Mecanismo de interacción, calcio dependiente, entre Calcineurina y PERK, involucrado en el Estrés de Retículo Endoplásmico. Ca2+ -dependent mechanism of interaction between Calcineurin and PERK involved in Endoplasmic Reticulum Stress.

El Estrés de Retículo Endoplásmico (RE) es inducido por la acumulación de proteínas sin plegar en el lumen de la organela. Esto se puede observar en diversas situaciones fisio-patológicas como durante una infección viral o en proceso isquémico. Además, contribuye a la base molecular de numerosas enfermedades ya sea índole metabólico (Fibrosis quística o Diabetes Miellitus) o neurodegenerativas como mal de Alzheimer o Parkinson (Mutat Res, 2005, 569). Para restablecer la homeostasis en la organela se activa una señal de transducción (UPR), cuya respuesta inmediata es la atenuación de la síntesis de proteína debido a la fosforilación de subunidad alpha del factor eucariótico de iniciación de translación (eIF2α) vía PERK. Esta es una proteína de membrana de RE que detecta estrés. Bajo condiciones normales, PERK está inactiva debido a la asociación de su dominio luminar con la chaperona BIP (Nat Cell Biol, 2000, 2: 326). Frente a una situación de estrés, la chaperona se disocia causando desinhibición. Recientemente, (Plos One 5: e11925) se observó, bajo condiciones de estrés, un aumento de Ca2+ citosólico y un rápido incremento de la expresión de calcineurina (CN), una fosfatasa citosólica dependiente de calcio, heterodimérica formada por una subunidad catalítica (CN-A) y una regulatoria (CN-B). Además, CN interacciona, sin intermediarios, con el dominio citosólico de PERK favoreciendo su trans-autofosforilación. Resultados preliminares indican que, astrocitos CNAβ-/- exhibieron, en condiciones basales, un mayor número de células muertas y de niveles de eIF2α fosforilado que los astrocitos CNAα-/-. Hipótesis: CNAβ/B interacciona con PERK cuando el Ca2+ citosólico esta incrementado luego de haberse inducido Estrés de RE, lo cual promueve dimerización y auto-fosforilación de la quinasa, acentuándose así la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteínas. Esta activación citosólica de PERK colaboraría con la ya descrita, desinhibición luminal llevada cabo por BIP. Cuando el Ca2+ citosólico retorna a los niveles basales, PERK fosforila a CN, reduciendo su afinidad de unión y disociándose el complejo CN/PERK. Objetivo general: Definir las condiciones por las cuales CN interacciona con PERK y regula la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteína. Objetivos específicos: I-Estudiar la diferencia de afinidades y dependencia de Ca2+, de las dos isoformas de CN (α y β) en su asociación con PERK. Además verificar la posible participación de la subunidad B de CN en esta interacción. II-Determinar si la auto-fosforilación de PERK es diferencialmente regulada por las dos isoformas de CN. III-Discernir la relación del estado de fosforilación de CN con su unión a PERK. IV-Determinar efectos fisiológicos de la interacción de CN-PERK durante la respuesta de Estrés de RE. Para llevar a cabo este proyecto se realizarán experimentos de biología molecular, interacción proteína-proteína, ensayos de fosforilación in vitro y un perfil de polisoma con astrocitos CNAβ-/- , CNA-/- y astrocitos controles. Se espera encontrar una mayor afinidad de unión a PERK de la isoforma β de CN y en condiciones donde la concentración de Ca2+ sea del orden micromolar e imite niveles del ión durante un estrés. Con respecto al estado de fosforilación de CN, debido a los resultados preliminares, donde solo se la encontró fosforilada en condiciones basales, se piensa que CN podría interactuar con mayor afinidad con PERK cuando CN se encuentre desfosforilada. Por último, se espera encontrar un aumento de eIF2α fosforilado y una acentuación de la atenuación de la síntesis de proteína como consecuencia de la mayor activación de PERK por su asociación con la isoforma β de CN en astrocitos donde el Estrés de RE se indujo por privación de oxigeno y glucosa. Estos experimentos permitirán avanzar en el estudio de una nueva función citoprotectora de CN recientemente descrita por nuestro grupo de trabajo y sus implicancias en un modelo de isquemia. The accumulation of unfolded proteins into the Endoplasmic Reticulum (ER) activates a signal transduction cascade called Unfolding Protein Response (UPR), which attempts to restore homeostasis in the organelle. (PKR)-like-ER kinase (PERK) is an early stress response transmembrane protein that is generally inactive due to its association with the chaperone BIP. During ER stress, BIP is tritrated by the unfolded protein, leading PERK activation and phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha (eIF2alpha), which attenuates protein síntesis. If ER damage is too great and homeostasis is not restored within a certain period of time, an apoptotic response is elicited. We recently demonstrated a cytosolic Ca2+ increase in Xenopus oocytes after induce ER stress. Moreover, calcineurin A/B, a an heterotrimeric Ca2+ dependent phosphatases (CN-A/B), associates with PERK increasing its auto-phosphorylation and significantly enhancing cell viability. Preliminary results suggest that, CN-Aβ-/- knockout astrocytes exhibit a significant higher eIF2α phosphorylated level compared to CN-Aα-/- astrocytes. Our working hypothesis establishes that: CN binds to PERK when cytosolic Ca2+ is initially increased by ER stress, promoting dimerization and autophosphorylation, which leads to phosphorylation of elF2α and subsequently attenuation of protein translation. When cytosolic Ca2+ returns to resting levels, PERK phosphorylates CN, reducing its binding affinity so that the CN/PERK complex dissociates. The goal of this project is to determine the conditions by which CN binding to PERK attenuates protein translation during the ER stress response and subsequently, to determine how the interaction of CN with PERK is terminated when stress is removed. To perform this project is planed to do molecular biology experiments, pull down assays, in vitro phosphorylations and assess overall mRNA translation efficiency doing a polisome profile.

Construcción de un Test de Conocimiento General. Development of a General Knowledge Test

Entre los factores que contribuyen a predecir el rendimiento académico se pueden destacar aquellos que reflejan capacidades cognitivas (inteligencia, por ejemplo), y aquellas diferencias individuales consideradas como no-cognitivas (rasgos de personalidad, por ejemplo). En los últimos años, también se considera al Conocimiento General (CG) como un criterio para el éxito académico (ver Ackerman, 1997), ya que se ha evidenciado que el conocimiento previo ayuda en la adquisición de nuevo conocimiento (Hambrick & Engle, 2001). Uno de los objetivos de la psicología educacional consiste en identificar las principales variables que explican el rendimiento académico, como también proponer modelos teóricos que expliquen las relaciones existentes entre estas variables. El modelo teórico PPIK (Inteligencia-como-Proceso, Personalidad, Intereses e Inteligencia-como-Conocimiento) propuesto por Ackerman (1996) propone que el conocimiento y las destrezas adquiridas en un dominio en particular son el resultado de la dedicación de recursos cognitivos que una persona realiza durante un prolongado período de tiempo. Este modelo propone que los rasgos de personalidad, intereses individuales/vocacionales y aspectos motivacionales están integrados como rasgos complejos que determinan la dirección y la intensidad de la dedicación de recursos cognitivos sobre el aprendizaje que realiza una persona (Ackerman, 2003). En nuestro medio (Córdoba, Argentina), un grupo de investigadores ha desarrollado una serie de recursos técnicos necesarios para la evaluación de algunos de los constructos propuesto por este modelo. Sin embargo, por el momento no contamos con una medida de Conocimiento General. Por lo tanto, en el presente proyecto se propone la construcción de un instrumento para medir Conocimiento General (CG), indispensable para poder contar con una herramienta que permita establecer parámetros sobre el nivel de conocimiento de la población universitaria y para en próximos trabajos poner a prueba los postulados de la teoría PPIK (Ackerman, 1996). Between the factors that contribute to predict the academic achievement, may be featured those who reflect cognitive capacities (i.g. intelligence) and those who reflect individual differences that are considered like non-cognitive (i.g. personality traits). In the last years, also the General Knowledge has been considered like a criterion for the academic successfully (see Ackerman, 1997), since it has been shown that the previous knowledge helps in the acquisition of the new knowledge (Hambrick & Engle, 2001). An interesting theoretical model that has proposed an explanation for the academic achievement, is the PPIK (intelligence like a process, interests and inteligence like knowledge) proposed by Ackerman (1996), who argues that knowledge and the acquired skills in a particular domain are the result of the dedication of cognitive resources that a person perform during a long period of time. This model proposes that personality traits, individuals interests and motivational aspects are integrated as complex traits that determine the direction and the intensity of the dedication of cognitive resources on the learning that a person make (Ackerman, 2003). In our context, (Córdoba, Argentina), a group of researcher has developed a series of necessary technical resoures for the assesment of some of the theoretical constructs proposed by this model. However, by the moment, we do not have an instrument for evaluate the General Knowledge. Therefore, this project aims the construction of an instrument to asess General Knowledge, essential to set parameters on the knowledge level of the university population and for in next works test the PPIK theory postulates.