Electroquímica de sustancias de interés en los sistemas agroalimentario y de sanidad animal. Desarrollo de biosensores electroquímicos. Aplicaciones analíticas.

Se estudiarán los mecanismos de reacción electroquímica de las micotoxinas (metabolitos tóxicos generados por hongos) citrinina (CIT), patulina (PAT) y moniliformina (MON), de los antioxidantes naturales alfa, beta, gama y delta tocoferoles, de los flavonoides fisetina (FIS), morina (MOR), luteolina (LUT), rutina (RUT), buteina (BUT), naringenina (NAR) y miricetina (MIR) y de las hormonas esteroides estradiol (EDIOL), estrona (EONA) y estriol (ETRIOL). Por otra parte, se implementarán técnicas electroanalíticas para la detección y cuantificación de estos sustratos en muestras de matrices naturales que los contengan. Se realizará el diseño y caracterización de biosensores enzimáticos a partir de peroxidasas y/o fosfatasa alcalina para la determinación de la micotoxina CIT y de los flavonoides y, por otro, de inmunosensores para las micotoxinas ocratoxina A (OTA) y PAT y hormonas. Para el anclaje de enzimas y/o anticuerpos, se estudiarán las propiedades de electrodos modificados por monocapas autoensambladas, nanotubos de carbono y partículas magnéticas. Se usarán las técnicas de voltamperometría cíclica, de onda cuadrada y de redisolución con acumulación adsortiva, espectroscopías de impedancia electroquímica, electrólisis a potencial controlado, uv-vis e IR, microbalanza de cristal de cuarzo y microscopías de alta resolución (SEM, TEM, AFM). La importancia de este proyecto apunta a la obtención de nuevos datos electroquímicos de los sustratos indicados y conocimientos relacionados con la aplicación de electrodos modificados en la preparación de biosensores y en el desarrollo de técnicas alternativas para la determinación de los analitos mencionados precedentemente.

Mejoramiento de insecticidas de banda verde por incorporación en ciclodextrinas, co-cristales y niosomas

La aplicación de agroquímicos para proteger granos y vegetales es una parte importante de los procedimientos corrientes en el manejo integrado de plagas ya que 20- 40% de la producción mundial potencial se pierde cada año por plagas, malezas y enfermedades. La necesidad de modificar la naturaleza química de los pesticidas para hacerlos más amigables con el ambiente llevó al desarrollo de un gran número de pesticidas clasificados como de banda verde, menos tóxicos, menos contaminantes y más selectivos que los tradicionales. Entre ellos se incluyen los insecticidas reguladores de crecimiento (IGR) seleccionados para este proyecto. Sin embargo, como compuestos orgánicos, tienen baja solubilidad acuosa lo que usualmente requiere de la formulación para su uso agrícola con otros vehículos como aceites o solventes que son contaminantes. Las regulaciones internacionales son cada vez mas estrictas en cuanto al uso de pesticidas por lo que es muy importante el desarrollo de tecnologías apropiadas para la utilización de compuestos de banda verde en los cultivos de la región. Nuestra propuesta se enfoca en generar formas alternativas (‘paquetes moleculares’ multi-componentes) de estos IGR que tengan mayor solubilidad acuosa que los compuestos no tratados, posibilitando su formulación en medio acuoso ambientalmente amigable. Las rutas elegidas comprenden la inclusión de los IGR dentro de sistemas nanoestructurados como la cavidad de ciclodextrinas (CDs), su incorporación en co-cristales y el encapsulado en niosomas. Las CDs son moléculas cíclicas biodegradables y no-tóxicas, formadas por unidades de glucosa. Los niosomas son vesículas microscópicas con un corazón acuoso encerrado por una membrana de surfactantes no iónicos que forman estructuras bicapa cerradas. Los co-cristales resultan de la interacción entre un compuesto y un co-formador con una estructura complementaria con el primero que permite la formación de enlaces puente H entre ambos. Los tres procesos involucran interacciones ‘suaves’ entre el IGR y la otra especie, dejando intacta la integridad biológica del insecticida. Se espera así obtener una diversidad de sistemas para diferentes opciones de formulación. Se eligieron IGR derivados de benzoilfenilurea (BPU), dibenzoilhidracinas (DBH) e isopreno, clasificados como clase U (unlikely to present acute hazard in normal use) por la OMS que tienen relativamente baja toxicidad para humanos y otros mamíferos, alta selectividad para insectos y muy poca solubilidad acuosa. Luego del aislamiento de las nuevas construcciones moleculares, se establecerán los efectos sobre las propiedades fisicoquímicas de los IGR. Se efectuarán estudios en estado sólido y en solución. Los complejos sólidos en CDs preparados por distintos métodos se examinarán por FTIR y RMN en estado sólido, microscopía FTIR, difracción de Rayos X de polvo y monocristales, TGA, DSC y microscopía ‘hot stage’. Por RMN, dicroísmo circular inducido y titulación calorimétrica isotérmica se estudiarán aspectos termodinámicos y estructurales de la inclusión en solución. El efecto sobre la solubilidad y estabilidad química de los IGR se investigará midiendo, respectivamente, las velocidades de disolución de los complejos y las velocidades de degradación de los IGR en presencia y ausencia de CDs. Para la obtención de co-cristales se usarán moléculas co-formadoras ‘GRAS’ (generally regarded as safe) elegidas en base a la complementariedad de sus grupos funcionales capaces de formar enlaces de H con los de los IGR. Las medidas de los puntos de fusión y velocidad de disolución son parámetros importantes para determinar su eventual utilidad. Los niosomas se prepararán en presencia de los IGR por distintas técnicas usando los surfactantes no iónicos y no tóxicos Tween 20 y 80, Span 20 y 80 y Brij-35. Se analizarán el tamaño y morfología de los agregados por microscopía de transmisión electrónica y se determinará la estabilidad en el tiempo de los niosomas por UV-vis.

