Evaluación del efecto del láser y magnetoterapia en miopatía experimental valorando biomarcadores de estrés oxidativo, histomorfometría y actividad enzimática mitocondrial

El láser de baja y media energía y la magnetoterapia son utilizados en desórdenes osteomioarticulares por sus efectos analgésico, antiinflamatorio y trófico, entre los más destacados. Sin embargo, son insuficientes las investigaciones sobre su mecanismo de acción y antecedentes científicos que avalen sus efectos. Es por ello, que la determinación de acontecimientos celulares y moleculares que ocurren durante la interacción de estos tipos de energía con el sistema muscular, sería relevante para el conocimiento y optimización de tales terapias en las ciencias biomédicas. En las miopatías inflamatorias idiopáticas, se encuentra afectada la estructura, morfología y bioquímica del tejido muscular. La energía que éste requiere para el normal funcionamiento es generada en la mitocondria. Esta organela también es la responsable de la generación de especies oxidantes provocando estrés oxidativo y el inicio de los procesos de apoptosis. Por lo antes dicho, consideramos que la determinación de los biomarcadores inflamatorios asociados a estrés oxidativo, realizando el análisis histomorfométrico ultraestructural y valorando la actividad de los complejos enzimáticos mitocondriales, permitiría una evaluación de la acción terapéutica del láser y la magnetoterapia en un modelo experimental de miopatía. Para ello se propone evaluar el efecto de la magnetoterapia y del láser de baja energía (He-Ne y As.Ga) en miopatía experimental determinando indicadores inflamatorios asociados a estrés oxidativo, análisis histomorfométrico y valoración de la actividad enzimática mitocondrial. Específicamente: -Determinar indicadores inflamatorios y de estrés oxidativo: Oxido Nítrico, Grupos carbonilos, L-citrulina, Fibrinógeno, Superóxido dismutasa, Glutation peroxidasa y Catalasa por espectrofotometría. -Identificar los cambios anatomopatológicos del músculo esquelético por microscopía óptica (MO): cuantificación del infiltrado inflamatorio; MO de alta resolución (MOAR) y por microscopía electrónica: histomorfometría de la ultraestructura miofibrilar y mitocondrial. -Valorar las actividades enzimáticas de la citrato sintasa y de los complejos: I (NADH-ubiquinona reductasa), II (succinato-ubiquinona-reductasa) III (ubiquinona-citocromo c-reductasa) y IV (citocromo c-oxidasa); en mitocondrias de tejido muscular por espectrofotometría. -Evaluar la actividad apoptótica en las fibras musculares de los diferentes grupos por ténica de T.U.N.E.L. Las mediciones mitocondriales (por ME) y de infiltrado inflamatorio (por MO) se realizarán en un total de 5 fotos de aumentos similares en forma aleatoria por grupo estudiado (n=10). Los cambios estructurales observados se analizarán en el programa Axiovision 4.8, para cuantificar el área total ocupada, número total y grado de alteración de las mitocondrias y el porcentaje de infiltrado inflamatorio determinando el grado de inflamación. Los resultados de los datos cuantitativos se analizarán aplicando ANAVA (test de Fisher para comparaciones múltiples); y para los datos categóricos se utilizará Chi cuadrado (test de Pearson), estableciéndose un nivel de significación de p < 0.05 para todos los casos. Importancia del Proyecto: La salud y el bienestar del hombre son los logros perseguidos por las ciencias de la salud. La obtención de terapias curativas o paliativas con un mínimo de efectos colaterales para el enfermo se incluye en estos logros. Por esto y todo lo anteriormente expuesto es que consideramos de gran importancia poder esclarecer desde las ciencias básicas los efectos celulares y moleculares en modelos experimentales la acción de la terapia con láser y magnetoterapia para una aplicación clínica con base científica en todas las áreas de las Ciencias Médicas.

Aspectos bioquímicos y celulares de la reproducción de los vectores de la enfermedad de Chagas: regulación e importancia fisiológica.

