ESTUDIOS CITOGENÉTICOS EN CACTACEAE Y SOLANACEAE: MAPEO FÍSICO DE SECUENCIAS DE ADN REPETITIVO POR HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE (FISH)

En este proyecto propone aplicar técnicas de citogenética molecular analizando principalmente patrones de distribución de secuencias de ADN repetitivo, en especies sudamericanas de Cactaceae (Notocacteae, Trichocereeae, Hylocereae y Rhipsalideae) y Solanaceae (Cestroideae, Nicotianoideae, Petunioideae, Schizanthoideae, Schwenckioideae y Solanoideae). Las tres familias presentan importantes centros de diversificación en Sudamérica y un enorme interés desde el punto de vista económico, biológico y ecológico. Para lo cual serán utilizadas técnicas de coloración convencional y de hibridación in situ fluorescente (FISH) en especies de diferentes tribus y subfamilias. Estos estudios cariotípicos, en especial la distribución de secuencias de ADN repetitivo, permitirán explorar nuevos aspectos de la diferenciación cromosómica, aportando marcadores cromosómicos que podrían ser utilizados en estudios de evolución cariotípica y ser importantes para robustecer la comprensión de relaciones sistemáticas y filogenéticas. Los estudios citogenéticos en estas familias son esenciales para contribuir al conocimiento de su origen, diversificación y evolución, como así también para colaborar con el diseño de estrategias de mejoramiento genético de especies cultivadas y conservación de especies amenazadas.

Prevalencia relativa de Microdeleción 22q11.2 en una muestra de pacientes asistidos en el Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de Córdoba. Importancia de la detección precoz para establecer medidas de prevención y rehabilitación

Anomalías conotruncales – Hibridación in situ Fluorescente La microdeleción cromosómica 22q11.2, es la más frecuente en humanos. Se estima una prevalencia de 1 cada 4000 recién nacidos, presentando una variabilidad clínica que abarca: Síndrome de DiGeorge, Velo-Cardio-Facial, anomalías cardíacas conotruncales aisladas, entre otras, hasta la descripción de pacientes con microdeleción subclínica. Actualmente todos estos pacientes son denominados como Síndromes de Microdeleción 22q. Hipótesis de trabajo: existe en nuestro medio un subdiagnóstico atribuible al desconocimiento de la gran variabilidad fenotípica, sospechándose sólo los casos clásicos. Objetivos: -Estimar la prevalencia relativa de microdeleción 22q11.2 en una muestra de pacientes asistidos en el Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de Córdoba. -Correlacionar los datos clínicos con la citogenética clásica y molecular. -Diagnosticar las formas heredables para realizar asesoramiento familiar.

Cronobiología y su impacto en la terapéutica de caninos

La cronobiología es la rama de la ciencia derivada de la biología que investiga los mecanismos de la estructura temporal biológica. Un ritmo biológico es una variación temporal que ocurre regularmente en los procesos o funciones orgánicas de los seres vivos, con intervalos más o menos precisos entre sucesivas repeticiones, uno de los más conocidos es el ritmo circadiano. La cronofarmacología estudia la variación de los efectos de los fármacos en función del tiempo biológico, y busca integrar los aspectos cronobiológicos en el diseño de regímenes posológicos. El objetivo del presente proyecto es el estudio de parámetros fisiológicos normales en diferentes horarios del día, su relación con aspectos farmacocinéticos y farmacodinámicos de diferentes drogas depresoras del sistema nervioso en caninos, y sus posibles influencias por ritmos biológicos, para aumentar la efectividad de las drogas disminuyendo su toxicidad. Se trabajará con un esquema de crossing over en cada grupo de individuos seleccionados, administrando el fármaco a 2 ó 4 horarios diferentes (variaciones circadianas) según las drogas estudiadas, durante los meses de otoño y primavera. La determinación y cuantificación se realizará por la técnica de Inmunoensayo de Polarización Fluorescente (FPIA). En caso de ser necesario, los datos obtenidos serán tratados con programas específicos de ajuste farmacocinético (PKCALC), para obtener los parámetros cinéticos correspondientes. Para determinar las variaciones cronobiológicas se compararán estadísticamente los resultados farmacológicos obtenidos en los diferentes horarios programados, mediante tests pareados para detectar posibles variaciones influenciadas por la hora y/o tiempo de administración.

