PARTICIPACIÓN DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO EN LA RESPUESTA DE CARDIOMIOCITOS DURANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON TRYPANOSOMA CRUZI. Characterization of the cardiac innate immune response during Trypanosoma cruzi experimental infection.

La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, constituye la principal miocarditis infecciosa a nivel mundial. Crecientes evidencias revelan que la respuesta inmune innata tendría un rol determinante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. La inmunidad innata es la primera línea de defensa, no específica, preprogramada para combatir agentes infecciosos. Este sistema censa la presencia de antígenos extraños a través de los receptores tipo toll (TLR) produciendo citoquinas y activando mecanismos microbicidas. Sin embargo, los TLRs también se hayan distribuidos en las células parenquimales no inmunes, jugando un importante rol tanto en la defensa como en la homeostasis de cada tejido. Durante la etapa aguda de la infección, el T. cruzi invade y se replica dentro de una amplia variedad de células y tejidos. Pero posteriormente, los parásitos son efectivamente eliminados de la mayoría de los tejidos persistiendo durante toda la vida en las células del músculo cardíaco y esquelético de los pacientes infectados. Debido a que el mantenimiento de la célula cardíaca infectada es crítica para la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos que participan en la sobrevida de los cardiomiocitos están siendo foco de nuestro estudio. Hemos demostrado, que la infección ejerce efectos antiapoptóticos sobre células cardíacas aisladas. Nuestra hipótesis es que la inmunidad innata cardíaca estaría involucrada en el mantenimiento de la sobrevida de los miocitos así como en la defensa contra el parásito. Objetivo general: determinar la participación de la respuesta inmune innata cardíaca en el desarrollo de la enfermedad de Chagas experimental murina. Objetivos específicos: 1) Analizar el compromiso de TLRs en la respuesta anti-apoptótica y de autofagia de cardiomiocitos aislados de ratones salvajes y de ratones deficientes en TLR4, TLR2 y en MyD88, molécula adaptadora de la señalización por TLRs, sometidos a la infección con el parásito. 2) Determinar la importancia de la actividad cisteín proteasa parasitaria en el grado de infectividad y la sobrevida de cultivos primarios de ratones salvajes infectados con parásitos transgénicos que poseen disminuída o nula actividad cisteín proteasa. 3) Establecer la cinética de expresión de TLR2/TLR6, TLR4 y TLR9, factores antiapoptóticos (Bcl-2, Bcl-xL, etc.), daño cardíaco y la carga parasitaria en el tejido cardíaco de ratones infectados salvajes y/o deficientes antes mencionados. Materiales y Métodos: Los animales serán infectados i.p. con 5x103 parásitos y se determinará la cinética de expresión de los mediadores mencionados por western blot e inmunofluorescencia, la carga parasitaria será determinada por qRT-PCR. Como controles se procesarán animales inyectados con solución salina. En cultivos primarios de cardiomiocitos de ratones neonatos salvajes y deficientes infectados se estudiará la carga parasitaria, la activación de los mecanismos microbicidas (producción de óxido nítrico, metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, ciclooxigenasa, etc.), producción de citoquinas y expresión de moléculas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, etc.). Se explorará la tasa de apoptosis en cultivos deprivados de suero. La autofagia se analizará por microscopia electrónica. Cultivos controles serán mantenidos en medio o tratados con ligandos de los diferentes TLRs. Resultados preliminares sugieren que tanto TLR2 como Bcl-2 se incrementan en tejido cardíaco infectado. Esto nos lleva a profundizar en los mecanismos observados en cultivos y estudiarlos en un modelo in vivo, analizando la posible importancia que tiene la inmunidad innata cardíaca en el control del establecimiento de la infección. La comprensión de los mecanismos que mantienen la sobrevida de los cardiomiocitos y su respuesta a la infección es importante ya que el conocimiento de las bases moleculares es fundamental para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. Chagas disease is endemic in Central and South America and causes the most common myocarditis worldwide. We have previously reported that the cardiotrophic parasite Trypanosoma cruzi, its etiological agent, protects cardiomyocytes against apoptosis induced by growth factor deprivation activating the PI3K/Akt and MEK1/ERK signaling pathways. Recent studies have shown that local innate immunity plays a key role in initiating and coordinating homeostatic as well as defense responses in the heart. One of the mechanisms by which the innate immune system senses the presence of foreign antigens is through TLRs. The stimulation of these receptors leads to the activation and nuclear translocation of NF-kB transcription factor and the production of cytokines. Proinflammatory cytokines, in turn, appear to play a central role in the orchestration and timing of the intrinsic cardiac stress response providing, under different situations, instantaneous anti-apoptotic cytoprotective signals, which allow tissue repair and/or remodeling. The aim of the present project is to study the cardiomyocyte innate immune responses to T. cruzi infection and its role in target cell protection from apoptosis. Specific objectives: 1) Study the mechanism triggered by TLR in the anti-apoptotic response and parasite load of infected cardiomyocyte primary cultures from wild type and mice deficient in TLR2, TLR4 or MyD88. 2) Determine the effect of parasite cisteín protease activity on primary cultures from wild type mice. 3) Determine the TLR signaling-involvement in parasite load and survival indicators in deficient mice. Preliminary results showed us that cardiac-TLR2 may be involved in the anti-apoptotic effect elicited by the parasite and prompted us to establish the mechanisms triggered by the innate immunity that mediate parasite persistence within the host cell.

