutámico y trealosa en P. aeruginosa crecidas en medios iso e hiperosmolares obtenidos con soluciones salinas y solutos no ionizables. d) Se tratará de establecer en P. aeruginosa el recambio o destino metabólico del Pi y colina que se produce cuando la bacteria se enfrenta a diferentes situaciones nutricionales y otros tipos de estímulos tales como pHs extremos y distinta osmolaridad, tanto a nivel de proteínas periplásmicas, citosólicas, de membranas interna y citosólica, fosfolípidos, glucofosfolípidos, glucolípidos y lipopolisacáridos (LPS) y compuestos fosforilados de bajo peso molecular, ej. acetilfosfato, alarmonas, etc. Aspectos Genéticos y Moleculares a) Se obtendrán mutantes de P. aeruginosa con fenotipos característicos relacionados con los puntos anteriores. (...) b) Se construirá la librería genómica de P. aeruginosa en cósmido, plásmido y cDNA. Posteriormente se pretende la identificación, clonado y secuenciación de los genes relacionados con: 1) La síntesis de la fosfatasa ácida, colinesterasa y PLC. 2) El transporte de compuestos de amonio cuaternario, teniendo en cuanta que, al menos para colina, existen dos componententes, uno de alta y otro de baja afinidad. 3) La síntesis de las enzimas responsables de la oxidación de colina hasta betaína, vía la formación de aldehído de betaína. (...) 4) La síntesis de las enzimas responsables de la degradación de betaína hasta glicina. (...) 5) La síntesis de las enzimas responsables del metabolismo de carnitina en condiciones de alta y baja osmolaridad. (...) 6) La adaptabilidad de la bacteria al pH en condiciones de baja osmolaridad. (...)

Modificación de la actividad de células inmunocompetentes en criptococosis y distomatosis experimental

El objetivo de este proyecto es profundizar los conocimientos en las células que regulan las interacciones huésped-parásito en dos modelos experimentales diferentes donde se involucra la participación de Cryptococcus neoformans y Fasciola hepatica. En el primer modelo se continuará analizando el modelo de infección experimental con Cryptococcus neoformans. Para ello se estudiarán las modificaciones que ocurran en los mecanismos de activación del macrófago respecto a la generación de derivados tóxicos del oxígeno y derivados tóxicos del nitrógeno. Por otra parte, considerando que en células tímicas y células esplénicas de animales infectados con Cryptococcus neoformans se ha evideniciado la presencia de células con funciones supresoras; se determinará si el metabolismo de la L-arginina participa en esta actividad supresora. Cultivando células de timo y bazo se determinará la sensibilidad de estas células al óxido nítrico por medio de dadores químicos de NO y por el NO generado por macrófagos activados. Por otra parte se desarrollará un modelo de distomatosis experimental en ratas, en el cual se estudiarán las funciones accesorias de CP de ratas infectadas con Fasciola hepatica y la participación de los productos de excreción-secreción de este parásito en la modificación de estas funciones. Se analizarán las capacidades fagocíticas y presentadoras de antígeno en CP de ratas infectadas como así también en CP de animales inoculados con los productos excretores-secretores del parásito. Además se estudiará la acción de la CP de ratas infectadas con Fasciola hepatica sobre la respuesta proliferativa de células mononucleares de bazo de ratas normales estimuladas con mitógenos.

Estudios sobre la regulación del ciclo celular en cultivos de células: Papel de las poliaminas

La poliaminas son moléculas esenciales para el crecimiento, diferenciación y transformación celular. Se encuentran presentes en todo tipo de células y sus niveles endógenos están perfectamente controlados. Estudios recientes indican que los niveles de la arginina regularían el metabolismo de las poliaminas putrescina y espermidina. Este aminoácido produce óxido nítrico (ON), segundo mensajero implicado en la respuesta inmune, en la neurotransmisión y en el proceso inflamatorio. En este tipo de trabajo se propone desarrollar un sistema de detección para determinar la concentración de ON en tiempos cortos que permita conocer su relación con el metabolismo de las poliaminas. Por otra parte, el papel específico de las poliaminas en la regulación del ciclo celular es desconocido y en nuestro laboratorio se está estudiando el rol de estas moléculas en el ciclo de células normales y malignas; se propone determinar la expresión de la ciclina D1 a lo largo de este ciclo y su implicancia en situaciones de carencia de poliaminas endógenas. También se han relacionado a las poliaminas con la apoptosis o muerte celular programada (MCP), por lo que se intentará estudiar las variaciones durante el ciclo celular de la MCP de células normales y malignas y su relación a las poliaminas. Los resultados de estos estudios ampliarán el conocimiento del rol de las poliaminas y permitirá diseñar experimentos utilizando inhibidores de estas moléculas como anticancerígenos. Desde el punto de vista biotecnológico, el sistema detección de ON posibilitará determinar su concentración en tiempos cortos, aportando información de su rol metabólico. Esta metodología podrá aplicarse en otros sistemas.

Agentes deletéreos para Trypanosoma cruzi: Patogenia de la infección de placenta humana en la enfermedad congénita de Chagas, in vitro. Deleterious agents to Trypanosoma cruzi: Pathogenia of the human placenta infection in the congenital Chagas disease.

Trypanosoma cruzi, agente causal del Chagas, atraviesa la barrera placentaria y produce la enfermedad congénita. Objetivo general: Analizar si el T. cruzi, agente causal del Chagas, produce alteraciones trofoblásticas de las vellosidades coriónicas mediadas por óxido nítrico (principal agente deletéreo contra T. cruzi) y estrés oxidativo con variaciones que pudieran depender de la disponibiidad de L-arginine, sobre placentas en modelos in vitro de co-cultivos de explantos de vellosidades coriónicas, de sinciciotrofoblasto aislado y de células derivadas del trofoblasto de placentas humanas en interacción con distintas cepas del Trypanosoma cruzi, que pudieran dar alguna luz en la explicación de mecanismos involucrados en la infección placentaria y en algunos síndromes clínicos de la transmisión congénita del Chagas. Objetivos Específicos: a) Describir alteraciones estructurales y presencia de T. cruzi en vellosidades coriónicas de placentas humanas procedentes de co-cultivos con Trypanosoma cruzi in vitro (y sus respectivos controles), mediante técnicas histológicas y PCR analizando secuencias de ADN específicas del parásito.b) Establecer la localización y expresión proteica y la expresión transcripcional de las isoformas II y III de la Öxido Nítrico Sintasa sobre la misma población muestral de (a) mediante técnicas inmunohistoquímica, RT-PCR y semicuantificación con software adecuado. c) Analizar la susceptibilidad a la infección por el T. cruzi del citotrofoblasto (CTB) y sinciciotrofoblasto (STB) placentario aislado in vitro. d) Determinar concentraciones de óxido nítrico y estrés oxidativo del sinciciotrofoblasto (STB) aislado ante la infección por T. cruzi. e) Relacionar concentraciones de L-arginina con infección del trofoblasto aislado. f) Relacionar inhibiciones de la eNOS y de la arginasa con infección trofoblástica y óxido nítrico producido.Se emplearán métodos y técnicas de Biología celular y molecular, mediciones hormonales, enzimáticas, proteicas, parasitarias y bioquímicas en medios sobrenadantes de cultivo, de inmuno-detección de epitopes proteicos en tejidos, expresión de ARN por RT-PCR, Western blot, detección de DNA en tejidos por PCR, Cuantificaciones morfométricas. En general, el presente proyecto podría redundar en beneficios para un sector de la población de las áreas endémicas para esta enfermedad de bajos recursos económicos, sociales y culturales, mediante la obtención de datos que pudieran explicar algunos mecanismos de síndromes clínicos descriptos en esta patología y que pudieran participar en la transmisión congénita de la enfermedad de Chagas.

Influencia de aines sobre marcadores de osteoartrosis. Antiinflammatory drugs influence on osteoarthritis markers.

La osteoartritis es una enfermedad crónica y degenerativa del cartílago articular con elevada prevalencia en pacientes mayores de 60. En su etiología confluyen alteraciones mecánicas y bioquímicas del sistema músculo-esquelético que provocan disbalance entre síntesis y degradación condral., con deterioro y pérdida tisular. El cartílago articular es un tejido paucicelular. Sus escasos condrocitos se dispersan en una matriz moduladora bioquímica y morfológica. La homeostasis osteocondral resume acciones estimulantes, inhibidoras y reguladoras de citokinas e interleukinas Son péptídos liberados por las membranas celulares al líquido sinovial, que difunden hacia el cartílago en tanto órgano blanco. Importante avance en la fisiopatología de la inflamación fue el descubrimiento del rol del óxido nítrico (ON) derivado metabólico de la arginina por acción de las ON-Sintasas (ONS). Estimula la producción de colagenasas (MMP-1), que intensifican la resorción de proteoglicanos En OA también aumenta el factor de necrosis tumoral TNFa, rápidamente activado por su enzima convertidora TACE. Objetivo Evaluar efectos de antiinflamatorios sobre cultivo de cartílago articular de pacientes con osteoartritis y cuantificar in vitro producción de MMPs, relación NO2/NO3. IL6 y TNFa. Material y métodos: En sobrenadante de los cultivos se determinarán por espectrofotometría niveles de NO-2 y NO-3 (Griess et al, 1992) y usando ELISA doble sándwich la actividad de colagenasa (MMP-1), IL-6 y TNF-a, contrastadas con anticuerpos monoclonales .Los parámetros obtenidos con y sin agregado de fármacos, se correlacionarán con la microscopía óptica.