Prevalencia relativa de Microdeleción 22q11.2 en pacientes pediátricos y adultos asistidos en la Ciudad de Córdoba

La microdeleción intersticial 22q11.2, es la más frecuentes en humanos; se estima una prevalencia de 1/ 4000 recién nacidos, presentando una marcada variabilidad Clínica que abarca Síndrome de Di George, Velocardiofacial, Cayler, cardiopatías conotruncales aisladas, formas autosómicas dominantes de Opitz BBB y un subtipo de esquizofrenia caracterizada por dismorfias y disfunción cognitiva. Hipótesis: en nuestro medio existe un subdiagnóstico de esta patología especialmente adultos con problemas de comportamiento tardíos, probablemente atribuible al desconocimiento de la gran variabilidad fenotípica. Objetivos: estimar la prevalencia relativa de microdeleción 22q11.2 en nuestro medio. Correlacionar los hallazgos clínicos con la citogenética de alta resolución y molecular. Diagnosticar las formas heredables. Material y Método: se evaluaran prospectivamente los pacientes derivados por los servicios de cardiología, cardiocirugía, inmunología, psiquiatría que reúnan criterios clínicos de sospecha de microdeleción 22q11.2 desde octubre de 2009 hasta septiembre de 2011. Se excluirán pacientes con cardiopatías conotruncales, insuficiencias velopalatinas, inmunodeficiencias y esquizofrenia encuadradas en otros diagnósticos. Se solicitará consentimiento informado. Se realizará evaluación clínica en el consultorio de Genética Médica. Se efectuará citogenética con técnicas de alta resolución e hibridación in situ fluorescente (FISH). A los progenitores de los pacientes positivos se les realizará igual evaluación clínica y de laboratorio. Resultados: se espera realizar diagnóstico de certeza de microdeleción 22q11.2 en el 90% de los Síndromes de Di George/Velocardiofacial, 20% de las anomalías conotruncales aisladas, 7 al 10% de las formas heredables, 2% de pacientes con esquizofrenia; en este último grupo; el porcentaje puede ascender a un 6%, según datos publicados, si se eligen subpoblaciones de pacientes con retraso del desarrollo, dismorfias, antecedentes de trastornos en el aprendizaje y el lenguaje, voz nasal, historia de hipocalcemia y de aplasia o hipoplasia tímica. Importancia del proyecto: realizar diagnóstico precoz de esta entidad en pacientes pediátricos, adultos con esquizofrenia y formas heredables, lo que permitirá realizar un abordaje interdisciplinario integral de estos individuos y su familia, contribuyendo a un uso racional de los recursos disponibles para optimizar la calidad del servicio de salud. Pertinencia: en relación al tema “innovación y desarrollo tecnológico en medicamentos y tecnología médica” se realizarán técnicas de citogenética molecular (hibridación in situ fluorescente-FISH), indicadas para realizar diagnóstico de certeza de la enfermedad, tanto en las formas esporádicas como en las heredables

Análisis no convencional por fluorescencia de Rayos X (Estudio de superficies y análisis con resolución espacial)

[El presente proyecto] aborda el tema de espectroscopía por fluorescencia de Rayos X (FRX) no convencional, en particular el estudio de superficies por reflexión total y el análisis con resolución espacial (mapping) mediante capilares para Rayos X. Objetivos generales y específicos Este proyecto consta de objetivos teóricos y experimentales. Se planea construir y caracterizar sistemas de condensación de haces de fotones por medio de capilares de Rayos X. (...) Se concluirá con el desarrollo e implementación del sistema para análisis superficial por perfiles de profundidad. Este sistema, cuyo estado de avance se encuentra ya muy adelantado, comenzará a utilizarse para realizar estudios de capas superficiales, perfiles superficiales de densidad y concentración, etc. El citado dispositivo es un sistema mixto mecánico-elástico que permite efectuar variaciones angulares con precisión de centésimas de milirradián. Con el objeto de llevar a cabo estudios de perfiles de profundidad cuantitativos se desarrollarán métodos y algoritmos para análisis de datos basados en las estructuras teóricas del análisis por EXAFS (Extended X Ray Analysis Fine Structure). Este enfoque surge de la similitud entre los espectros obtenidos en una experiencia de EXAFS y los correspondientes a una medición de "Depth Profiling" y tiene su fundamentación sobre la base de las ecuaciones elementales para intensidad fluorescente en condiciones de onda estacionaria. Ya que las técnicas por FRX no convencionales están invariablemente asociadas a fuentes de irradiación no convencionales, otro de los objetivos importantes de este proyecto es llevar a cabo experiencias en laboratorios sincrotrón. (...)