En la hipótesis de trabajo del presente proyecto se considera la importancia del metabolismo de lípidos y proteínas en los insectos hematófagos, en particular en los vectores de la enfermedad de Chagas, para afrontar exitosamente la demanda energética de la reproducción. Las hembras de estas especies pueden ingerir una comida de sangre abundante en lípidos y proteínas, los que son modificados en el intestino para su utilización y posterior almacenamiento en estructuras organizadas en el tejido ovárico, sustentando así el rápido crecimiento de los ovocitos. Estos aspectos resultan críticos para el ciclo de vida del insecto y para el mantenimiento de la cadena epidemiológica de la enfermedad. En estas especies, recientemente hemos caracterizado a nivel bioquímico y celular la interacción entre lipoproteínas y tejidos [Fruttero y col., Insect Biochem. Mol. Biol. 39: 322-331 (2009); Fruttero y col. Biocel 33 (3): 260 (2009)] y las fases del ciclo reproductivo [Aguirre y col., J. Insect Physiol. 54: 393-402 (2008)]. No obstante, los factores que participan en su regulación son aún escasamente conocidos. En este contexto, el estudio propone emplear dos especies de triatominos con el objeto de: (1) caracterizar los factores involucrados en la formación y regulación de reservas nutricionales en los ovocitos; (2) analizar los eventos que participan en la regresión del tejido ovárico: atresia folicular y mecanismos de muerte celular. (3) evaluar el impacto de productos naturales (ureasas vegetales y péptidos derivados) en el desarrollo del tejido ovárico. Para la ejecución de los objetivos se llevarán a cabo ensayos in vivo e in vitro con trazadores fluorescentes, fraccionamiento subcelular, estudios de expresión de proteínas (mRNA y proteína), estudios histo-morfológicos, ultraestructurales e inmunocitoquímicos, microscopía láser confocalizada, ensayos de actividad enzimática, ELISA, western-blot, electroforesis bidimensional, espectrometria de masas en tándem, etc. También se evaluarán los mecanismos de muerte celular (apoptosis/autofagia) mediante microscopía electrónica, detección de apoptosis in situ (TUNEL), inmunofluorescencia, etc. Los resultados obtenidos permitirán un mejor conocimiento sobre la fisiología y bioquímica de estos vectores, los que resultan indispensables en el diseño de nuevas estrategias para su control. Debido a la carencia de un tratamiento específico para la enfermedad y a la falta de métodos preventivos (vacuna), el control del vector es una de las vías más importantes para reducir la incidencia de la enfermedad. Actualmente, la situación socio-económica que sufren amplios núcleos de nuestra población propicia condiciones de vida que facilitan la reproducción de los vectores y la transmisión vectorial del parásito. El estudio permitirá además explorar aspectos bioquímicos y celulares básicos, generando conocimientos que podrían ser extensivos a otros insectos de importancia económica en la ganadería y/o agricultura.

Espectroscopía de emisión de rayos x. Aplicación a la caracterización de materiales.

La idea principal del proyecto abarca el estudio de parámetros y fenómenos físicos. Los avances logrados se aplicarán al desarrollo de software y metodologías para cuantificación de materiales mediante microanálisis con sonda de electrones y microscopía electrónica de barrido. El microanálisis no es una técnica absoluta, sino que requiere de estándares de referencia, para obviar el uso de ciertos parámetros geométricos y atómicos difíciles de conocer con una precisión adecuada. Para contar con un método sin estándares debe abordarse la determinación de parámetros atómicos e instrumentales, que es uno de los aspectos que se desea encarar en este proyecto. Por otro lado, también se pretende incluir los parámetros estudiados en un software de cuantificación desarrollado por integrantes del proyecto. Otro de los propósitos del plan de trabajo es estudiar la potencialidad de la resolución espacial de una microsonda de electrones con el fin de desarrollar una metodología para caracterizar interfases, bordes de granos e inclusiones, con resolución submicrométrica, ya que los métodos tradicionales de cuantificación se restringen al caso de muestras planas y homogéneas dentro del volumen de interacción, pero la caracterización de inhomogeneidades a nivel micrométrico no ha sido desarrollada todavía, salvo algunas excepciones.