Terapéutica racional, mediante indicadores de eficacia antimicrobiana, de la mastitis caprina utilizando marbofloxacina y cefquinoma. Rational therapeutics, indicators of antimicrobial efficiency in the mastitis goats using marbofloxacine and cefquinome

La producción de leche de cabra es considerada en nuestro país, y en la provincia de Córdoba, una alternativa productiva para el desarrollo sustentable y socio – económico de la población. Por otra parte, existe una mayor demanda del mercado nacional e internacional de esta leche, por lo que los productores deben garantizar la seguridad y calidad de la misma de acuerdo a las normas vigentes. Es por ello que el control y tratamiento de las diferentes enfermedades es de vital importancia tanto para maximizar la producción del hato como para cumplir con los cánones de seguridad exigidos. En este contexto la mastitis caprina es una de las enfermedades que afecta la productividad del sector, y para controlarla una de las medidas a emplear es la terapéutica con antimicrobianos. Se trabajará en este proyecto con marbofloxacina y cefquinoma, estableciendo pautas racionales (eficaces y seguras) para su empleo en la afección a nivel regional. Los indicadores de eficacia estarán fijados de acuerdo a los parámetros integrados de farmacocinética (FC) y farmacodinamia (FD). Estos últimos (FD) serán calculados a través de la determinación concentraciones inhibitorias mínimas de cepas bacterianas aisladas de mastitis caprinas en Córdoba. Se establecerán los parámetros farmacocinéticos a dosis únicas y múltiples para la marbofloxacina (5 mg/kg IV, IM) y cefquinoma (2 mg/kg IV, IM e IMM) a partir de muestras de suero y leche de cabras Anglo Nubian (n = 6 por antimicrobiano; diseño cruzado en función de la ruta de administración). Se determinarán sus concentraciones en dichos fluidos, por cromatografía líquida de alta precisión. Los resultados FC/FD para ambos medicamentos se compararán con parámetros recomendados por expertos para cada tipo de antimicrobiano y se utilizarán como medida para recomendar una terapéutica racional, fundamental para optimizar la posología, garantizar la eficacia clínica, y reducir al mínimo la selección y propagación de cepas resistentes de agentes patógenos. The production of milk of goat is considered the province of Cordoba, a productive alternative for the sustainable development and partner - economically of the population. There is a major demand of the domestic and international market of this milk, for what the producers must guarantee the safety and quality of the same one of agreement to the in force procedure. It is for it that the control and treatment of the different diseases performs vital importance so much to maximize the production of the herd as to expire with the safety demanded. In this context the mastitis goat is one of the diseases that affect the productivity of the sector, and to control her one of the measures to using is the therapeutics with antimicrobial. One will be employed at this project with marbofloxacine and cefquinome, establishing rational guidelines (effective and sure) for his employment in the affection to regional level. The indicators of efficiency will be fixed in agreement to the integrated parameters of pharmacokinetics (PK) and pharmacodinamics (PD). The latter (PK) will be calculated across the determination inhibitory minimal concentrations of bacterial strains isolated of mastitis goat in Córdoba. The parameters will be established pharmacokinetics to the only and multiple doses for the marbofloxacine (5 mg/kg the IV, IM) and cefquinome (2 mg/kg the IVth, IM and IMM), From samples of whey and milk of goats Anglo Nubian (n = 6 for antimicrobial; design crossed depending on the route of administration). Its concentrations will decide in the above mentioned fluids, for liquid chromatography of high precision. The results PK/PD for both antimicrobial will be compared with parameters recommended by experts for every type of antimicrobial and will be in use as measure for recommending a rational, fundamental therapeutics for optimizing the dosage, for guaranteeing the clinical efficiency, and to reduce to the minimum the selection and spread of resistant of pathogenic agents.