Determinación analítica de compuestos orgánicos en complejos huésped-receptor

Los complejos Huésped-Receptor son supermoléculas en las cuales se producen interacciones específicas que modifican las propiedades físicas y químicas de los sustratos incluidos. Dentro de los receptores más comunes para compuestos orgánicos se encuentran los éteres corona y sus derivados, las ciclodextrinas y los metaciclofanos. Estudios fotofísicos y fotoquímicos con estos receptores indican que los sustratos orgánicos incluidos experimentan un notable incremento de sus propiedades luminiscentes. Un gran número de compuestos orgánicos que son de interés en varios campos como el biológico, farmacéutico y agroquímico presentan estructuras derivados en núcleos como el indólico, naftalénico o benzofuránico que tienen propiedades fluorescentes. Se considera interesante desarrollar métodos analíticos sensibles para la determinación de compuestos orgánicos que presentan estructuras derivadas de estos núcleos, haciendo para ello uso del incremento en la propiedad fluorescente de los mismos en presencia de agentes acomplejantes. Se determinarán las condiciones más favorables para la detección por fluorescencia en presencia de los receptores que muestren la mayor interacción con cantidades límites de compuestos como serotonina (hormona), metatonina (fármaco), carbaryl y carbofuran (pesticidas), cuya determinación por otros métodos (espectofotometría UV-Visible, cromatografía líquida de alta presión) es engorrosa, poco sensible o requiere reacciones de derivatización para su mejor cuantificación. (...) La importancia potencial de este proyecto es el desarrollo de técnicas analíticas sensibles para la determinación de compuestos orgánicos que tienen importancia fundamental en la detección de algunas enfermedades o trastornos funcionales, como el caso de las hormonas o de determinados psicofármacos como alcaloides, y en la toxicidad de ciertos alimentos vegetales que pueden contener residuos de herbicidas o sus metabolitos en frutos y semillas. (...)

Sistemática filogenética y biología reproductiva con énfasis en solanum y capsicum (solanaceae). Systematics, phylogeny and reproductive biology with emphasis in solanum and capsicum (solanaceae).

Muchas respuestas a preguntas básicas sobre relaciones evolutivas, ubicación sistemática y evolución de caracteres morfológicos y ecológicos pueden ser obtenidas a través de las reconstrucciones filogenéticas. Sobre este contexto se pretende encarar en este proyecto estudios de filogenia molecular, revisiones sistemáticas, biología reproductiva y citogenética en Solanáceas americanas. Se intentará resolver la delimitación específica de Solanum sect. Solanum y Geminata, y Capsicum, y establecer relaciones filogenéticas en estos grupos. Se harán revisiones analizándose caracteres vegetativos y reproductivos críticos para evaluar su variabilidad y definir su valor taxonómico; para los estudios moleculares se utilizarán los marcadores ndhF, trnT-L, trnL-F y waxy. En base a los resultados se propondrán agrupamientos y relaciones de parentesco. Además, se hará un estudio cariosistemático para caracterizar y circunscribir especies en Solanum y miembros de la tribu Physaleae, y hasta variedades y/o cultivares en Capsicum, mediante técnicas clásicas y de bandeos de fluorescencia y AgNOR e hibridación in situ fluorescente (FISH). A nivel reproductivo, se estudiará la ecofisiología en las estructuras masculinas y su incidencia en la fructificación en Capscium baccatum. El desarrollo de esta temática comprende experiencias in vivo (a campo y en laboratorio) así como estudios histológicos y químicos.Se espera avanzar en la resolución de algunos problemas: 1) la complicada delimitación de especies de los taxones en estudio; 2) las relaciones filogenéticas en algunos de ellos; 3) la falta de conocimiento de la organización genómica; 4) el origen de las especies cultivadas de Capsicum. En cuanto a la biología reproductiva, para C. baccatum se pretende avanzar en el conocimiento de variables de relevancia en la reproducción, en especial los efectos del ambiente.

