Hepatitis C (HCV) crónica en Córdoba: impacto de la coinfección HIV / HCV, predicción del grado de fibrosis/cirrosis por un método no invasivo

Hasta el momento no existen datos epidemiológico – moleculares publicados acerca de la coinfección HCV/HIV y su impacto en la región central de Argentina. Este proyecto tiene como objetivos estudiar la prevalencia de infección activa y la distribución de genotipos de HCV en individuos infectados con HIV y evaluar su impacto en la terapia antiretroviral (HAART). Y por otra parte, implementar un método no invasivo, simple y de mayor adhesión, basado en análisis bioquímicos, para predecir grados de fibrosis y cirrosis en individuos infectados con HCV. Dicho método podrá ser transferido a otros laboratorios públicos y privados en un futuro cercano. Se estudiarán (bajo consentimiento informado) muestras de suero de individuos coinfectados HIV/HCV y monoinfectados con HCV. Se realizará el screening de anticuerpos contra HCV (anti-HCV), la confirmación de la infección (RNA HCV) y el diagnóstico suplementario (genotipificación, carga viral y biopsia). Además, se realizarán análisis bioquímicos y se completarán fichas clínico-epidemiológicos. Este proyecto intenta aportar información de la situación de HCV a los programas sanitarios para reforzar el sistema de vigilancia, mejorar el diagnóstico clínico e impulsar a programas de control, prevención y tratamiento para atenuar la diseminación de HCV en nuestro medio.

Interacciones medicamentosas de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y fibrosis renal: rol de la endotelina-1 como biomarcador

Esta propuesta está centralizada en la prevención y detección temprana de daño en el órgano blanco y monitoreo terapéutico para así disminuir las complicaciones derivadas de la hipertensión. Los sistemas internacionales de salud han llegado a disminuir costos de 25-45% aplicando un sistema de prevención eficaz de enfermedad renal crónica. Los pacientes mayores de 65 años tienen una alta tasa de polimedicación asociado a una alta prevalencia de hipertensión arterial. Gran porcentaje de ellos esta tratado con inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (iECA). Determinar el grado de compromiso en pacientes diagnosticados o no con hipertensión, es fundamental a la hora de comenzar un programa de prevención y monitoreo. Aumentos en la actividad de la ECA se asocia a daño renal, pero son relativamente escasos los datos que analizan el daño renal en relación con los niveles fibrosis renal, variable que hasta ahora solo podía ser observada mediante biopsias. Un 80% de pacientes polimedicados hipertensos desarrollan enfermedad renal crónica, aun teniendo controlada su presión arterial. Actualmente en nuestro conocimiento no hay estudios relacionados con las interacciones medicamentosas de los iECA y el daño en órgano blanco; menos aún con el aumento en la fibrosis renal. Basándonos en ello, se estima que las interacciones medicamentosas de los iECA elevan la concentración de Endotelina-1 urinaria, siendo este un marcador de fibrosis renal. La hipótesis de esta propuesta se basa en que las interacciones medicamentosas de los iECA estimulan la fibrosis renal en pacientes polimedicados hipertensos adultos mayores. Los objetivos de esta propuesta son: 1) Relevar pacientes con interacciones medicamentosas de los iECA y evaluar las interacciones medicamentosas más frecuentes en la población abordada, 2) Evaluar el cumplimiento terapéutico de los pacientes con diagnóstico confirmado de hipertensión arterial. 3) Evaluar el daño de órgano blanco renal en modelos animales de hipertensión (ratas espontáneamente hipertensas). Los resultados de esta propuesta contribuirán al afianzamiento de nuevos biomarcadores de daño renal, proveniente de datos de pacientes polimedicados que, generalmente, desarrollan enfermedad renal crónica con el paso del tiempo.

Mecanismo de interacción, calcio dependiente, entre Calcineurina y PERK, involucrado en el Estrés de Retículo Endoplásmico. Ca2+ -dependent mechanism of interaction between Calcineurin and PERK involved in Endoplasmic Reticulum Stress.

El Estrés de Retículo Endoplásmico (RE) es inducido por la acumulación de proteínas sin plegar en el lumen de la organela. Esto se puede observar en diversas situaciones fisio-patológicas como durante una infección viral o en proceso isquémico. Además, contribuye a la base molecular de numerosas enfermedades ya sea índole metabólico (Fibrosis quística o Diabetes Miellitus) o neurodegenerativas como mal de Alzheimer o Parkinson (Mutat Res, 2005, 569). Para restablecer la homeostasis en la organela se activa una señal de transducción (UPR), cuya respuesta inmediata es la atenuación de la síntesis de proteína debido a la fosforilación de subunidad alpha del factor eucariótico de iniciación de translación (eIF2α) vía PERK. Esta es una proteína de membrana de RE que detecta estrés. Bajo condiciones normales, PERK está inactiva debido a la asociación de su dominio luminar con la chaperona BIP (Nat Cell Biol, 2000, 2: 326). Frente a una situación de estrés, la chaperona se disocia causando desinhibición. Recientemente, (Plos One 5: e11925) se observó, bajo condiciones de estrés, un aumento de Ca2+ citosólico y un rápido incremento de la expresión de calcineurina (CN), una fosfatasa citosólica dependiente de calcio, heterodimérica formada por una subunidad catalítica (CN-A) y una regulatoria (CN-B). Además, CN interacciona, sin intermediarios, con el dominio citosólico de PERK favoreciendo su trans-autofosforilación. Resultados preliminares indican que, astrocitos CNAβ-/- exhibieron, en condiciones basales, un mayor número de células muertas y de niveles de eIF2α fosforilado que los astrocitos CNAα-/-. Hipótesis: CNAβ/B interacciona con PERK cuando el Ca2+ citosólico esta incrementado luego de haberse inducido Estrés de RE, lo cual promueve dimerización y auto-fosforilación de la quinasa, acentuándose así la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteínas. Esta activación citosólica de PERK colaboraría con la ya descrita, desinhibición luminal llevada cabo por BIP. Cuando el Ca2+ citosólico retorna a los niveles basales, PERK fosforila a CN, reduciendo su afinidad de unión y disociándose el complejo CN/PERK. Objetivo general: Definir las condiciones por las cuales CN interacciona con PERK y regula la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteína. Objetivos específicos: I-Estudiar la diferencia de afinidades y dependencia de Ca2+, de las dos isoformas de CN (α y β) en su asociación con PERK. Además verificar la posible participación de la subunidad B de CN en esta interacción. II-Determinar si la auto-fosforilación de PERK es diferencialmente regulada por las dos isoformas de CN. III-Discernir la relación del estado de fosforilación de CN con su unión a PERK. IV-Determinar efectos fisiológicos de la interacción de CN-PERK durante la respuesta de Estrés de RE. Para llevar a cabo este proyecto se realizarán experimentos de biología molecular, interacción proteína-proteína, ensayos de fosforilación in vitro y un perfil de polisoma con astrocitos CNAβ-/- , CNA-/- y astrocitos controles. Se espera encontrar una mayor afinidad de unión a PERK de la isoforma β de CN y en condiciones donde la concentración de Ca2+ sea del orden micromolar e imite niveles del ión durante un estrés. Con respecto al estado de fosforilación de CN, debido a los resultados preliminares, donde solo se la encontró fosforilada en condiciones basales, se piensa que CN podría interactuar con mayor afinidad con PERK cuando CN se encuentre desfosforilada. Por último, se espera encontrar un aumento de eIF2α fosforilado y una acentuación de la atenuación de la síntesis de proteína como consecuencia de la mayor activación de PERK por su asociación con la isoforma β de CN en astrocitos donde el Estrés de RE se indujo por privación de oxigeno y glucosa. Estos experimentos permitirán avanzar en el estudio de una nueva función citoprotectora de CN recientemente descrita por nuestro grupo de trabajo y sus implicancias en un modelo de isquemia. The accumulation of unfolded proteins into the Endoplasmic Reticulum (ER) activates a signal transduction cascade called Unfolding Protein Response (UPR), which attempts to restore homeostasis in the organelle. (PKR)-like-ER kinase (PERK) is an early stress response transmembrane protein that is generally inactive due to its association with the chaperone BIP. During ER stress, BIP is tritrated by the unfolded protein, leading PERK activation and phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha (eIF2alpha), which attenuates protein síntesis. If ER damage is too great and homeostasis is not restored within a certain period of time, an apoptotic response is elicited. We recently demonstrated a cytosolic Ca2+ increase in Xenopus oocytes after induce ER stress. Moreover, calcineurin A/B, a an heterotrimeric Ca2+ dependent phosphatases (CN-A/B), associates with PERK increasing its auto-phosphorylation and significantly enhancing cell viability. Preliminary results suggest that, CN-Aβ-/- knockout astrocytes exhibit a significant higher eIF2α phosphorylated level compared to CN-Aα-/- astrocytes. Our working hypothesis establishes that: CN binds to PERK when cytosolic Ca2+ is initially increased by ER stress, promoting dimerization and autophosphorylation, which leads to phosphorylation of elF2α and subsequently attenuation of protein translation. When cytosolic Ca2+ returns to resting levels, PERK phosphorylates CN, reducing its binding affinity so that the CN/PERK complex dissociates. The goal of this project is to determine the conditions by which CN binding to PERK attenuates protein translation during the ER stress response and subsequently, to determine how the interaction of CN with PERK is terminated when stress is removed. To perform this project is planed to do molecular biology experiments, pull down assays, in vitro phosphorylations and assess overall mRNA translation efficiency doing a polisome profile.