Estudio citogenético en rumiantes de importancia económica mediante el cultivo de linfocitos

La citogenética dispone de métodos que permiten evaluar, directa o indirectamente, anomalías cromosómicas causantes de importantes mejoras o pérdidas ganaderas en varios países que las han estudiado. Por ello, diferentes países de zootecnia avanzada dan importancia creciente a los estudios citogenéticos, planteándose en algunos la necesidad o exigencia de realizar estudios del cariotipo en reproductores que se usan en centros de inseminación artificial, como de sus ascendientes o descendientes en test de progenie o bancos de embriones. Existen numerosas anomalías cromosómicas causantes de trastornos del desarrollo, neoplasias e infertilidad en el bovino, ovino, caprino, porcino, equino y otros animales domésticos. Las pérdidas estudiadas son cuantiosas y algunas de estas anomalías se refieren a menor tasa de fertilidad y cantidad de terneros. Debido a que la evaluación citogenética involucra etapas que consumen mucho tiempo, se desarrollan procedimientos semiautomáticos que reducen los tiempos significativamente, sin afectar la seguridad y consistencia. Por tal motivo, debido a que se dispone de un analizador digital de imágenes con el software base y software para el análisis del cariotipo, se capacitarán recursos humanos, que permitan luego agilizar la obtención de resultados. En Argentina, los estudios citogenéticos en el bovino son recientes, por lo que es necesario continuarlos y extenderlos a otros animales de importancia económica, afectiva o en vías de extinción, con el objeto de protegerlos de alteraciones hereditarias que resulten negativas. En este sentido, se han dispuesto algunas acciones que propenden a reglamentar la necesidad del cariotipado en reproductores dadores de semen y los que se emplean en la transferencia de embriones. No conocemos de estudios citogenéticos a nivel nacional en camélidos andinos, ovinos, caprinos, equinos, caninos y/o aves (...) 1. Objetivos Generales: - Desarrollar recursos humanos y técnicos para realizar estudios cariotípicos (cultivo y técnicas de bandeo) en animales de importancia económica. - Capacitación en análisis digital de imágenes para realizar el análisis cromosómico. - Realizar estudios cariotípicos en reproductores con problemas de fertilidad. - Realizar estudios cariotípicos en bovinos con diagnóstico serológico de leucosis. - Realizar estudios de prevalencia de anomalías cromosómicas en toros usados en inseminación artificial. - Ofrecer servicios de registros cariotípicos para reproductores empleados en inseminación artificial, transplante de embriones, animales con tumores o trastornos del desarrollo.

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción. In vitro Production of Transgenic Bovine Embryos using Intracitoplasmic Sperm Injection (ICSI) and Restriction Enzymes

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas. Genetic engineering and reprogrammed organisms represent the new biotechnological frontiers which will make possible to generate animals with precise genetic modifications for agricultural and biomedical applications. Current methods used to generate genetically modified large animals, lay behind those used in laboratory animals, specially the mouse. Therefore, we seek to develop and optimize protocols to produce transgenic bovine embryos through the use of a non-viral vector. The strategy involves the simultaneous presence inside the cell of a restriction enzyme (I-SceI) and a transgene (carrying cassettes for a fluorescent protein -ZsGreen1- and neomycin phosphotransferase) flanked by restriction sites for the endonuclease. We plan to develop an alternative approach to generate transgenic bovine embryos by coinjecting the transgene flanked by I-SceI restriction sites plus the enzyme I-SceI along with the spermatozoon during the technique known as intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Embryos will be cultured in vitro and inspected daily with a fluorescence microscope to characterize transgene expression. Embryos that reach the blastocyst stage and express the transgene will be surgically transfer to the uterus of a synchronized ewe. After 7 days, the embryos will be flushed out the ovine uterus and transported to the laboratory to determine the number of integration sites and transgene copies by Southern blot. We anticipate that results from this research will set the stage for the development of efficient strategies to achieve precise genetic modifications in large domestic animals for future biotechnological applications.

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas.