Estudio citogenético en rumiantes de importancia económica mediante el cultivo de linfocitos

La citogenética dispone de métodos que permiten evaluar, directa o indirectamente, anomalías cromosómicas causantes de importantes mejoras o pérdidas ganaderas en varios países que las han estudiado. Por ello, diferentes países de zootecnia avanzada dan importancia creciente a los estudios citogenéticos, planteándose en algunos la necesidad o exigencia de realizar estudios del cariotipo en reproductores que se usan en centros de inseminación artificial, como de sus ascendientes o descendientes en test de progenie o bancos de embriones. Existen numerosas anomalías cromosómicas causantes de trastornos del desarrollo, neoplasias e infertilidad en el bovino, ovino, caprino, porcino, equino y otros animales domésticos. Las pérdidas estudiadas son cuantiosas y algunas de estas anomalías se refieren a menor tasa de fertilidad y cantidad de terneros. Debido a que la evaluación citogenética involucra etapas que consumen mucho tiempo, se desarrollan procedimientos semiautomáticos que reducen los tiempos significativamente, sin afectar la seguridad y consistencia. Por tal motivo, debido a que se dispone de un analizador digital de imágenes con el software base y software para el análisis del cariotipo, se capacitarán recursos humanos, que permitan luego agilizar la obtención de resultados. En Argentina, los estudios citogenéticos en el bovino son recientes, por lo que es necesario continuarlos y extenderlos a otros animales de importancia económica, afectiva o en vías de extinción, con el objeto de protegerlos de alteraciones hereditarias que resulten negativas. En este sentido, se han dispuesto algunas acciones que propenden a reglamentar la necesidad del cariotipado en reproductores dadores de semen y los que se emplean en la transferencia de embriones. No conocemos de estudios citogenéticos a nivel nacional en camélidos andinos, ovinos, caprinos, equinos, caninos y/o aves (...) 1. Objetivos Generales: - Desarrollar recursos humanos y técnicos para realizar estudios cariotípicos (cultivo y técnicas de bandeo) en animales de importancia económica. - Capacitación en análisis digital de imágenes para realizar el análisis cromosómico. - Realizar estudios cariotípicos en reproductores con problemas de fertilidad. - Realizar estudios cariotípicos en bovinos con diagnóstico serológico de leucosis. - Realizar estudios de prevalencia de anomalías cromosómicas en toros usados en inseminación artificial. - Ofrecer servicios de registros cariotípicos para reproductores empleados en inseminación artificial, transplante de embriones, animales con tumores o trastornos del desarrollo.

Desarrollo de técnicas quirúrgicas en transplantes, investigación y preparación de nuevas soluciones de preservación de órganos para transplantes (Solución Córdoba)

La preservación es la llave que comparte el éxito de un transplante. La técnica de preservación de órganos permite el traslado de éstos a diferentes hospitales que pueden estar a grandes distancias. (...) El objetivo de la preservación es mantener la viabilidad del órgano por el mayor tiempo posible para que en el momento de ser transplantado, reinicie sus funciones de inmediato. De lo contrario, una no función primaria significa retransplante de inmediato, en el caso del hígado. Una mala función primaria significa una mayor exposición inmunológica, lo que trae aparejado episodios reiterados de rechazo con la pérdida final del injerto. Muchos son los factores que pueden modificar el objetivo arriba planteado: cuestiones del donante, del receptor, de la preservación y de la cirugía del transplante. La hipotermia parece ser uno de los ítems más importantes en la preservación de los órganos; éstos deben ser enfriados lo más rápidamente posible entre 0º y 4º C. Pero durante la isquemia fría aparecen daños en órganos como el hígado y sus mecanismos no han sido todavía aclarados. En trabajos recientes la isquemia caliente daña el sistema hepatocelular y durante la isquemia fría el sistema vascular, específicamente el sinusoidal. No está muy claro si la presencia de coloides para mantener la presión osmótica es necesaria para evitar el edema celular. Hoy se sabe que la presencia de algunos coloides es necesaria para este objetivo. Otro de los puntales de la preservación es el daño causado por la reperfusión del órgano isquémico, mecanismos que aún no han sido totalmente comprendidos. Por tales motivos nuestro grupo de trabajo ha desarrollado una solución de preservación Córdoba con el objetivo de estudiar los mecanismos de isquemia-reperfusión. Objetivos generales: * Desarrollar y estudiar el comportamiento de la Solución Córdoba. * Desarrollar diferentes técnicas quirúrgicas en transplantes de hígado de manera de especificar cuál es la más apropiada para la preservación.

Rol de la infección bacteriana en el desarrollo y progresión del cáncer prostático. Influence of bacterial infection in the development and progression of prostatitic cancer.

En la patogénesis del cáncer, factores microambientales como la inflamación están estrechamente vinculados al desarrollo y crecimiento tumoral, sustentando la clásica hipótesis de Virchow del origen del cáncer en sitios de inflamación crónica, la cual incitaría a carcinogénesis por múltiples factores. Estudios previos en este laboratorio evidenciaron en un modelo de prostatitis bacteriana agudo con E. coli, profundos cambios estromales semejantes al "estroma reactivo", con predominio de miofibroblasto, que se genera en el cáncer. En correlación, existe abundante evidencia obtenida en modelos experimentales animales confirmando que el microambiente estromal en el cual se desarrollan los tumores epiteliales influencia profundamente la progresión tumoral. El rol protagónico del estroma del huésped en el crecimiento neoplásico, también se ha demostrado inoculando la misma línea tumoral en diferentes tejidos y analizando su comportamiento en comparación con su implantación en el sitio anatómico original del tumor (implante ortotópico); otro factor clave en la repuesta del huésped al tumor está dado por el infiltrado de células inmunes que puede favorecer o limitar el crecimiento tumoral de acuerdo al perfil de citoquinas que secreten. Teniendo en cuenta estos antecedentes, este proyecto tiene como Objetivo General estudiar la influencia de la infección bacteriana crónica en la inducción y evolución del cáncer prostático. Para ello trabajaremos in vivo con dos formas de formas de Tumores Prostáticos, un Tumor Inducido por combinación del carcinógeno N-methyl-N-nitrosourea (MNU) y testosterona; el segundo mediante Transplante Ortotópico de células tumorales prostáticas MAT-LU. En ambos modelos se inducirá previamente una prostatitis bacteriana, a fin de estudiar los efectos de la prostatitis en la inducción del tumor en el primer modelo, y en la implantación de las células tumorales en el segundo. También se inducirá prostatitis después de establecido el tumor por ambos procedimientos, a fin de determinar si la prostatitis bacteriana modula la progresión neoplásica. Finalmente, proponemos un modelo in vitro que permita estudiar la interacción tumor/estroma separado de la influencia del sistema inmune. A tal fin se utilizarán co-cultivos combinando células tumorales con estromales modificadas de diferente modo. La Inducción de Tumores Prostáticos se realizará en ratas de la cepa Wistar adultas, en las cuales se inducirán lesiones displásicas y neoplásicas siguiendo protocolos de carcinogénesis prostática por MNU, para lo cual es necesario el tratamiento previo con acetato de ciprosterona y propionato de testosterona, seguido por administración crónica de testosterona. Los estudios con Transplante Ortotópico de células tumorales se realizarán en ratas Copenhagen. La influencia de la infección bacteriana en el desarrollo tumoral será investigada inyectando E. coli intraprostáticamente: Se realizará Análisis Macroscópico, de Parámetros Morfológicos de las lesiones tumorales, grado de malignidad, extensión e invasión de las lesiones de acuerdo a consensos internacionales, y Bioquímicos mediante análisis de la expresión, por IHQ y WB, de fosfatasa ácida, citoqueratina 8, Prostatic Binding Protein, PTEN (gen supresor tumoral) y el receptor de Andrógenos, todos parámetros de actividad y de transformación celular. También se evaluará apoptosis por TUNEL y proliferación celular. Los cambios del compartimiento estromal en respuesta al implante tumoral y la influencia de la inflamación bacteriana se evaluarán mediante análisis morfológico e inmunocitoquímico, caracterizando el fenotipo de las poblaciones celulares con a-actina, vimentina, calponina y tenascina. Se espera que los resultados aporten evidencias acerca de las interacciones bidireccionales entre células neoplásicas prostáticas y su entorno estromal, que en un futuro puedan servir como base para establecr estrategias para prevenir y/o modificar el crecimiento neoplásico.

Regulación de la función de macrófagos por Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii y su participación en la generación de la inmunidad adaptativa antifúngica. Regulation of macrophage function by Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii and their role in the antifungal adaptative immunity.

La criptococosis es causada por la inhalación de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans o Cryptococcus gattii. Representa una de las tres infecciones graves por oportunistas en pacientes con SIDA y existe aproximadamente un 6 por ciento de incidencia de criptococosis clínica en pacientes con transplante de órganos sólidos. Estas dos especies difieren la fisiopatogenia durante la infección. El factor de virulencia principal de Cryptococcus sp. es la presencia del polisacárido capsular, glucuronoxilomanano (GXM), de alto peso molecular, que es continuamente secretado por las levaduras. Los macrófagos son células centrales en la respuesta innata al hongo, los cuales deben ser activados por linfocitos T helper 1 para un eficiente control de la infección. Sin embargo, estas células también son suceptibles al parasitismo intracelular, permitiendo la infección persistente y la diseminación a sitios extrapulmonares. Este proyecto propone investigar la capacidad de levaduras de C. neoformans, C. gattii y de los polisacáridos capsulares para modular la respuesta proinflamatoria de los macrófagos. Queremos estudiar si el tratamiento de macrófagos con levaduras o polisacárido puede inducir perfiles supresores de la respuesta protectiva T helper 1, tales como linfocitos T helper 2 o T reguladores, favoreciendo la sobrevida intracelular del hongo. Además, pensamos que C. neoformans o C. gattii podrían inducir un activación diferencial de macrófagos lo que condicionaría la respuesta adaptativa, lo que podría explicar las diferencias en la fisiopatogenia de estas dos especies. Procedimientos experimentales -Microorganismos y obtención de GXM: se trabajará con C. neoformans variedad grubii, cepa ATCC 62067 y C. gattii serotipo B, cepa NIH112B. Se obtendrán polisacáridos capsulares (GXM) de C. neoformans y C. gattii por precipitación con etanol y y acomplejamiento selectivo con CTAB. - Obtención de macrófagos murinos y cultivos celulares: se obtendrán macrófagos por lavados peritoneales y/o alveolares de ratones BALB/c. Los macrófagos se cultivarán por 24 h en ausencia o presencia de levaduras muertas o vivas (sin opsonizar u opsonizadas) de C. neoformans o C. gattii o en presencia de GXM purificado. -Objetivo 1. Estudio de la modulación de las propiedades proinflamatorias de Mac: en sobrenadantes de los cultivos se medirán las citoquinas por ELISA de captura y en lisados celulares, la expresión de las enzimas (iNOS, arginasa, IDO) por western blot. Se analizará por citometría de flujo la expresión de MCHII y moléculas CD80, CD86, CD40, CTLA-4. -Objetivo 2. Estudios in vitro de la capacidad de macrófagos tratados con levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg: los macrófagos preincubados con GXM o levaduras, se incubarán con linfocitos autólogos estimulados con anti-CD3. Se medirá la proliferación celular y el perfil de citoquinas por citomtría de flujo. Células T CD4+ CD25- serán purificadas de suspenciones esplénicas de ratones normales. Luego las células serán incubadas con macrófagos (sin tratar o tratados con levaduras o GXM) y estimulados con anti-CD3. Se analizará la proliferación celular con CFSE y expresión de CD4, CD25 y Foxp3 . - Objetivo 3. Estudios in vivo de la capacidad de levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg . Rol de los macrófagos in vivo: Los ratones serán inyectados con 100000 levaduras o con 200 µg de GXM puro vía endovenosa y luego de 7, 14, 30 y 40 días se evaluarán las poblaciones celulares de bazo, por citometría de flujo usando marcaciones simultáneas para CD4, CD8, CD25, Foxp3 y citoquinas intracelulares. Para investigar la participación in vivo de los macrófagos, se depletaran estas células inyectando los animales con PBS-liposomas o clodronato (DMDP)-liposomas por vía endovenosa o inhalatoria (200- 300 µl por ratón). Luego de 24 h, los animales se infectarán con levaduras o inocularán con GXM y se evaluarán los perfiles de células T esplénicos o de nódulos linfaticos.