Mejoramiento de insecticidas de banda verde por incorporación en ciclodextrinas, co-cristales y niosomas

La aplicación de agroquímicos para proteger granos y vegetales es una parte importante de los procedimientos corrientes en el manejo integrado de plagas ya que 20- 40% de la producción mundial potencial se pierde cada año por plagas, malezas y enfermedades. La necesidad de modificar la naturaleza química de los pesticidas para hacerlos más amigables con el ambiente llevó al desarrollo de un gran número de pesticidas clasificados como de banda verde, menos tóxicos, menos contaminantes y más selectivos que los tradicionales. Entre ellos se incluyen los insecticidas reguladores de crecimiento (IGR) seleccionados para este proyecto. Sin embargo, como compuestos orgánicos, tienen baja solubilidad acuosa lo que usualmente requiere de la formulación para su uso agrícola con otros vehículos como aceites o solventes que son contaminantes. Las regulaciones internacionales son cada vez mas estrictas en cuanto al uso de pesticidas por lo que es muy importante el desarrollo de tecnologías apropiadas para la utilización de compuestos de banda verde en los cultivos de la región. Nuestra propuesta se enfoca en generar formas alternativas (‘paquetes moleculares’ multi-componentes) de estos IGR que tengan mayor solubilidad acuosa que los compuestos no tratados, posibilitando su formulación en medio acuoso ambientalmente amigable. Las rutas elegidas comprenden la inclusión de los IGR dentro de sistemas nanoestructurados como la cavidad de ciclodextrinas (CDs), su incorporación en co-cristales y el encapsulado en niosomas. Las CDs son moléculas cíclicas biodegradables y no-tóxicas, formadas por unidades de glucosa. Los niosomas son vesículas microscópicas con un corazón acuoso encerrado por una membrana de surfactantes no iónicos que forman estructuras bicapa cerradas. Los co-cristales resultan de la interacción entre un compuesto y un co-formador con una estructura complementaria con el primero que permite la formación de enlaces puente H entre ambos. Los tres procesos involucran interacciones ‘suaves’ entre el IGR y la otra especie, dejando intacta la integridad biológica del insecticida. Se espera así obtener una diversidad de sistemas para diferentes opciones de formulación. Se eligieron IGR derivados de benzoilfenilurea (BPU), dibenzoilhidracinas (DBH) e isopreno, clasificados como clase U (unlikely to present acute hazard in normal use) por la OMS que tienen relativamente baja toxicidad para humanos y otros mamíferos, alta selectividad para insectos y muy poca solubilidad acuosa. Luego del aislamiento de las nuevas construcciones moleculares, se establecerán los efectos sobre las propiedades fisicoquímicas de los IGR. Se efectuarán estudios en estado sólido y en solución. Los complejos sólidos en CDs preparados por distintos métodos se examinarán por FTIR y RMN en estado sólido, microscopía FTIR, difracción de Rayos X de polvo y monocristales, TGA, DSC y microscopía ‘hot stage’. Por RMN, dicroísmo circular inducido y titulación calorimétrica isotérmica se estudiarán aspectos termodinámicos y estructurales de la inclusión en solución. El efecto sobre la solubilidad y estabilidad química de los IGR se investigará midiendo, respectivamente, las velocidades de disolución de los complejos y las velocidades de degradación de los IGR en presencia y ausencia de CDs. Para la obtención de co-cristales se usarán moléculas co-formadoras ‘GRAS’ (generally regarded as safe) elegidas en base a la complementariedad de sus grupos funcionales capaces de formar enlaces de H con los de los IGR. Las medidas de los puntos de fusión y velocidad de disolución son parámetros importantes para determinar su eventual utilidad. Los niosomas se prepararán en presencia de los IGR por distintas técnicas usando los surfactantes no iónicos y no tóxicos Tween 20 y 80, Span 20 y 80 y Brij-35. Se analizarán el tamaño y morfología de los agregados por microscopía de transmisión electrónica y se determinará la estabilidad en el tiempo de los niosomas por UV-vis.