APLICACIÓN DE SUSTANCIAS ACTIVAS DE PLANTAS MEDICINALES COMO ADITIVOS ALIMENTARIOS PARA REDUCIR LOS EFECTOS CITOGENOTÓXICOS E INMUNOTÓXICOS INDUCIDOS POR OCRATOXINA A Y MEJORAR LA PRODUCCIÓN PORCINA.

La producción porcina se encuentra entre una de las más importantes en el continente americano. La carne y subproductos de cerdos alimentados con cereales contaminados por ocratoxina A (OTA) son también fuente de contaminación para el hombre. Esta toxina producida por diferentes especies de Aspergillus presenta propiedades nefrotóxicas, genotóxicas e inmunosupresoras. Actualmente hay un considerable interés en la industria de alimentos por las sustancias vegetales como una alternativa para la prevención de las micotoxicosis. Baccharis articulata y Minthostachys verticillata son plantas medicinales argentinas que han sido ampliamente estudiadas por nuestro grupo de investigación, demostrando propiedades antivirales, antimicrobianas, inmunomoduladoras y antioxidantes. Estudios recientes mostraron que ácido clorogénico aislado de B. articulata redujo los efectos tóxicos de OTA en linfocitos de ratas. Además, estudios in vitro e in vivo demostraron ausencia de efectos citotóxicos y genotóxicos para estas sustancias vegetales. La hipótesis planteada es: El aceite esencial y/o uno de sus componentes puros (limoneno) obtenidos de M. verticillata y los componentes mayoritarios de B. articulata, poseen capacidad para reducir los efectos citogenotóxicos e inmunotóxicos inducidos por OTA, permitiendo su utilización como aditivos alimentarios para el mejoramiento de la producción porcina”. El objetivo del proyecto es caracterizar in vitro e in vivo la capacidad de sustancias obtenidas de plantas medicinales para revertir los efectos tóxicos inducidos por OTA y su posible aplicación como aditivos biológicos en los agroecosistemas de producción porcina. Se recolectará el material vegetal y se obtendrá aceite esencial y extractos acuosos, luego se realizará la identificación y cuantificación de los compuestos puros por CG o HPLC. Para los ensayos de citotoxicidad in vitro, células Vero y PBMCs de ratas Wistar, se enfrentarán a diferentes concentraciones de las sustancias vegetales SV y OTA y la viabilidad celular será evaluada por test de captación de rojo neutro, tinción de exclusión al azul de tripán y método colorimétrico de MTT. La apoptosis inducida por OTA y el efecto protector de las SV se evaluará mediante análisis de fragmentación de ADN por TUNEL, expresión de caspasas-3 y 8 por Western-Blot, expresión de Bax, y Bcl-2 por inmunohistoquímica, RT-PCR y real time PCR y análisis de externalización de fosfatidilserina (FS) por citometría de flujo. Para los estudios in vivo se utilizarán ratas Wistar que serán alimentadas diariamente y por 28 días con diferentes dietas que incluirán el alimento balanceado adicionado con distintas concentraciones de OTA, SV o combinaciones de OTA+SV. Luego, se sacrificarán los animales y se determinará el daño genotóxico inducido por OTA y la reducción del daño por las SV, mediante el test de micronúcleos. También se caracterizará la respuesta inmune de las ratas tratadas determinando la producción de Ac por ELISA, y la respuesta de las PBMCs a mitógenos por citometría de flujo. Teniendo en cuenta los resultados preliminares obtenidos con ácido clorogénico, se esperan obtener similares resultados tanto con el aceite esencial de M. verticillata así como con los otros compuestos. También se espera que las SV adicionadas a las raciones alimentarias contaminadas con OTA, reduzcan los daños citogenotóxicos e inmunotóxicos que produce esta micotoxina. El proyecto posee un fuerte impacto sobre el sector productivo dado que, los riesgos relacionados con la contaminación por micotoxinas están presentes en todos los ámbitos del sector agrícola-ganadero, afectando la economía de nuestro país. La incorporación de sustancias vegetales, inocuas, como aditivos alimentarios para disminuir los efectos tóxicos que causa OTA aportará conocimientos y tecnología a la industria pecuaria y alimentaria para mejorar la producción porcina así como la calidad de la carne y los subproductos destinados a consumo humano