Prevalencia relativa de microdeleción 22Q11.2 en pacientes pediátricos y adultos asistidos en la ciudad de Córdoba.

La microdeleción intersticial 22q11.2, es la más frecuentes en humanos; se estima una prevalencia de 1/ 4000 recién nacidos, presentando una marcada variabilidad Clínica que abarca Síndrome de Di George, Velocardiofacial, Cayler, cardiopatías conotruncales aisladas, formas autosómicas dominantes de Opitz BBB y un subtipo de esquizofrenia caracterizada por dismorfias y disfunción cognitiva. Hipótesis: en nuestro medio existe un subdiagnóstico de esta patología especialmente adultos con problemas de comportamiento tardíos, probablemente atribuible al desconocimiento de la gran variabilidad fenotípica. Objetivos: estimar la prevalencia relativa de microdeleción 22q11.2 en nuestro medio. Correlacionar los hallazgos clínicos con la citogenética de alta resolución y molecular. Diagnosticar las formas heredables. Material y Método: se evaluarán prospectivamente los pacientes derivados por los servicios de cardiología, cardiocirugía, inmunología, psiquiatría que reúnan criterios clínicos de sospecha de microdeleción 22q11.2 desde octubre de 2009 hasta septiembre de 2011. Se excluirán pacientes con cardiopatías conotruncales, insuficiencias velopalatinas, inmunodeficiencias y esquizofrenia encuadradas en otros diagnósticos. Se solicitará consentimiento informado. Se realizará evaluación clínica en el consultorio de Genética Médica. Se efectuará citogenética con técnicas de alta resolución e hibridación in situ fluorescente (FISH). A los progenitores de los pacientes positivos se les realizará igual evaluación clínica y de laboratorio. Resultados: se espera realizar diagnóstico de certeza de microdeleción 22q11.2 en el 90% de los Síndromes de Di George/Velocardiofacial, 20% de las anomalías conotruncales aisladas, 7 al 10% de las formas heredables, 2% de pacientes con esquizofrenia; en este último grupo; el porcentaje puede ascender a un 6%, según datos publicados, si se eligen subpoblaciones de pacientes con retraso del desarrollo, dismorfias, antecedentes de trastornos en el aprendizaje y el lenguaje, voz nasal, historia de hipocalcemia y de aplasia o hipoplasia tímica. Importancia del proyecto: realizar diagnóstico precoz de esta entidad en pacientes pediátricos, adultos con esquizofrenia y formas heredables, lo que permitirá realizar un abordaje interdisciplinario integral de estos individuos y su familia, contribuyendo a un uso racional de los recursos disponibles para optimizar la calidad del servicio de salud.Pertinencia: en relación al tema "innovación y desarrollo tecnológico en medicamentos y tecnología médica" se realizarán técnicas de citogenética molecular (hibridación in situ fluorescente-FISH), indicadas para realizar diagnóstico de certeza de la enfermedad, tanto en las formas esporádicas como en las heredables.

Cronobiología y su impacto en la terapéutica de caninos.

La cronobiología es la rama de la ciencia derivada de la biología que investiga los mecanismos de la estructura temporal biológica. Un ritmo biológico es una variación temporal que ocurre regularmente en los procesos o funciones orgánicas de los seres vivos, con intervalos más o menos precisos entre sucesivas repeticiones, uno de los más conocidos es el ritmo circadiano. La cronofarmacología estudia la variación de los efectos de los fármacos en función del tiempo biológico y busca integrar los aspectos cronobiológicos en el diseño de regímenes posológicos. El objetivo del presente proyecto es el estudio de parámetros fisiológicos normales en diferentes horarios del día, su relación con aspectos farmacocinéticos y farmacodinámicos de diferentes drogas depresoras del sistema nervioso en caninos, y sus posibles influencias por ritmos biológicos, para aumentar la efectividad de las drogas disminuyendo su toxicidad. Se trabajará con un esquema de crossing over en cada grupo de individuos seleccionados, administrando el fármaco a 2 ó 4 horarios diferentes (variaciones circadianas) según las drogas estudiadas, durante los meses de otoño y primavera. La determinación y cuantificación se realizará por la técnica de Inmunoensayo de Polarización Fluorescente (FPIA). En caso de ser necesario, los datos obtenidos serán tratados con programas específicos de ajuste farmacocinético (PKCALC), para obtener los parámetros cinéticos correspondientes. Para determinar las variaciones cronobiológicas se compararán estadísticamente los resultados farmacológicos obtenidos en los diferentes horarios programados, mediante tests pareados para detectar posibles variaciones influenciadas por la hora y/o tiempo de administración.

Citogenética y filogenia en especies silvestres y cultivadas de ajíes (Capsicum - Solanaceae)

En Capsicum se han realizado análisis citogenéticos mediante diversas técnicas que han contribuido a caracterizar un número importante de especies y a establecer relaciones entre las mismas. No obstante los progresos realizados a la fecha en este aspecto, todavía quedan grupos con límites aún discutidos y otros poco conocidos. A través de este proyecto se propone ampliar los estudios de citogenética y biología molecular en el género con diversos objetivos. En forma general, acrecentar el conocimiento de la organización genómica, las relaciones filogenéticas y la evolución cromosómica en Capsicum. Respecto a los taxones cultivados, se intentará esclarecer si los tres miembros del complejo C. annuum (C. annuum, C. chinense, C. frutescens) constituyen especies diferentes o se trata de taxones co-específicos. En cuanto a las especies silvestres, se obtendrá información citogenética de C. geminifolium, C. lanceolatum y C. lycianthoides, a fin de caracterizarlas y determinar su validez taxonómica. Así mismo, considerando estas especies y otras menos conocidas como C. coccineum, C. cornutum, C. dimorphum y C. mirabile, se intentará definir relaciones interespecíficas y clados infragenéricos. Este estudio comprenderá aspectos tales como análisis cromosómico con métodos de bandeos (de fluorescencia y AgNOR), mapeo de secuencias del DNA (genes ribosómicos) mediante hibridación in situ fluorescente (FISH), análisis estructural de la heterocromatina, evaluación de la variabilidad intra - e interespecífica usando marcadores moleculares “microsatélites”, análisis filogenético utilizando marcadores nucleares y cloroplastidiales. La información obtenida puede, además, ser una herramienta básica aplicable al mejoramiento genético de las especies cultivadas (variedades de ajíes y pimientos comerciales) y a la conservación de los recursos genéticos silvestres.

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción. In vitro Production of Transgenic Bovine Embryos using Intracitoplasmic Sperm Injection (ICSI) and Restriction Enzymes

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas. Genetic engineering and reprogrammed organisms represent the new biotechnological frontiers which will make possible to generate animals with precise genetic modifications for agricultural and biomedical applications. Current methods used to generate genetically modified large animals, lay behind those used in laboratory animals, specially the mouse. Therefore, we seek to develop and optimize protocols to produce transgenic bovine embryos through the use of a non-viral vector. The strategy involves the simultaneous presence inside the cell of a restriction enzyme (I-SceI) and a transgene (carrying cassettes for a fluorescent protein -ZsGreen1- and neomycin phosphotransferase) flanked by restriction sites for the endonuclease. We plan to develop an alternative approach to generate transgenic bovine embryos by coinjecting the transgene flanked by I-SceI restriction sites plus the enzyme I-SceI along with the spermatozoon during the technique known as intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Embryos will be cultured in vitro and inspected daily with a fluorescence microscope to characterize transgene expression. Embryos that reach the blastocyst stage and express the transgene will be surgically transfer to the uterus of a synchronized ewe. After 7 days, the embryos will be flushed out the ovine uterus and transported to the laboratory to determine the number of integration sites and transgene copies by Southern blot. We anticipate that results from this research will set the stage for the development of efficient strategies to achieve precise genetic modifications in large domestic animals for future biotechnological applications.

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas.